地黃飲子腦脊液藥物化學(xué)研究

郭司群（呼倫貝爾市食品藥品檢驗所　呼倫貝爾　021008）

地黃飲子腦脊液藥物化學(xué)研究

郭司群（呼倫貝爾市食品藥品檢驗所呼倫貝爾021008）

目的：闡明經(jīng)方地黃飲子在腦脊液中的化學(xué)成分分布情況。方法：利用UPLC-ESI-MS和GC-MS技術(shù)分析地黃飲子的體外樣品及灌胃給予地黃飲子復(fù)方或單味藥后的家兔腦脊液樣品，對比分析各樣品結(jié)果，確認灌胃給予地黃飲子后的家兔腦脊液中移行成分、代謝產(chǎn)物及其生藥來源。結(jié)果：灌胃給予地黃飲子后家兔腦脊液中發(fā)現(xiàn)5個移行成分，其中1個為地黃飲子所含的原型成分，4個為新產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。結(jié)論：對地黃飲子的腦脊液中移行成分及代謝產(chǎn)物進行了確認，對其進行深入研究，有助于闡明地黃飲子治療中樞退行性病變的有效成分及作用機理。

地黃飲子 腦脊液 UPLC-MS GC-MS

中藥腦脊液藥物化學(xué)是中藥血清藥物化學(xué)的一個延伸，以血清藥物化學(xué)技術(shù)和方法為基礎(chǔ)，綜合應(yīng)用多種現(xiàn)代技術(shù)，分析鑒定給藥后腦脊液中的移行成分，最終達到闡明治療中樞性病變中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的目的。地黃飲子出自《黃帝素問宣明論方》，主治瘖痱證，癥見舌強不能言，足廢不能用，口干不欲飲，苔黃膩，脈沉、細弱［1］。臨床研究表明，地黃飲子對中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性退行性變性疾病——老年性癡呆的療效確切［2］，但基礎(chǔ)研究薄弱。為了闡明地黃飲子到底是以何種成分、何種形式發(fā)揮治療作用以及作用機理如何，本文作了以下研究。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑：UPLC-MS聯(lián)用系統(tǒng)：WatersAC-QUITY UPLC超高效液相色譜儀，Waters Quattro PremierxE三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，MassLynx 4.1質(zhì)譜工作站；美國安捷倫公司6890N-5975B氣質(zhì)聯(lián)用儀；AMDIS軟件、Chemstation及NIST 05a質(zhì)譜庫（美國安捷倫公司）Shim-pack xR-ODSⅡ2.0mm*75mm色譜柱（SHIMADZU）；TGL-16G-C高速冷凍離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；H66MC型超聲震蕩儀（昆山市超聲儀器有限公司）；SK-1型快速混勻器（金壇市醫(yī)療儀器廠）；地黃飲子組方藥材熟地黃、山茱萸、五味子、巴戟天、麥冬、薄荷、石菖蒲、石斛、遠志、附子、肉蓯蓉、茯苓、肉桂、大棗、姜（購于哈爾濱三棵樹藥材市場，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)教授謝寧鑒定為正品）；五味子醇甲（Schizandrol A，中國生物制品藥品檢定所，批號：110857-200709）；乙腈、甲醇、甲酸（色譜純，美國迪馬公司）；甲酸胺（分析純，天津科密歐試劑有限公司）；正己烷（分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；吡啶（分析級，天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；Chlorotrimethylsilane TMCS（98%Acros Organics USA）；MSTFA（Apollo Scientificl Limited UK）；新西蘭白兔，體重1.8～2.2kg，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SCxK（黑）2007003。

1.2實驗過程

1.2.1樣品制備

1.2.1.1地黃飲子復(fù)方及單味藥材體外樣品制備：取地黃飲子粉末1g（各藥材粉末66mg，混勻）或單味藥材粉末66mg，分別置于25mL容量瓶中，加甲醇20mL左右，浸泡20min，超聲30min，放冷，再加甲醇定容，取上清液3000r/min離心15min，過0.45μm濾膜，取續(xù)濾液作為UPLC-ESI-MS分析樣品溶液。取地黃飲子粉末1g（各藥材粉末66mg，混勻）或單味藥材粉末66mg，分別置10mL容量瓶中，加入正己烷8mL左右，浸泡20min，超聲處理30min，放冷，再加正己烷定容，取上清液3000r/min離心15min，過0.45μm濾膜，取續(xù)濾液作為GC-MS分析樣品溶液。

1.2.1.2腦脊液樣品制備

①腦脊液采集：取家兔，灌胃前禁食12h，自由飲水，連續(xù)灌胃3d（空白組灌胃給予蒸餾水，其他組灌胃給予相應(yīng)藥液），1次/d，50mL/次，末次灌胃120min后取家兔腦脊液，離心10min （4℃，3000r/min），取上清液備用。

②腦脊液樣品制備：取腦脊液1mL，加入5mL甲醇，渦旋3min，超聲10min，離心10min（4℃，3000r/min），取出上清液，35℃下氮氣吹干，殘渣用1mL甲醇復(fù)溶，超聲1min，渦旋震蕩30s后，離心10min（4℃，10000r/min），取上層清液供UPLC-ESI-MS分析。

取腦脊液100μL，加入500μL甲醇，渦旋3min，超聲10min，離心10min（4℃，10000r/min），取出上清液，35℃下氮氣吹干，加15mg/mL甲氧胺吡啶溶液100μL，混勻，70℃下反應(yīng)1h。加衍生化試劑（MSTFA：TMCS=100∶1，v/v）100μL，密封，70℃下反應(yīng)1h，加正己烷200μL，混勻后離心10min（4℃，5000r/ min），取上層清液供GC-MS分析。

1.2.2分析條件

1.2.2.1UPLC-ESI-MS分析條件：色譜柱：Acquity UPLC BEH C181.7μm，2.1mm×50mm；流動相：A：乙腈，B：0.1%甲酸+10mmol/L甲酸胺；梯度洗脫程序為乙腈的濃度梯度5.0%（0min），5.0%～50%（0～10min），50%～80%（10～15min），80%～95%（15～17min）；柱溫：30℃；流量：0.3mL/min；電噴霧接正離子模式；毛細管電壓：3.00kV；錐孔電壓：35.00V；離子源溫度：110℃；脫溶劑溫度：350℃；脫溶劑氣N2：600L/h；錐孔氣N2：50L/h。

1.2.2.2GC-MS分析條件：色譜柱：5HP-MS；載氣：氦氣；流速：1mL/min；進樣口溫度：240℃；分流進樣，分流比1∶20；輔助線溫度：280℃；進樣量：1μL；梯度升溫程序為80℃（0min），120℃（0～20min），180℃（20～32min），197℃（32～40.5min），280℃（40.5～54.3min）；后運行溫度280℃；后運行時間10min；離子源溫度：230℃；四級桿溫度：150℃；電離方式：EI；采集方式：全掃描；掃描質(zhì)量范圍：30～600mAu；溶劑延遲時間：4min。

2　結(jié)果與討論

2.1地黃飲子腦脊液中移行成分認定：比較地黃飲子復(fù)方腦脊液樣品和空白腦脊液樣品的UPLC-MS分析提取離子色譜圖，分析各色譜峰保留時間和分子離子峰數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)地黃飲子復(fù)方腦脊液樣品中出現(xiàn)4個移行成分，即保留時間為5.58min、分子量為417的成分1；保留時間為7.33min、分子量為431的成分2；保留時間為8.85min、分子量為415的成分3；保留時間為9.27min、分子量為401的成分4；在空白腦脊液樣品中沒有發(fā)現(xiàn)這4種成分（見圖-1）。比較地黃飲子復(fù)方腦脊液樣品和空白腦脊液樣品的GC-MS的總離子流圖，分析各色譜峰保留時間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)地黃飲子復(fù)方腦脊液樣品中出現(xiàn)1個移行成分，即保留時間為34.25min、分子量為452的成分5（見圖-2）。

2.2地黃飲子腦脊液中移行成分來源歸屬：比對分析地黃飲子復(fù)方、單味藥材體外樣品和腦脊液樣品，確認了地黃飲子腦脊液中移行成分的生藥來源歸屬。

以3號和5號成分為例，經(jīng)復(fù)方腦脊液樣品、五味子腦脊液樣品、五味子體外樣品和五味子醇甲對照品比對分析，發(fā)現(xiàn)3號成分來源于五味子，而且與五味子醇甲的保留時間、分子量相同，確定其為來源于五味子的五味子醇甲（見圖-3、圖-4）。

5號成分經(jīng)復(fù)方腦脊液樣品和遠志腦脊液樣品進行GCMS衍生化技術(shù)分析比對，發(fā)現(xiàn)復(fù)方腦脊液樣品中5號成分與遠志腦脊液樣品相同保留時間處成分，分子量相同，確定來源于遠志藥材（見圖-5、圖-6）。

2.3討論：本研究初步進行了地黃飲子的腦脊液藥物化學(xué)研究，共找到5個腦脊液中移行成分，其中1個為地黃飲子所含的原型成分（即來源于五味子的五味子醇甲），4個為新產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，分別由五味子、遠志、麥冬、巴戟天貢獻產(chǎn)生。分析發(fā)現(xiàn)五味子為地黃飲子入腦成分的主要來源藥材。地黃飲子具有滋腎陰、補腎陽、開竅化痰的功效，多用于腦血栓、腦血管意外、中風(fēng)、泛發(fā)性神經(jīng)皮炎、老年病等多種腦部疾病的治療，目前研究表明它對老年性癡呆有良好的療效［2］。腦部病變是指因中樞神經(jīng)纖維損傷進而造成腦神經(jīng)細胞衰老退化造成的慢性退行性疾病，包括腦實質(zhì)的軟化灶（腦梗塞，陳舊性的出血）、雙側(cè)腦白質(zhì)稀疏、腦萎縮以及以老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)為主要病理特征的進行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性疾病（老年性癡呆）［3］。五味子具有斂肺、滋腎、生津、收汗、澀精等功效，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有著重要的作用，包括抗衰老、益智、鎮(zhèn)靜、催眠，其中五味子醇甲具有神經(jīng)保護作用［4］。其他三味藥材遠志、麥冬、巴戟天對中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變有著一定的治療作用。遠志有安神益智、祛痰、消腫的功效，對神經(jīng)系統(tǒng)作用包括鎮(zhèn)靜、抗驚厥，促進體力和智力，抗癡呆和腦保護活性等［5］。麥冬具有養(yǎng)陰生津、潤肺清心的功效，有研究表明麥冬煎劑有鎮(zhèn)靜作用，亦能加強氯丙嗪的鎮(zhèn)靜作用，增強戊巴比妥鈉的催眠作用，拮抗咖啡因的興奮作用等［6］。巴戟天則有補腎陽、強筋骨、祛風(fēng)濕的功效，與地黃飲子滋腎陰、補腎陽功效吻合。

本實驗首次利用UPLC-ESI-MS和GC-MS兩種技術(shù)對地黃飲子腦脊液藥物化學(xué)進行研究。UPLC-MS技術(shù)能夠提供較為豐富且全面的信息，被廣泛應(yīng)用于中藥體內(nèi)代謝研究。本實驗首次將GC-MS衍生化技術(shù)應(yīng)用于腦脊液藥物化學(xué)研究，通過實驗結(jié)果可以看出，我們利用GC-MS衍生化技術(shù)對地黃飲子腦脊液進行分析，成功找到了1個腦脊液中移行成分，為UPLC-MS的分析結(jié)果提供了重要的補充，使地黃飲子腦脊液藥物化學(xué)的研究結(jié)果更加全面。

［1］張福珍，張春珍，李幽馥.地黃飲子在防治老年病中的地位與應(yīng)用［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，1994，23（2）：28-29.

［2］謝寧，柳琳，周妍妍，等.地黃飲子對老年性癡呆模型大鼠腦組織NO、NOS含量及行為學(xué)的影響［J］.中國中醫(yī)藥科技，2004，11 （2）：84-85.

［3］卓敏.疼痛的神經(jīng)生物學(xué)——理解大腦機制及神經(jīng)疾病治療的機理［J］.世界科技研究與發(fā)展，2000，11（7）：665-666.

［4］趙洪海，王曉蕾，張可興，等.五味子的現(xiàn)代藥理作用研究進展［J］.中醫(yī)藥信息，2010，27（4）：123-125.

［5］屠鵬飛，姜勇.中藥創(chuàng)新藥物的發(fā)現(xiàn)與研發(fā)［J］.中國天然藥物，2007，2：81-86.

［6］陳屏，徐東銘，雷軍.麥冬化學(xué)成分及藥理作用的研究現(xiàn)狀［J］.長春中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004，20（1）：35.

Identification and Analysis of Constituents Absorbed into Cerebrospinal Fluid after Oral Administration of Di Huang Yin Zi

Guo Siqun（Hulunbeier Institute for Food and Drug Control，Inner Mongolia，Hulunbeier 021008，China）

Objective:To identification and analyze the constituents absorbed into cerebrospinal fluid of Di Huang Yin Zi.Method:Two valid methods using Ultra Performance Liquid Chromatography coupled with electrospray ionization（ESI）Mass spectrometry and Gas chromatography-Mass spectrometry were established for the study of the absorbed components in rabbit cerebrospinal fluid after oral administration of Di Huang Yin Zi.Result:Five compounds including one original form compound and four metabolites were observed from a comprehensive analysis of the chromatography of Di Huang Yin Zi，controlled cerebrospinal fluid and dosed cerebrospinal fluid. Conclusion:This study developed a method for screening the bioactive constituents in cerebrospinal fluid after oral administration of Chinese herbal medicine and provided helpful chemical information for further pharmacology and active mechanism research on TCM.

Di Huang Yin Zi Cerebrospinal fluid UPLC-MS GC-MS

R285

B

1672-8351（2016）02-0132-03