羅偉東，姜自偉，李悅，黃楓，蔡群斌，唐宏宇，吳鑒濤廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東廣州510405

牽張應力下骨碎補總黃酮對成骨細胞增殖及相關蛋白含量的影響

羅偉東，姜自偉，李悅，黃楓，蔡群斌，唐宏宇，吳鑒濤
廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東廣州510405

目的：觀察骨碎補總黃酮對牽張應力下成骨細胞增殖及相關蛋白含量的影響。方法：對大鼠成骨樣細胞系ROS1728作體外培養(yǎng)，取3代對數(shù)生長期成骨細胞，采用Flexcell細胞牽張系統(tǒng)構建成骨細胞牽張體系，使用骨碎補總黃酮含藥血清進行干預24 h。應用MTT法繪制成骨細胞生長曲線；堿性磷酸酶染色法觀察成骨細胞內(nèi)堿性磷酸酶（ALP）含量及分布情況；采用堿性磷酸酶定量檢測方法測定各組成骨細胞內(nèi)ALP含量；采用ELISA法測定骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF β-1）的表達。結果：12 h及24 h骨碎補總黃酮各劑量組中成骨細胞數(shù)量及ALP、BMP-2、TGF β-1含量均明顯增加，與空白組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；同時，與骨碎補總黃酮低劑量組比較，骨碎補總黃酮中、高劑量組成骨細胞數(shù)目及ALP 和BMP-2的含量增高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；骨碎補總黃酮各劑量組中TGF β-1的含量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論：在牽張應力下，骨碎補總黃酮可明顯促進成骨細胞增殖及相關蛋白的合成。

牽張應力；骨碎補總黃酮；成骨細胞；動物實驗；大鼠

機械應力是骨組織正常生理狀態(tài)及修復重建過程中重要的刺激因素，其中，成骨細胞是主要的效應細胞之一［1］。研究表明，12％的牽張應力對成骨細胞增殖分化具有更好的促進作用［2～3］。在成骨細胞增殖分化及其調(diào)控基質(zhì)礦化的過程中堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 （bone morphogenetic protein-2，BMP-2）、轉(zhuǎn)化生長因子β-1（transforming growth factor β-1，TGFβ-1）發(fā)揮著重要作用［4～6］。因此，研究力學刺激下，成骨細胞增殖分化及其成骨效能的改變有利于深入了解骨組織重建機制，通過檢測牽張應力下ALP、BMP-2及TGFβ-1的表達，可有效評價成骨細胞增殖分化能力。

目前已有研究表明，骨碎補總黃酮能促進牽張成骨動物模型中牽張區(qū)的骨痂形成，提高局部ALP和BMP-2的含量，加快骨痂的礦化和增強生物力學性能［7］。因此，本實驗擬建立成骨細胞牽張體系，給予骨碎補總黃酮含藥血清進行干預，觀察成骨細胞分化和增殖的改變，同時檢測成骨細胞合成及分泌的ALP、BMP-2、TGFβ-1的含量，進一步探討牽張應力下骨碎補總黃酮對成骨細胞的作用機制，為補腎中藥在骨愈合領域的應用提供實驗基礎。

1 實驗材料和方法

1.1 藥物及主要試劑強骨膠囊（其成分為骨碎補總黃酮，北京岐黃制藥有限公司，國藥準字220030007），每粒膠囊含骨碎補總黃酮180 mg，以蒸餾水溶解配制成一定濃度（0.46 g/L）的骨碎補總黃酮混懸液。動物等效服藥量按體表面積計算，為0.22 g/（kg·d）。采用灌胃干預，干預濃度分別為：高濃度0.44 g/（kg·d）、中濃度0.22 g/（kg·d）、低濃度0.11 g/（kg·d）。10％水合氯醛（廣州中醫(yī)藥第一附屬醫(yī)院制備），RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（美國Gibco公司），0.25％胰蛋白酶（美國Gibco公司），MTT試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），ALP活性測定試劑盒（南京建成生物公司），大鼠BMP-2、TGFβ-1 ELISA試劑盒（上海西唐生物科技有限公司），PBS緩釋液（美國Gibco公司）。

1.2 實驗動物分組及含藥血清的制備SD大鼠20只，雄性，SPF級，體重（180±20）g，由南方醫(yī)科大學動物實驗中心提供，用于制備含藥血清。飼養(yǎng)環(huán)境：廣州中醫(yī)藥大學三元里校區(qū)實驗動物中心SPF級動物房。將12～14周齡SD雄性大鼠20只隨機分成4組：生理鹽水組、骨碎補總黃酮高、中、低各劑量組，每組5只。每天灌胃2次，間隔5 h，連續(xù)灌胃5天，最后1次灌胃2 h后，乙醚麻醉后采用腹主動脈取血，4℃，3000 r/min，離心15 min獲取血清，37℃水浴30 min，抽濾除菌，-20℃冰箱保存。

1.3 成骨細胞的培養(yǎng)傳代、鑒定、分組及干預大鼠成骨樣細胞系ROS1728由上海拜力生物技術有限公司提供。①成骨細胞體外培養(yǎng)及傳代：所用培養(yǎng)液為含1％谷氨酰胺、鏈霉素100 U/mL、青霉素100 U/mL、和10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液（Gibco，USA）。將購買的細胞加入消化液1 mL，37℃培養(yǎng)箱0.5 min，鏡下見細胞收縮變圓或少數(shù)脫落后，振蕩器低頻振蕩，移液器打入2.5 mL培養(yǎng)基，吹打3次，分裝于培養(yǎng)瓶，加入培養(yǎng)基，于37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)，每隔24 h進行換液，光鏡下觀察至細胞群融合后進行傳代。②成骨細胞形態(tài)學鑒定：細胞貼壁培養(yǎng)24 h后，隨機取2組細胞進行形態(tài)學觀察，將培養(yǎng)瓶置于熒光倒置顯微鏡下放大100倍后進行觀察。③成骨細胞分組：采用第三代對數(shù)生長期細胞，加入0.25％胰蛋白酶，細胞計數(shù)器計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為2×105/mL，取2 mL接種于6孔專用培養(yǎng)板，加入完全培養(yǎng)基，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)24 h。然后將各培養(yǎng)孔內(nèi)細胞隨機分為：空白血清組（空白組），骨碎補總黃酮低劑量組（低劑量組）、骨碎補總黃酮中劑量組（中劑量組）和骨碎補總黃酮高劑量組（高劑量組）。④干預措施：將6孔專用培養(yǎng)板置于Flexcell-5000T系統(tǒng)，對成骨細胞加載牽張應力，形變率設定為12％，牽張頻率為6 r/min，共牽張24 h。光鏡下觀察細胞貼壁后，根據(jù)分組情況在生理鹽水組中加入等量15％的空白血清培養(yǎng)基，在骨碎補總黃酮高、中、低劑量組中分別加入等量的不同濃度的骨碎補總黃酮含藥血清培養(yǎng)基。置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，同時以12％牽張形變率、0.5 Hz牽張頻率繼續(xù)加載牽張應力。

1.4 統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件包進行統(tǒng)計分析，實驗結果采用（±s）表示，組間差異的比較采用單因素方差分析，使用LSD法進行組間兩兩比較。

2 檢測指標

2.1 MTT法觀察成骨細胞增殖能力將5 mg MTT溶于1 mL 的PBS（PH 7.4）中，濾膜過濾，于4℃棕色瓶中保存。ROS1728細胞以每孔104個接種至彈性基底膜，加入培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，用PBS洗1次，每孔加10 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清，每孔加入1∶1的DMSO2和乙醇溶液共100 μL，震蕩，使結晶物充分溶解，在酶標儀上選擇490 nm波長測定每孔的光密度值（OD值），繪制細胞增殖曲線。

2.2 堿性磷酸酶染色成骨細胞涂片4％多聚甲醛固定5 min，自然晾干，蒸餾水潤洗30 s，滴加基質(zhì)液數(shù)滴覆蓋標本，37℃孵育15 min，甩掉多余染液，立即滴加顯色液A 5 min，水洗30 s，保持樣本濕潤，滴加顯色液B 30 s，水洗30 s，滴加復染劑復染30 s，水洗30 s，甩干，鏡檢。細胞質(zhì)中陽性反應呈現(xiàn)灰黑色顆?；驂K狀、條狀沉淀。

2.3 堿性磷酸酶定量測定于血清干預后12 h、24 h進行檢測，在酶標板上設定測定孔、空白孔和標準孔，各設三個復孔，取各組培養(yǎng)孔內(nèi)上清液，分別加入各孔內(nèi)，每孔30 μL；其中，于空白孔中加入雙蒸水30 μL，于標準孔內(nèi)加入0.02 mg/mL標準應用液30μL；各孔再以此加入50 μL基質(zhì)液以及50 μL緩沖液，移液槍吹打混勻，于37℃水浴15 min，然后加入顯色劑150 μL，搖床充分振蕩混勻。采用酶標儀于520 nm波長下檢測各孔吸光度值，根據(jù)說明書中的公式計算ALP含量。

2.4 BMP-2和TGF β-1含量測定胰蛋白酶消化獲取成骨細胞懸液，PBS稀釋，細胞濃度達到100萬/mL左右。-20℃反復凍融5次，3000 r/min，離心20 min，收集上清，-20℃保存?zhèn)溆?。采用ELISA試劑盒，按照說明書上的操作步驟分別測量BMP-2、TGFβ-1的含量。

3 結果

3.1 成骨細胞鑒定結果見圖1。細胞形態(tài)學鑒別培養(yǎng)24 h后，細胞多呈梭形、三角形或有2～3個突起，胞質(zhì)透亮、飽滿，符合成骨細胞形態(tài)學特征。

3.2 各組成骨細胞增殖分化能力的比較見表1和圖2。12 h及24 h ALP定量測定結果與MTT檢測結果顯示：與空白組比較，骨碎補總黃酮高、中、低劑量組ALP含量及成骨細胞數(shù)量明顯增多，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與低劑量組比較，骨碎補總黃酮中、高劑量組ALP含量和成骨細胞數(shù)量增加更明顯，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；骨碎補總黃酮中劑量組與骨碎補總黃酮高劑量組間ALP含量和成骨細胞數(shù)量的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

12 h及24 h ALP染色結果示：骨碎補總黃酮各劑量組中成骨細胞數(shù)量較空白組明顯增多；各組內(nèi)成骨細胞的細胞質(zhì)中均可見棕黃色ALP陽性顆粒，跟空白組比較，骨碎補總黃酮各劑量組中，ALP陽性顆粒顏色較深，同時ALP陽性顆粒分布密度均有顯著增多，說明骨碎補總黃酮各劑量組中ALP含量增多；在中藥各劑量組的比較中，中、高劑量組內(nèi)成骨細胞數(shù)量及ALP含量均明顯增多，而中、高劑量組無明顯差異。

圖1 第一代成骨細胞（100×）

圖2 各組ALP染色結果比較（100×）

表112 h、24 h各組成骨細胞ALP活性及MTT檢測結果比較（±s）

表112 h、24 h各組成骨細胞ALP活性及MTT檢測結果比較（±s）

與空白組比較，①P＜0.05；與低劑量組比較，②P＜0.05

組別空白組低劑量組中劑量組高劑量組n 6 6 6 6 ALP（U/L）M TT（OD值）12 h 3.77±0.82 9.95±1.73①14.44±2.13①②15.29±2.24①②24 h 5.97±1.14 11.76±2.05①19.29±3.05①②18.91±3.24①②12 h 1.31±0.28 3.35±0.49①6.25±0.78①②7.09±0.76①②24 h 2.63±0.37 5.68±0.54①8.55±0.62①②8.49±0.65①②

3.3 各組成骨細胞BMP-2、TGF β-1含量的比較見表2。牽張12 h及24 h，與空白組比較，骨碎補總黃酮高、中、低劑量組中BMP-2及TGFβ-1的含量明顯增多，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與低劑量組比較，骨髓補總黃酮高、中劑量組中BMP-2的含量明顯高于骨碎補總黃酮低劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；骨碎補總黃酮各劑量組中TGFβ-1的含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表212 h、24 h各組BMP-2和TGFβ-1含量比較（±s）

表212 h、24 h各組BMP-2和TGFβ-1含量比較（±s）

與空白組比較，①P＜0.05；與低劑量組比較，②P＜0.05

組別空白組低劑量組中劑量組高劑量組n 6 6 6 6 BM P-2（ng/mL）TGFβ-1（nmol/L）12 h 82.81±4.77 126.24±6.85①130.25±5.81①②135.65±6.93①②24 h 95.34±11.28 147.55±15.87①182.59±17.14①②195.63±19.22①②12 h 1.02±0.25 1.52±0.37①1.55±0.29①1.53±0.41①24 h 1.79±0.33 5.65±0.44①5.28±0.48①5.70±0.52①

4 討論

在正常生理活動過程中，隨著機械應力的作用，骨組織以骨單位中的骨吸收、骨形成為基礎進行骨重建［8］。在臨床中，應力的缺失或持續(xù)應力的作用可導致骨流失或骨組織的塑形改造，引起骨骼病理改變或促進骨組織修復愈合。研究發(fā)現(xiàn)，合理的機械力學刺激可以促進成骨細胞增殖分化，增加骨量［9］。在牽張應力下，骨組織發(fā)生形變，牽張應力在骨組織內(nèi)部傳導可引起骨基質(zhì)內(nèi)的成骨細胞發(fā)生牽張形變。離體細胞牽張力學實驗是目前國內(nèi)外研究的熱點，F(xiàn)lexcell細胞應力加載系統(tǒng)是目前公認的離體培養(yǎng)細胞的力學實驗方法［10～11］。李菲菲等［12］證實，利用Flexcell細胞牽張系統(tǒng)，12％的拉伸應變率是比較合適的牽張刺激，可促進成骨細胞增殖，同時增強成骨細胞礦化結節(jié)的形成。在體外建立成骨細胞牽張模型，能夠模擬牽張成骨中微觀的細胞生物學環(huán)境，對于研究牽張成骨的細胞生物應答具有重要意義。

骨碎補是補腎的代表藥物，在臨床常用于骨折筋傷、腎虛腰痛、跌撲閃挫的治療。已有實驗證實其在促進骨折愈合、調(diào)節(jié)骨代謝、提高骨量、改善損傷局部微循環(huán)方面，具有較強的藥理作用。在本研究中，構建了成骨細胞牽張體系，并采用骨碎補總黃酮含藥血清進行干預。經(jīng)過MTT檢測法發(fā)現(xiàn)牽拉12 h及24 h，骨碎補總黃酮可明顯促進細胞增殖，而骨碎補總黃酮中、高劑量可進一步促進成骨細胞增殖；同時，骨碎補總黃酮于牽拉12 h及24 h后可明顯提高ALP、BMP-2和TGFβ-1的含量。研究結果證實，在牽張應力下，骨碎補總黃酮可明顯促進成骨細胞合成及分泌ALP、BMP-2和TGFβ-1，促進成骨細胞分化、增殖，并可促進骨基質(zhì)的合成。但本研究仍有諸多不足之處：①本實驗采用離體成骨細胞構建成骨細胞牽張體系，不能完全反應體內(nèi)環(huán)境牽張應力下成骨細胞的變化；②針對骨碎補總黃酮在成骨細胞牽張體系的研究，關于骨髓補總黃酮的干預濃度、干預方式以及干預時間尚未有統(tǒng)一的標準。因此，在后續(xù)的相關研究中，需深入探索應力刺激與藥物作用的干預條件，有利于更好的結合兩者，并促進補腎法在骨愈合與骨代謝領域的應用。

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（責任編輯：馮天保，鄭鋒玲）

Effect of Total Flavonoids in Rhizoma Drynariae under Tensile Stress on Osteoblast Proliferation and Correlative Protein Content

LUO Weidong，JIANG Ziwei，LI Yue，HUANG Feng，CAI Qunbin，TANG Hongyu，WU Jiantao

Objective：To observe effect of total flavonoids in rhizoma drynariae under tensile stress on osteoblast proliferation and correlative protein content.Methods：Cultured rats'osteoblast-like cells lines ROS1728 in vitro.Get 3rd osteoblasts in the logarithmic phase and establish osteoblasts tensile system using Flexcell，intervene with total flavonoids in rhizoma drynariae drug serum for 24 h.Drew osteoblasts growth curve by method of MTT，and observed contents and distribution of alkaline phosphatase（ALP）in osteoblasts by alkaline phosphatase staining method，detected ALP contents of osteoblasts in every group by alkaline phosphatase quantitative test method，detected expression of bone morphogenetic protein-2（BMP-2）and transforming growth factor（TGFβ-1）by ELISA method.Results：The number of osteoblasts and content of ALP，BMP-2 and TGFβ-1in all dose groups of 12h and 24h total flavonoids in rhizoma drynariae were all increased，comparing with those in blank group，differences being significant（P＜0.05）.At the same time，comparing with low dose group of total flavonoids in rhizoma drynariae，the number of osteoblasts and content of ALP and BMP-2 in mid and high dose group of total flavonoids in rhizoma drynariae were increased，differences being significant（P＜0.05）.Comparing content of TGFβ-1 in all dose group of total flavonoids in rhizoma，difference was not significant（P＞0.05）.Conclusion：Total flavonoids in rhizoma drynariae can promote osteoblast proliferation and synthesis of involved protein obviously.

Tensile stress；Total flavonoids in rhizoma drynariae；Osteoblast；Animal experiment；Rats

R285.5

A

0256-7415（2016）08-0299-04

10.13457/j.cnki.jncm.2016.08.132

2016-03-06

國家自然科學基金青年項目（81403413）；廣東省中醫(yī)藥局建設中醫(yī)藥強省項目（20142046）

羅偉東（1981-），男，主治醫(yī)師，研究方向：四肢骨折成骨愈合。

姜自偉，E-mail：ainemylyy@163.com。