李琦，成莉鳳，段盛文，馮湘沅，彭源德*

(1.中國農業(yè)科學院麻類研究所，長沙 410205；2.湖南農業(yè)大學植物保護學院，長沙 410128)

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三個苧麻脫膠高效菌種的生長條件優(yōu)化

李琦1，2，成莉鳳1，段盛文1，馮湘沅1，彭源德1*

(1.中國農業(yè)科學院麻類研究所，長沙 410205；2.湖南農業(yè)大學植物保護學院，長沙 410128)

研究3個苧麻脫膠高效菌種的最佳生長培養(yǎng)條件。利用分光光度計，以菌液濁度OD600為指標，對苧麻脫膠高效菌種活化條件的主要參數(shù)(起始pH、接種量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間)進行研究。通過單因素和正交試驗，獲得3個苧麻脫膠高效菌種活化條件的最優(yōu)組合。結果表明：Hn1-1菌種的最佳生長條件為起始pH 6.0、接種量5%、培養(yǎng)溫度37℃、培養(yǎng)時間8 h；Hn2-2菌種的最佳生長條件為起始pH 8.0、接種量6%、培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)時間7 h；Hn6-2菌種的最佳生長條件為起始pH 6.0、接種量7%、培養(yǎng)溫度35℃、培養(yǎng)時間6 h。通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，3個菌種的種子液生物量提高到1.5～2.0倍，為其在苧麻脫膠的進一步應用提供科學依據。

脫膠菌種；生長條件；單因素試驗；正交試驗

苧麻原麻除含有大量纖維素外，還含有果膠(4%-8%)、半纖維素(12%-18%)等“膠質”成分[1]。無論利用麻纖維開發(fā)何種紡織產品，都必須經過“脫膠”，除去這些鍵合型非纖維素物質。傳統(tǒng)的漚麻方法存在產品質量不穩(wěn)定、勞動強度大、生產環(huán)境惡劣、不利于工業(yè)化生產等缺陷?；瘜W脫膠方法存在成本高、能耗大、纖維制成率低、纖維品質受到損傷和環(huán)境污染重等突出問題。生物脫膠方法具有“高效、清潔、低成本”等優(yōu)點，是現(xiàn)代麻類纖維提取的發(fā)展趨勢[2]。

麻類生物脫膠有菌脫膠和酶脫膠。與酶法脫膠相比，菌脫膠以成本低廉的優(yōu)勢，獲得了廣泛的工業(yè)化應用[3-5]。已有研究顯示：菌脫膠過程中，菌種的最終脫膠能力與前期的活化狀態(tài)(生物量)密切相關[6-7]。本團隊前期從特殊生境中采集土壤樣品，通過苧麻原麻富集培養(yǎng)后，用選擇培養(yǎng)基篩選到3個苧麻脫膠高效菌種。本研究擬對3個菌種的生長條件進行優(yōu)化，提高前期菌種活化的種子液生物量，為進一步提高麻類生物脫膠效率提供科學依據。

1　材料與方法

1.1供試菌種

Hn1-1、Hn2-2和Hn6-2菌種均為中國農業(yè)科學院麻類研究所農產品加工微生物遺傳改良與應用團隊選育，中國農業(yè)科學院農產品加工微生物菌種保藏庫保存。

1.2培養(yǎng)基

生長培養(yǎng)基：改良營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配方[8]，其pH根據具體實驗調整。

固體平板培養(yǎng)基：葡萄糖0.5%、蛋白胨0.5%、NaCl 0.5%、牛肉膏0.5%、瓊脂粉2%。

保藏斜面培養(yǎng)基：葡萄糖0.5%、營養(yǎng)瓊脂3.5%。

1.3主要儀器

分光光度計(DR-5000)購自美國HACH 公司；pH計(HI9025)購自意大利HANN公司；氣浴搖床(RH-Q)、水浴搖床(THZ-82)購自中國榮華儀器公司；生化恒溫培養(yǎng)箱(SPX-250B-Z)購自上海博訊實業(yè)有限公司。

1.4菌種活化流程

菌種活化流程參考文獻[9]。根據各單因素試驗和正交試驗接種100 mL生長培養(yǎng)基，在相應培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)，到合適的培養(yǎng)時間取樣(菌懸液)，測定OD600。

1.5生長培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.5.1單因素試驗

分別以培養(yǎng)溫度(28、30、35、37和40℃)、起始pH(5.0-9.0，間隔0.5)、接種量(1%-9%，間隔2%)和培養(yǎng)時間(4-10 h)為變量，固定其他生長培養(yǎng)條件，每組試驗設置3個重復進行單因素試驗，以培養(yǎng)第8 h的菌液測得OD600為指標選擇最優(yōu)水平[10]。

1.5.2正交試驗

以單因素試驗結果為基礎，根據培養(yǎng)溫度、起始pH、接種量和培養(yǎng)時間設計四因素三水平正交實驗L9(34)(表1)[11]。每組試驗設置3個重復，以OD600為衡量指標，結合極差分析和方差分析選擇最佳生長培養(yǎng)條件組合。

表1生長培養(yǎng)條件L9(34)正交試驗因素及水平

Tab.1Factors and levels for orthogonal array design L9(34)

組號因素A因素B因素C因素D111112122231333421235223162312731328321393321

注：因素A，起始pH；因素B，接種量；因素C，培養(yǎng)溫度；因素D，培養(yǎng)時間。

1.6數(shù)據處理方法

利用統(tǒng)計學分析軟件SAS 9.0進行方差分析。

2　結果與討論

2.1單因素試驗

2.1.1起始pH對菌種生長的影響

圖1結果表明：Hn1-1、Hn2-2和Hn6-2菌種生長的適宜pH分別為6.5、7.5和6.0。

圖1　起始pH對菌種生長的影響

2.1.2接種量對菌種生長的影響

圖2結果表明：Hn1-1和Hn2-2菌種生長的適宜接種量均為5%；Hn6-2菌種生長的適宜接種量為6%。

圖2　接種量對菌種生長的影響

2.1.3培養(yǎng)溫度對菌種生長的影響

圖3結果表明：Hn1-1和Hn6-2菌種生長的適宜溫度均為35℃；Hn2-2菌種生長的適宜溫度為30℃。

圖3　培養(yǎng)溫度對菌種生長的影響

2.1.4培養(yǎng)時間對菌種生長的影響

圖4結果表明：Hn1-1、Hn2-2和Hn6-2菌種在培養(yǎng)8 h后，均達到穩(wěn)定期。

圖4　培養(yǎng)時間對菌種生長的影響

2.2正交試驗

2.2.1Hn1-1菌種的最佳培養(yǎng)條件組合

在單因素試驗的基礎上，對起始pH、接種量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間進行正交試驗。表2和表3的結果表明：①影響Hn1-1菌種生長的主次順序為：D>C>B>A，即培養(yǎng)時間>培養(yǎng)溫度>接種量>起始pH；②在選定條件下，最佳生長培養(yǎng)組合為A1B2C3D3，即：起始pH 6.0、接種量5%、培養(yǎng)溫度37℃、培養(yǎng)時間8 h。

通過進一步驗證，Hn1-1菌種在最佳條件下培養(yǎng)，生物量OD600最高，可達0.886，是最低設計組(OD600為0.496)的1.79倍。

表2Hn1-1菌種L9(34)生長條件正交試驗的極差分析

Tab.2Range analysis on orthogonal array design L9(34) for growth conditions of Hn1-1 strain

組號因素A因素B因素C因素D平均OD60016.043360.49626.053570.65636.063780.81246.543580.75556.553760.61366.563370.55977.043770.57887.053380.73997.063560.520k10.6550.6100.5980.543k20.6420.6700.6440.598k30.6120.6300.6680.769R0.0420.0600.0700.226影響因素大小:D>C>B>A最優(yōu)組合:A1B2C3D3

表3Hn1-1菌種L9(34)生長條件正交試驗的方差分析

Tab.3Analysis of variance on orthogonal array design L9(34) for growth conditions of Hn1-1 strain

變異來源偏差平方和自由度方差F值Fa顯著水平因素10.002820.0014F0.01(2,6)=10.925因素20.005520.0028F0.05(2,6)=5.143因素30.007520.00382.013F0.1(2,6)=3.463*因素40.083220.041622.277F0.25(2,6)=1.762***誤差e0.002820.0014修正誤差e0.011260.0019總和0.102

2.2.2Hn2-2菌種的最佳培養(yǎng)條件組合

在單因素試驗的基礎上，對起始pH、接種量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間進行正交試驗。表4和表5的結果表明：①影響Hn2-2菌種生長的主次順序為：C>D>B>A，即培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)時間>接種量>起始pH；②在選定條件下，最佳生長培養(yǎng)組合為A3B3C2D3，即：起始pH 8.0、接種量6%、培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)時間7 h。

通過進一步驗證，Hn2-2菌種在最佳條件下培養(yǎng)，生物量OD600最高，達0.923，是最低設計組(OD600為0.471)的1.96倍。

表4Hn2-2菌種L9(34)生長條件正交試驗的極差分析

Tab.4Range analysis on orthogonal array design L9(34) for growth conditions of Hn2-2 strain

組號因素A因素B因素C因素D平均OD60017.042850.47127.053060.76837.063270.78747.543070.84457.553250.53767.562860.65578.043260.70088.052870.73698.063050.809k10.6750.6720.6210.606k20.6790.6800.8070.708k30.7480.7500.6750.789R0.0730.0790.1860.183影響因素大小:C>D>B>A最優(yōu)組合:A3B3C2D3

表5Hn2-2菌種L9(34)生長條件正交試驗的方差分析

Tab.5Analysis of variance on orthogonal array design L9(34) for growth conditions of Hn2-2 strain

變異來源偏差平方和自由度方差F值Fa顯著水平因素10.010220.0051F0.01(2,6)=10.925因素20.011220.0056F0.05(2,6)=5.143因素30.055120.02765.244F0.1(2,6)=3.463**因素40.050620.02534.814F0.25(2,6)=1.762*誤差e0.010220.0051修正誤差e0.031660.0053總和0.137

2.2.3Hn6-2菌種的最佳培養(yǎng)條件組合

在單因素試驗的基礎上，對起始pH、接種量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間進行正交試驗。表6和表7的結果表明：①影響Hn6-2菌種生長的主次順序為：B>C>A>D，即接種量>培養(yǎng)溫度>起始pH>培養(yǎng)時間；②在選定條件下，最佳生長培養(yǎng)組合為A2B3C2D1，即：起始pH 6.0、接種量7%、培養(yǎng)溫度35℃、培養(yǎng)時間6 h。

通過進一步驗證，Hn6-2菌種在最佳條件下培養(yǎng)，生物量OD600最高，達0.953，是最低設計組(OD600為0.570)的1.67倍。

表6Hn6-2菌種L9(34)生長條件正交試驗的極差分析

Tab.6Range analysis on orthogonal array design L9(34) for growth conditions of Hn6-2 strain

組號因素A因素B因素C因素D平均OD60016.053360.62826.063570.70036.073780.66346.553580.65156.563760.65966.573370.70277.053770.57087.063380.68497.073560.717k10.6640.6160.6710.668k20.6710.6810.6890.656k30.6570.6940.6310.666R0.0140.0780.0590.011影響因素大小:B>C>A>D最優(yōu)組合:A2B3C2D1

表7Hn6-2菌種L9(34)生長條件正交試驗的方差分析

Tab.7Analysis of variance on orthogonal array design L9(34) for growth conditions of Hn2-2

變異來源偏差平方和自由度方差F值Fa顯著水平因素10.000320.0001F0.01(2,6)=10.925因素20.010420.005246.897F0.05(2,6)=5.143***因素30.005420.002724.478F0.1(2,6)=3.463***因素40.000220.0001F0.25(2,6)=1.762誤差e0.000220.0001修正誤差e0.000760.0001總和0.016

3　討論

微生物的生長繁殖除了取決于自身種屬外，還與生態(tài)環(huán)境條件(營養(yǎng)成分、溫度、pH等)有密切關系。溫度是影響苧麻脫膠菌種生長最重要的因素之一。本研究的脫膠菌在溫度為30-40℃下的生長量最大，與前人的研究結果一致[12-13]。從pH影響研究結果來看，3株苧麻脫膠菌對環(huán)境酸堿度都比較敏感，pH為中性或略微偏酸或偏堿的條件下生長最好，pH過高或過低都不利于脫膠菌的生長[14]。

4　結論

以菌懸液OD600值為指標，優(yōu)化了3個苧麻脫膠高效菌種的生長培養(yǎng)條件，即：(1)Hn1-1菌種的最佳生長條件為起始pH 6.0、接種量5%、培養(yǎng)溫度37℃、培養(yǎng)時間8 h；(2)Hn2-2菌種的最佳生長條件為起始pH 8.0、接種量6%、培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)時間7 h；(3)Hn6-2菌種的最佳生長條件為起始pH 6.0、接種量7%、培養(yǎng)溫度35℃、培養(yǎng)時間6 h。

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Optimization of the Culture Conditions for Three Efficient Strains Used in Ramie Bio-degumming

LI Qi1，2, CHENG Lifeng1, DUAN Shengwen1, FENG Xiangyuan1, PENG Yuande1*

(1. Institute of Bast Fiber Crops, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410205, China;2. College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

The optimal culture conditions of three efficient strains used in ramie bio-degumming were researched. Cell suspension turbidity (optical density at 600 nm,OD600) was measured using spectrophotometer to investigate the optimal initial pH, inoculation amount, culture temperature and time of the activation conditions for efficient strain used in ramie bio-degumming. Using one-factor-at-a-time combined with orthogonal array design method, optimal combination of the activation conditions for the three aimed efficient strains were found. Results showed that Hn1-1 strain achieved the highest biomass with inoculation amount 5% in 8 h of incubation at initial pH 6.0 and 35.5℃, Hn2-2 strain achieved the highest biomass with inoculation amount 6% in 7 h of incubation at initial pH 8.0 and 30℃, and Hn6-2 strain achieved the highest biomass with inoculation amount 7% in 6 h of incubation at initial pH 6.0 and 35℃ in the given conditions. Therefore, it can provide scientific basis for further application in ramie degumming as for the three improved liquid biomass (as 1.5～2.0 folds as that of originalOD600) by optimizing the culture conditions.

bio-degumming strain; growth condition; one-factor-at-a-time test; orthogonal test

1671-3532(2016)04-0181-07

2016-07-03

中國農業(yè)科學院創(chuàng)新工程(No. ASTIP-IBFC)；湖南省自然科學基金(No. 2016jj3126)；現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項 (No. CARS-19)

李琦(1983-)，男，博士研究生，研究方向：微生物及酶工程。E-mail：15007302343@139.com。

彭源德(1965-)，男，研究員，研究方向：農產品加工微生物遺傳改良與應用。E-mail：ibfcpyd313@126.com。

S563.1

A