陳　琳， 李秉鈞， 馮俊榮

( 煙臺(tái)大學(xué)海洋學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005)

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利用大西洋鮭內(nèi)源酶酶解加工廢棄物制取抗氧化肽的研究

陳琳， 李秉鈞， 馮俊榮

( 煙臺(tái)大學(xué)海洋學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005)

大西洋鮭(Salmosalar)加工廢棄物中含有豐富的蛋白質(zhì)，具有較高的開發(fā)利用價(jià)值，直接遺棄會(huì)造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染，探索利用自身內(nèi)源蛋白酶酶解制取抗氧化肽具有重要的意義。對(duì)大西洋鮭內(nèi)臟所含內(nèi)源蛋白酶的性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，測(cè)得主要含有3種內(nèi)源蛋白酶，最適pH為2.0、6.0、9.0，pH 9.0的堿性蛋白酶具有最高的酶比活力。以水解度和總抗氧化活性為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)確定大西洋鮭內(nèi)源蛋白酶處理鮭魚的加工廢棄物干粉料的最適條件，再用正交實(shí)驗(yàn)L16(45)對(duì)其酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，確定影響酶解液總抗氧化活性的主要影響因素(P﹤0.05)為溫度、pH和酶解時(shí)間，比較后得到最佳酶解條件為：溫度35℃、加酶量0.7 mL/50 mL、料液比0.7 g/50 mL、pH 9.0、酶解時(shí)間7 h，該條件下酶解液的總抗氧化活性為258.29 U，大西洋鮭加工廢棄物干粉料水解度為15.00%。研究表明，采用大西洋鮭內(nèi)源蛋白酶酶解鮭魚加工下腳料并制取抗氧化肽，具有一定的可行性。

大西洋鮭魚；內(nèi)源蛋白酶；酶解；抗氧化肽；正交

在大西洋鮭(Salmosalar)加工過程中會(huì)產(chǎn)生了大量的廢棄物，其中含有大量的蛋白質(zhì)，直接遺棄不但造成資源浪費(fèi)還污染環(huán)境[1-2]，與此同時(shí)，世界性的蛋白質(zhì)資源匱乏日益嚴(yán)重。因此，如何有效利用大西洋鮭魚加工廢棄物是一個(gè)亟待解決的問題[3]。抗氧化肽是指具有抗氧化生理活性的多肽類，近年來已成為食品科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[4-5]。酶解法是一種獲得抗氧化肽的有效方式[6]，主要有內(nèi)源酶酶解法、外源酶酶解法和微生物酵解法。內(nèi)源酶酶解法是一種廣泛使用的可提高魚蛋白溶解度并改善其功能性的方法[7-8]。目前，利用大西洋鮭魚內(nèi)源酶來酶解鮭魚加工廢棄物，以制取抗氧化肽的研究較少。

本文初步研究了內(nèi)源蛋白酶的性質(zhì)，并以大西洋鮭加工廢棄物為原料制成干粉[9-10]，探索其酶解的單因素最適條件，并用正交法進(jìn)行優(yōu)化，以確定內(nèi)源酶酶解制備抗氧化肽的最佳條件。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

材料與試劑：大西洋鮭加工廢棄物(魚頭、魚鰭和魚尾)；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、甲醛等均為分析純；總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

儀器：HYQ150生物搖床(武漢匯誠生物科技有限公司)，H1650-W型臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)，V-1100D型可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)，LDZM-40KCS型立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1大西洋鮭魚主要成分測(cè)定和原料處理

蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用微量凱氏定氮法[11]，脂肪含量測(cè)定采用索氏抽提法[12]，灰分含量測(cè)定采用灼燒法[13]。原料處理：原料切碎→烘干(70℃，24 h)→絞碎→第一次脫脂(乙醇原料比4∶1)→烘干(70℃，2 h)→第二次脫脂(異丙醇原料比2∶1)→烘干(70℃，24 h)→過篩網(wǎng)(120目)。

1.2.2內(nèi)源蛋白酶、酶解液制備

將大西洋鮭魚內(nèi)臟切成小塊冷凍備用。粗酶的提取方法參照Fu等[14]的方法。稱取混合內(nèi)臟360 g以1∶1(m/m)的比例加入50 m mol/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH 7.0)，高速勻漿，并在4℃、10 000 r/min條件下離心20 min，上清液即為所需粗酶液。

酶解步驟：一定料液比的脫脂魚粉加入相應(yīng)pH的緩沖液后高壓蒸汽滅菌，無菌操作加入粗酶液，在35℃～60℃下培養(yǎng)1h～7h→沸水浴滅酶(10 min)→離心(10 000 r/min，20 min)→酶解液。

1.2.3酶解液生化指標(biāo)測(cè)定

α-氨基氮含量測(cè)定采用甲醛滴定法[13]，總抗氧化活性測(cè)定采用總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定試劑盒?？偪寡趸芰τ?jì)算公式：

MT-AOC=(A-A0)×(V1/V2)×

N×V3×100/30

式中：MT-AOC—總抗氧化能力，U；A—測(cè)定OD值；A0—對(duì)照OD值；V1—反應(yīng)液總量，mL；V2—取樣量，mL；N—樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)；V3—發(fā)酵液體積，mL。

1.2.4蛋白酶比活力測(cè)定

蛋白酶比活力測(cè)定采用福林-酚法，以酪蛋白為底物，酶活力單位定義為每分鐘分解底物產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量[15-16]。用酪蛋白水解法來測(cè)定不同pH條件下粗酶分解蛋白質(zhì)的活性[15]。不同pH的選擇緩沖液為：pH 1.0～2.0，0.1 mol/L 氯化鉀-鹽酸；pH 3.0～6.0，0.1 mol/L 檸檬酸鈉-檸檬酸；pH 7.0～8.0，0.0 5 mol/L 磷酸；pH 9.0，0.05 mol/L 三羥甲基氨基甲烷-鹽酸；pH 10.0，0.0 5 mol/L 硼砂-氫氧化鈉；pH 11.0～14.0，0.2 mol/L 磷酸氫二鈉-氫氧化鈉。

2　結(jié)果與分析

2.1大西洋鮭魚下腳料魚粉主要成分

大西洋鮭魚下腳料制備的魚粉中含有大量的蛋白質(zhì)和脂肪(表1)，可以進(jìn)一步加工將其酶解制成抗氧化肽，以增大其綜合利用價(jià)值以及水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，緩解水產(chǎn)加工原料不足的現(xiàn)狀。

表1　大西洋鮭魚下腳料魚粉主要成分

2.2單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1最適反應(yīng)pH的確定

圖1顯示，在特定的pH范圍內(nèi)，不同的酶呈現(xiàn)出各自的最高活性。粗酶液2個(gè)主要活性峰值在pH 2.0和9.0左右，這表明主要存在2種蛋白酶：最適pH 2.0左右的酸性蛋白酶(可能為胃蛋白酶)和最適pH 9.0左右的堿性蛋白酶(可能為胰蛋白酶)。

圖1　pH對(duì)大西洋鮭魚內(nèi)源蛋白酶分解酪蛋白活性的影響

此外，在pH 6.0左右有一個(gè)小的波峰，推測(cè)可能為一種組織蛋白酶。這不同于楊春橋等[17]報(bào)道的大西洋鮭粗蛋白酶在pH 3.0和pH 7.5時(shí)酶活力出現(xiàn)波峰。原因可能是大西洋鮭魚蛋白酶除了在傳統(tǒng)的肝臟、胰臟、胃和腸外，還存在于幽門盲囊，楊春橋等[17]并沒有針對(duì)幽門盲囊進(jìn)行分析，而幽門盲囊在大西洋鮭內(nèi)臟中占有很大的比重；另外，本研究在提取粗酶時(shí)將所有內(nèi)臟混合后提取，多種酶混合后會(huì)產(chǎn)生相互作用，這也可能是不同的一個(gè)原因。

2.2.2最適反應(yīng)溫度的確定

由圖2可知，大西洋鮭魚內(nèi)源蛋白酶的活力隨溫度的升高而增大，但是當(dāng)溫度進(jìn)一步升高時(shí)，由于蛋白的熱變性作用使得蛋白酶活力逐步降低[18]。在pH 2.0的條件下，內(nèi)源蛋白酶在40～55 ℃之間酶活力較高，在50℃時(shí)達(dá)到最大值(39 857.57 U/mg)；在pH 9.0時(shí)，內(nèi)源酶的最適溫度為40℃，酶活力為21 100.45 U/mg。

2.2.3最適料液比的確定

在固定酶解溫度40℃、pH 9.0、加酶量0.4 mL/50 mL(滅活與未滅活對(duì)比，下同)、酶解時(shí)間2 h的條件下進(jìn)行酶解試驗(yàn)，考察不同料液比對(duì)發(fā)酵液總抗氧化活性和發(fā)酵液中氨基氮含量的影響。如圖3所示，總抗氧化活性和氨基氮含量在料液比0.6 g/50 mL時(shí)分別為130.54 U/50 mL和1.365 mg/100 mL，均達(dá)到最大值，且有相同的增長(zhǎng)趨勢(shì)。

圖2　溫度對(duì)大西洋鮭魚內(nèi)源蛋白酶酶活力的影響

圖3　不同料液比對(duì)總抗氧化活性和氨基氮含量的影響

水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物利用內(nèi)源酶水解的反應(yīng)必須在水溶液中進(jìn)行，因?yàn)榈鞍酌副仨毴芙庠谙鄳?yīng)的緩沖液中才能均勻分散在整個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中，才能與底物接觸，并對(duì)其發(fā)生作用，底物濃度過高會(huì)導(dǎo)致流動(dòng)性差，阻礙酶與底物接觸，使反應(yīng)速率降低[19]。

2.2.4最適加酶量的確定

在固定發(fā)酵溫度40℃、pH 9.0、酶解時(shí)間2 h、料液比0.6 g/50 mL的條件下，考察不同加酶量對(duì)總抗氧化活性和氨基氮含量的影響。由圖4可知，隨著加酶量的增加，兩項(xiàng)指標(biāo)也逐步增加，但當(dāng)加酶量超過0.5 mL/50 mL時(shí)，增長(zhǎng)趨勢(shì)放緩。

圖4　不同加酶量對(duì)總抗氧化活性和氨基氮含量的影響

分析認(rèn)為，在加酶量為0.5 mL/50 mL時(shí)，酶與底物達(dá)到飽和，繼續(xù)添加酶會(huì)導(dǎo)致競(jìng)爭(zhēng)性抑制而降低反應(yīng)速率，由此確定0.5 mL/50 mL為最佳加酶量。

2.2.5最適酶解時(shí)間的確定

在固定發(fā)酵溫度40℃、pH 9.0、料液比0.6 g/50 mL、加酶量0.5 mL/50 mL的條件下，考察不同酶解時(shí)間對(duì)總抗氧化活性和氨基氮含量的影響。由圖5可知，兩項(xiàng)指標(biāo)均隨時(shí)間增加而呈現(xiàn)增長(zhǎng)的總體趨勢(shì)，但波峰時(shí)間不同。

圖5　不同酶解時(shí)間對(duì)總抗氧化活性和氨基氮含量的影響

這是因?yàn)?，?dāng)水解到一定程度，發(fā)生的酶解反應(yīng)主要是前階段蛋白質(zhì)水解獲得的肽進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為小肽和氨基酸，表現(xiàn)為水解度的增大，而總抗氧化活性并不會(huì)顯著增加，甚至可能會(huì)降低。綜合考慮后確定最適酶解時(shí)間為5 h。

2.3正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)已知的單因素試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用正交試驗(yàn)對(duì)其酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳酶解工藝條件。正交實(shí)驗(yàn)因素與水平見表2。以水解度和總抗氧化活性(簡(jiǎn)稱“總抗”)為指標(biāo)，對(duì)表1的正交設(shè)計(jì)方案進(jìn)行分析，確定最佳反應(yīng)條件。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析見表3、表4、表5。

表2　正交試驗(yàn)因素與水平L16(45)

注：A—溫度，℃；B—加酶量，mL/50 mL；C—料液比，g/50 mL；D—pH；E—時(shí)間，h。下同

表3　正交試驗(yàn)方案與結(jié)果分析

表4　以水解度為指標(biāo)的正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

表5　以總抗為指標(biāo)的正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

用大西洋鮭魚內(nèi)源蛋白酶酶解大西洋鮭魚下腳料制備魚粉時(shí)，以水解度為指標(biāo)，方差分析結(jié)果(表4)顯示，5個(gè)因素對(duì)水解度均有顯著性影響(P<0.05)。極差分析結(jié)果(表3)發(fā)現(xiàn)，因素的影響程度依次為pH、酶解時(shí)間、加酶量、料液比、溫度；最佳實(shí)驗(yàn)組合為溫度45℃、加酶量0.7 mL/50 mL、料液比0.5 g/50 mL、pH 9.0、酶解時(shí)間7 h。方差分析結(jié)果(表5)發(fā)現(xiàn)，溫度、pH、酶解時(shí)間對(duì)總抗有顯著性影響(P<0.05)，另外兩個(gè)因素對(duì)結(jié)果的影響不顯著。根據(jù)表3，因素的影響程度依次為pH、酶解時(shí)間、溫度、料液比、加酶量；最佳實(shí)驗(yàn)組合為：溫度35℃、加酶量0.7 mL/50 mL、料液比0.7 g/50 mL、pH 9.0、酶解時(shí)間7 h。上述兩個(gè)最佳組合并未出現(xiàn)在正交表中，需要對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。采用兩組優(yōu)化工藝參數(shù)對(duì)大西洋鮭魚下腳料進(jìn)行酶解反應(yīng)，魚粉水解度分別為19.20%和15.00%，二者具有顯著性差異(P<0.05)；總抗分別為178.97 U和258.29 U，二者具有顯著性差異(P<0.05)。與表3中的數(shù)據(jù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的水解度最優(yōu)實(shí)驗(yàn)組合比正交中的水解度提高了27.91%，總抗最優(yōu)實(shí)驗(yàn)組合比正交方案中的總抗提高了51.78%。

3　結(jié)論

大西洋鮭內(nèi)臟中至少含有三種蛋白酶：pH 2.0的酸性蛋白酶(可能為胃蛋白酶)，pH 9.0的堿性蛋白酶(可能為胰蛋白酶)，pH 6.0的一種組織蛋白酶。pH 9.0的酶活力最高，前兩種蛋白酶的最適反應(yīng)溫度分別為50℃和40℃。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，使用正交法對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，兩優(yōu)化組在總抗氧化活性和水解度上都有所提高，確定影響發(fā)酵液總抗氧化活性的3個(gè)主要影響因素(P﹤0.05)為溫度、pH和酶解時(shí)間。綜合經(jīng)濟(jì)效益考慮，確定最佳反應(yīng)條件為：溫度35℃、加酶量0.7 mL/50 mL、料液比0.7 g/ 50 mL、pH 9.0、酶解時(shí)間7 h。在此條件下，酶解得到的酶解液，其總抗氧化活性為258.29 U，魚干粉料水解度為15.00%。用大西洋鮭魚內(nèi)源蛋白酶處理大西洋鮭魚下腳料制備抗氧化肽，具有一定的可行性，作為大西洋鮭魚加工處理的一個(gè)環(huán)節(jié)，可增加其綜合利用價(jià)值，具有生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

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Study on the optimal conditions for preparing antioxidant peptides from Atlantic salmon processing wastes using its endogenous proteases

CHEN Lin, LI Bingjun, FENG Junrong

(Schoolofocean,YantaiUniversity,Yantai264005,China)

The processing residues of Atlantic salmon (Salmosalar) contain abundant proteins and are of high value for further utilization, while abandoning them would be a waste of resources and might cause environmental pollution. Thus it is significant to research the preparation of antioxidant peptides from Atlantic salmon processing residues with its endogenous proteases. A preliminary study of proteases from Atlantic salmon viscera showed that there were mainly 3 types of endogenous proteases which were most active at pH value of 2.0, 6.0, and 9.0 respectively, and the alkaline protease with optimal activity at pH 9.0 had the highest specific activity level. Atlantic salmon processing residues protein were hydrolyzed by endogenous proteases to produce the antioxidative hydrolysates. The degree of hydrolysis and the total antioxidant activity were compared to find the best single factors; among the single factors studied,temperature, initial pH and time had significant effects on the total antioxidant activity of enzymatic hydrolysis solution (P<0.05), and the optimum hydrolysis conditions were determined by L16(45) orthogonal array design as follows: temperature 35°C, dosage of enzyme 0.7mL/50mL, material-to-solvent ratio 0.7g/50mL, pH value 9.0, and time 7h, under which the total antioxidant activity and degree of hydrolysis were 258.29U and 15.00%, respectively. In conclusion, it is feasible and practical to prepare antioxidant peptides from Atlantic salmon processing wastes using its endogenous proteases.

Salmosalar; endogenous proteases; enzymolysis; antioxidant peptide; orthogonal

10.3969/j.issn.1007-9580.2016.04.012

2016-05-21

2016-07-29

山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2012GHY11515)

陳琳(1987—)，男，碩士研究生，研究方向：水生生物學(xué)。E-mail：641584489@qq.com

李秉鈞(1961—)，男，教授，研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)、遺傳育種學(xué)、海洋生物技術(shù)。E-mail：li6234307@163.com

TS254.9

A

1007-9580(2016)04-064-06