郝棟棟，殷倩，鐘興明，韋相才1，*，苗竹林，王永霞

(1．暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣州　510632；2. 廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所，廣州　510000)

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高雄激素PCOS動(dòng)物模型中抗苗勒管激素Ⅱ型受體蛋白及其基因甲基化分析

郝棟棟1#，殷倩1#，鐘興明2，韋相才1，2*，苗竹林2，王永霞2

(1．暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣州510632；2. 廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所，廣州510000)

目的通過建立高雄激素誘導(dǎo)的多囊卵巢綜合征(PCOS)大鼠模型，探討抗苗勒管激素Ⅱ型受體(AMHR Ⅱ)在卵巢、子宮內(nèi)膜中的表達(dá)及其基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化與PCOS發(fā)病及局部病理變化的關(guān)系。方法45只雌性SD大鼠隨機(jī)分兩組：PCOS組皮下注射脫氫表雄酮(DHEA)建立PCOS模型，對(duì)照組同期皮下注射等量生理鹽水；測(cè)定血清激素水平，結(jié)合卵巢組織HE染色切片結(jié)構(gòu)改變?cè)u(píng)估PCOS模型；免疫組化法檢測(cè)卵巢、子宮內(nèi)膜組織AMHR Ⅱ蛋白的表達(dá)與定位；通過甲基化特異性PCR(MSP)定性分析兩組大鼠血液、卵巢組織AMHR Ⅱ基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)。結(jié)果血清性激素水平及卵巢切片結(jié)果均提示成功建立PCOS動(dòng)物模型；免疫組化檢測(cè)顯示AMHR Ⅱ蛋白定位表達(dá)于細(xì)胞膜，在卵巢間質(zhì)及卵泡顆粒細(xì)胞中均存在陽性表達(dá)，且在模型組中的表達(dá)強(qiáng)于對(duì)照組(P<0.05)；AMHR Ⅱ在子宮內(nèi)膜中也存在表達(dá)，兩組之間表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；MSP結(jié)果顯示兩組中血液及卵巢組織所有DNA樣本均檢出部分甲基化條帶，兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論AMHR Ⅱ可能參與了PCOS中AMH調(diào)控卵泡發(fā)育的過程，但與子宮內(nèi)膜病變無明顯相關(guān)性；AMHRⅡ基因在啟動(dòng)子區(qū)域存在著部分甲基化，但這種甲基化狀態(tài)與PCOS發(fā)病及局部組織病理變化無明顯相關(guān)。

抗苗勒管激素Ⅱ型受體；多囊卵巢綜合征；DNA甲基化；動(dòng)物模型

【Abstract】

Objective：To study localization，distribution and expression of anti-müllerian hormone type Ⅱ receptor (AMHR Ⅱ) in ovary and endometrium based on rat model of polycystic ovary syndrome (PCOS)，and explore the correlation between AMHR Ⅱ gene methylation and the local histopathological changes.

Methods：Forty five female Sprague-Dawley rats were grouped randomly into model group (PCOS model) subcutaneously injected with dehydroepiandrosterone (DHEA) and control group with sodium chloride instead. The levels of related reproductive hormones in serum were measured. The ovarian tissue of rats in every group underwent paraffin embedding，microsection，HE staining，and then patho-histological changes were observed to assess the establishment of PCOS model. The localization，distribution and semi-quantitative analysis of AMHR Ⅱ protein were determined by immunohistochemistry (IHC). The qualitative analysis of AMHR Ⅱ gene methylation in blood and ovarian tissues was performed by methylation-specific PCR (MS-PCR).

Results：The reproductive hormone levels and morphology analysis of tissue HE stained indicated that PCOS animal model was successfully established. IHC analysis showed that AMHR Ⅱ mainly located and expressed in cell membrane，and ovarian stroma and of granulosa cells of follicle presented positively expression. The expression was significantly higher in the model group than the control group (P<0.05). AMHR Ⅱ were also expressed in endometrial glandular epithelial cells and stromal cells，and there were no significant differences between the two groups (P>0.05). MSP qualitative analysis showed partial methylation occurred in the promoter region of AMHR Ⅱ genes in the blood and ovarian tissues in both groups，but without significant differences (P>0.05).

Conclusions：AMHR Ⅱ may be involved in the follicular development process regulated by AMH，but it may not be related to endometrial lesions. AMHR Ⅱ gene partial methylation in the promoter region may not be correlated with the local histopathological changes.

(JReprodMed2016，25(9)：832-837)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是以高雄激素、胰島素抵抗為主要表現(xiàn)的內(nèi)分泌、代謝紊亂綜合征。PCOS至今發(fā)病機(jī)制不明，近年來有研究認(rèn)為PCOS是一種卵源性疾病，卵巢局部調(diào)節(jié)因子的異常可能是導(dǎo)致PCOS一系列病理生理改變的重要因素[1]。抗苗勒管激素(AMH)是由卵巢顆粒細(xì)胞分泌的一種局部調(diào)節(jié)因子，在PCOS患者血清中明顯高于正常同齡婦女，且研究認(rèn)為其與卵泡生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)?？姑缋展芗に丌蛐褪荏w(AMHR Ⅱ)是AMH作用的中間受體，它的表達(dá)是否參與或者以何種方式參與AMH調(diào)控卵泡發(fā)育的過程，研究報(bào)道不一。DNA甲基化是基因表觀遺傳修飾的重要方式，AMHRⅡ基因在PCOS中是否通過表觀遺傳學(xué)改變從而影響其在組織中的表達(dá)，鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過觀察高雄激素PCOS大鼠模型卵巢、子宮內(nèi)膜等局部組織中AMHR Ⅱ蛋白的表達(dá)與分布，探討AMHR Ⅱ在PCOS局部組織病變發(fā)生發(fā)展中的作用；并對(duì)AMHRⅡ基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)進(jìn)行定性分析，探討AMHRⅡ基因在PCOS中是否存在表觀遺傳學(xué)改變以及此種改變是否參與了AMHR Ⅱ表達(dá)調(diào)控。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

清潔級(jí)SD雌性大鼠45只，均購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證編號(hào)SCXK(粵)2008-0002，20～23日齡，體重40～55 g。

ELISA試劑盒購(gòu)自上海信帆生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠AMHR Ⅱ單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)abcam公司；組織DNA提取試劑DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒及甲基化特異性PCR試劑盒購(gòu)自北京天根生物技術(shù)有限公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. PCOS大鼠模型的建立：45只SD雌性大鼠隨機(jī)分為PCOS組(n=25)與正常對(duì)照組(n=20)。前者皮下注射脫氫表雄酮(DHEA)6 mg/100 g/d，連續(xù)注射20 d，建立PCOS大鼠模型[2-3]；后者同期予以等量生理鹽水。兩組大鼠均喂以標(biāo)準(zhǔn)大鼠顆粒飼料，環(huán)境溫度20～23℃，濕度40%～60%，予清潔級(jí)飼養(yǎng)，每日光照10 h，自由飲水。

2. 標(biāo)本的收集與病理檢測(cè)：兩組大鼠于6周齡始進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片，于動(dòng)情間期提前一天禁食，次日以3%戊巴比妥那(30 mg/kg，ip)麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈一次性采血并分為抗凝與非抗凝兩管；取出雙側(cè)卵巢與子宮，一側(cè)卵巢迅速置于-80℃保存，用于后續(xù)提取組織DNA，子宮及另一側(cè)卵巢則迅速置于10%中性甲醛中固定24 h，以卵巢最大橫切面及子宮橫切面為待測(cè)面分別行HE染色與免疫組織化學(xué)染色。

3. 血清激素檢測(cè)：腹主動(dòng)脈采取的非抗凝血在4 000 rpm離心10 min后分離上層血清-20℃保存。按照ELISA試劑盒說明書操作，測(cè)定血清睪酮(T)、雌二醇(E2)、孕酮(P)、黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)以及抗苗勒管激素(AMH)水平。

4. 免疫組織化學(xué)檢測(cè)AMHR Ⅱ蛋白的表達(dá)：采用鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶免疫組化法(SP 法) 檢測(cè)石蠟切片中AMHR Ⅱ。Ⅰ抗為兔抗鼠AMHR Ⅱ單克隆抗體1∶100 稀釋，Ⅱ抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB) 顯色。染色過程參照試劑盒說明操作，以PBS 代替Ⅰ抗作為陰性對(duì)照。卵巢、子宮內(nèi)膜組織中AMHR Ⅱ蛋白半定量分析采用德國(guó)Lecia正立體式顯微鏡醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，陽性信號(hào)是指在細(xì)胞膜和胞漿內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色的顆粒，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野分別測(cè)定卵巢間質(zhì)和卵泡、子宮內(nèi)膜間質(zhì)和腺體的AMHR Ⅱ蛋白表達(dá)水平。

5. 大鼠基因組DNA的提?。翰捎媒?jīng)典的酚氯仿法提取血液基因組DNA；大鼠卵巢組織于-80℃取出并按DNA提取試劑盒說明書操作提取組織DNA。1%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分析儀檢測(cè)DNA的純度及濃度，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

6. 大鼠基因組DNA中AMHRⅡ基因甲基化的檢測(cè)：采用甲基化特異性PCR定性分析AMHRⅡ基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)。①在數(shù)據(jù)庫(kù)中查找AMHRⅡ基因相關(guān)序列，選擇位于AMHRⅡ基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的一段富含CpG位點(diǎn)的DNA序列，運(yùn)用Meth Primer-Design 軟件進(jìn)行AMHRⅡ基因甲基化特異性引物設(shè)計(jì)(表1)。②按DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒說明書將提取的DNA樣本予重亞硫酸鹽處理，處理后的DNA樣本做為模板DNA，根據(jù)甲基化特異性引物與非特異性引物分別加入兩個(gè)PCR管中，按照PCR試劑盒操作說明分別進(jìn)行甲基化特異性PCR。③PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳以檢測(cè)有無目的條帶出現(xiàn)。

表1　AMHR II 甲基化特異性PCR引物設(shè)計(jì)

注：M為甲基化特異性引物，U為非甲基化特異性引物

三、統(tǒng)計(jì)方法

結(jié)　　果

一、PCOS動(dòng)物模型的驗(yàn)證

本實(shí)驗(yàn)材料來自于同一基金支持下的并行項(xiàng)目[3]，按照本實(shí)驗(yàn)室既往的方案，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模成功：PCOS組血清T、E2、AMH水平均高于對(duì)照組，且LH/FSH比值升高；PCOS組卵巢組織總體呈典型多囊樣改變，子宮內(nèi)膜增厚、腺體增多。

二、AMHR Ⅱ蛋白在卵巢、子宮內(nèi)膜中的表達(dá)情況

1. 免疫組化蛋白定位結(jié)果：AMHR Ⅱ的表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜，PCOS組與對(duì)照組中AMHR Ⅱ在子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞中均存在著陽性表達(dá)(圖1A和1B)，兩者陽性表達(dá)無明顯差異。PCOS組AMHR Ⅱ在卵巢卵泡卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞均有陽性表達(dá)，尤其是在顆粒細(xì)胞中表達(dá)，卵巢間質(zhì)中見少量分布(圖1C)，而對(duì)照組AMHR Ⅱ主要在未成熟卵泡顆粒細(xì)胞表達(dá)，陽性率明顯低于PCOS組，卵泡外膜細(xì)胞、間質(zhì)中見少量分布(圖1D)。

2. AMHR Ⅱ蛋白的相對(duì)定量結(jié)果：AMHR Ⅱ在PCOS大鼠卵巢卵泡及間質(zhì)中表達(dá)較對(duì)照組增強(qiáng)，其分布在間質(zhì)及卵泡中的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AMHR Ⅱ在大鼠子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞表達(dá)較間質(zhì)中增強(qiáng)，但PCOS組與對(duì)照組兩者間質(zhì)及腺上皮細(xì)胞的灰度值分析顯示無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

3、AMHRⅡ基因甲基化檢測(cè)：在大鼠血液和卵巢基因組DNA中，PCOS組與對(duì)照組所有樣本中均在250 bp附近檢出了部分甲基化條帶(圖2)。電泳條件為：1%凝膠電泳，電壓為100 V，電流約20 mA。

A：PCOS組子宮內(nèi)膜；B：對(duì)照組子宮內(nèi)膜；C：PCOS組卵巢組織；D：對(duì)照組卵巢組織圖1　AMHR Ⅱ蛋白在PCOS組及對(duì)照組卵巢及子宮內(nèi)膜組織的表達(dá)(免疫組化 ×200)

組別卵巢組織子宮內(nèi)膜組織間質(zhì)卵泡間質(zhì)腺上皮細(xì)胞對(duì)照組113.73±3.93112.04±3.09110.37±11.9796.49±8.82PCOS組104.73±7.04*102.89±3.09*109.36±10.4288.41±8.93

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

M：甲基化特異性引物；U：非甲基化特異性引物；a：PCOS組；b：對(duì)照組；數(shù)字代表樣品編號(hào)圖2　大鼠卵巢及血液DNA中AMHR Ⅱ基因甲基化特異性PCR瓊脂糖凝膠圖像

討　　論

一、AMHR Ⅱ在PCOS生殖器官局部病理變化中的作用

AMH又稱為苗勒管抑制因子，最初在男性睪丸組織中發(fā)現(xiàn)，與男性胚胎性腺分化階段苗勒管的退化有關(guān)。在女性個(gè)體內(nèi)，AMH主要由處于生長(zhǎng)階段的卵泡顆粒細(xì)胞分泌，并與起始卵泡的募集與卵巢生長(zhǎng)發(fā)育中優(yōu)勢(shì)卵泡的產(chǎn)生有關(guān)[4]，其在血清中的濃度與卵巢中未成熟卵泡的數(shù)目有關(guān)。與TGF-β家族的其他成員一樣，AMH信號(hào)傳導(dǎo)需經(jīng)過兩種絲氨酸/蘇氨酸激酶受體(AMHR I與AMHR Ⅱ)與兩種smad蛋白(受體調(diào)節(jié)smad蛋白R(shí)-Smad、普通smad蛋白smad4)。然而AMH主要通過AMHR Ⅱ(一種跨膜的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體)發(fā)生信號(hào)傳導(dǎo)，而不能通過其他Ⅱ型受體如骨基質(zhì)發(fā)生蛋白Ⅱ型受體，激活素Ⅱ型受體等[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)AMHRⅡ基因敲除的大鼠并不會(huì)出現(xiàn)苗勒管得退化，持續(xù)苗勒氏管綜合征患者中AMHRⅡ基因存在著突變[7]。

目前關(guān)于AMHR Ⅱ在卵巢、子宮內(nèi)膜等生殖器官局部分布與表達(dá)的研究較少，AMHR Ⅱ是否參與了AMH調(diào)控卵泡生長(zhǎng)發(fā)育的過程研究報(bào)道結(jié)論不一。姜宙等[8]認(rèn)為AMH通過與卵丘顆粒細(xì)胞的特異性受體AMHR Ⅱ結(jié)合調(diào)控卵母細(xì)胞發(fā)育，且在卵泡中AMHR Ⅱ mRNA與AMH的表達(dá)量變化趨勢(shì)相同。Rice等[9]研究發(fā)現(xiàn)AMHR Ⅱ mRNA在多囊卵巢中的表達(dá)存在著特殊階段性，僅在少數(shù)始基卵泡、竇卵泡、次級(jí)卵泡中表達(dá)，并對(duì)AMH抑制卵泡募集提出了質(zhì)疑。Li[10]等研究也發(fā)現(xiàn)在PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞中AMHR Ⅱ的mRNA與蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)中PCOS模型組血清中AMH濃度明顯高于對(duì)照組，說明在PCOS大鼠血清中AMH濃度明顯升高，這也與國(guó)內(nèi)外眾多研究一致。在大鼠卵巢免疫組化切片中發(fā)現(xiàn)AMHR Ⅱ在竇前卵泡及竇卵泡中都有表達(dá)，而在卵泡膜細(xì)胞及間質(zhì)中也發(fā)現(xiàn)存在著少量陽性表達(dá)；本研究還發(fā)現(xiàn)在PCOS模型組AMHR Ⅱ在卵泡細(xì)胞(主要為顆粒細(xì)胞)的分布表達(dá)強(qiáng)于對(duì)照組。因此我們推測(cè)可能存在這樣的過程：PCOS中竇前卵泡及竇卵泡等未成熟卵泡的增多使得AMH分泌總量增加，血清中AMH濃度升高，AMH分泌量的增加上調(diào)了它的受體AMHR Ⅱ的表達(dá)，從而增強(qiáng)了其生物學(xué)作用抑制卵泡對(duì)FSH的敏感性，使卵泡的FSH閾值升高；而在卵巢間質(zhì)的免疫組化切片中我們也發(fā)現(xiàn)存在著AMHR Ⅱ的陽性表達(dá)，推測(cè)AMH通過AMHR Ⅱ發(fā)揮作用的同時(shí)可能還受其他卵巢局部生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)。

國(guó)外研究報(bào)道[11]在人大腦組織中與TGF-β的激活相關(guān)的BMPR-IB(BMPR1B；Alk6)和Smad5依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路控制著neuroserpin轉(zhuǎn)錄，并推測(cè)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β家族成員之一的AMH，促進(jìn)人工培養(yǎng)神經(jīng)元中neuroserpin的表達(dá)，間接表明了在卵巢以外的組織中可能存在著AMH所作用的受體。本研究發(fā)現(xiàn)AMHR Ⅱ蛋白在大鼠子宮內(nèi)膜中同樣存在著陽性表達(dá)，但是PCOS模型組與對(duì)照組之間的表達(dá)強(qiáng)度并無明顯差異。這在國(guó)內(nèi)是首次觀察到的結(jié)果。我們推測(cè)AMH可能通過AMHR Ⅱ在子宮內(nèi)膜中發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用，而AMHR Ⅱ蛋白的表達(dá)量可能與PCOS導(dǎo)致的相應(yīng)子宮內(nèi)膜的病變無明顯相關(guān)性。但是不同基因背景的小鼠對(duì)DHEA誘導(dǎo)的反應(yīng)存在一定的差異[12]，目前的小鼠模型都只模擬出了PCOS患者的部分臨床表現(xiàn)，集中在生殖方面的缺陷，PCOS的所有臨床特征還沒有在任何一種模型能夠模擬出[13]。而張少娣等[14]研究認(rèn)為除了分型因素導(dǎo)致的差異，不同亞型PCOS的其他臨床生化特征無明顯差異。因此相關(guān)探討仍需較多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

二、AMHRⅡ基因及其甲基化在PCOS中的作用

目前研究發(fā)現(xiàn)人類AMHRⅡ基因總長(zhǎng)度為7.6 kb，位于12號(hào)染色體長(zhǎng)臂，有11個(gè)外顯子。關(guān)于AMHRⅡ基因的研究，Rigon等[15]研究了76例特發(fā)性不孕與100例正常生育的女性，發(fā)現(xiàn)AMHRⅡ基因中-482 A>G、IVS 5-6 C>T、IVS 10+77 A>G、146T>G等位基因序列的多態(tài)性可能與特發(fā)性不孕相關(guān)。Kevenaar等[16]研究發(fā)現(xiàn)，AMHRⅡ基因多態(tài)性與PCOS發(fā)生相關(guān)，但胡蓉等[17]、Sproul等[18]研究則得出與之相反的結(jié)論。

PCOS是遺傳與環(huán)境相互作用的結(jié)果，DNA甲基化是表觀遺傳研究的熱點(diǎn)，那么在PCOS中是否也存在著基因表觀遺傳學(xué)方面的變化呢？因此我們以高雄激素的PCOS的大鼠模型為基礎(chǔ)，研究在AMHRⅡ基因的啟動(dòng)子區(qū)域的某一片段在其血液及卵巢組織樣本中是否存在著甲基化方面的變化，以及這種變化與PCOS的發(fā)病與局部病理變化之間有無相關(guān)關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)在PCOS大鼠與對(duì)照組大鼠的所有血液及卵巢組織樣本中，通過甲基化特異性PCR的方法均檢出了部分甲基化的條帶，兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。我們推測(cè)在PCOS大鼠中，AMHRⅡ基因存在著部分甲基化狀態(tài)，但是這種甲基化狀態(tài)可能與PCOS的發(fā)病與局部卵巢病理變化無明顯相關(guān)關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)只是定性分析了AMHRⅡ基因的甲基化狀態(tài)，下一步需要運(yùn)用重亞硫酸鹽測(cè)序法(BSP)去進(jìn)一步分析，可能得出的結(jié)果會(huì)有所不同，或許會(huì)有更重要的意義。

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[編輯：辛玲]

Expression of anti-müllerian hormone type Ⅱ receptor and its gene methylation in rat model of PCOS

HAO Dong-dong1#，YIN Qian1#，ZHONG Xing-ming2，WEI Xiang-cai1，2*，MIAO Zhu-lin2，WANG Yong-xia2

1.DepartmentofObstetrics&Gynecology，theFirstHospitalAffiliatedtoJinanUniversity，Guangzhou510632 2.FamilyPlanningScience&TechnologyResearchInstituteofGuangdongProvince，Guangzhou510000

Anti-müllerian hormone type Ⅱ receptor；Polycystic ovary syndrome；DNA methylation；Animal model

10.3969/j.issn.1004-3845.2016.09.013

2015-12-10；

2016-01-29

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2009B030801270)；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(10151008010000000)

郝棟棟，女，山東德州人，碩士，住院醫(yī)師，生殖內(nèi)分泌專業(yè)；殷倩，女，湖北黃石人，碩士，住院醫(yī)師，生殖內(nèi)分泌專業(yè).(#共同第一作者；*

，Email：dxcwei@163.com)