周良云，劉談，王升，唐金富，康利平，郭蘭萍

(中國中醫(yī)科學院 中藥資源中心 道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700)

實時熒光定量PCR研究進展及其在中藥領域的應用△

周良云，劉談，王升，唐金富，康利平，郭蘭萍*

(中國中醫(yī)科學院 中藥資源中心 道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700)

實時熒光定量PCR(Real-Time PCR or qRT-PCR)是一種在PCR反應體系中加入熒光物質(zhì)，利用熒光信號對整個PCR進程進行實時監(jiān)測，從而達到對未知起始模板進行定量分析的方法。該技術具有操作簡單、方便快捷、靈敏度高、特異性強、動力學范圍寬、污染率低等優(yōu)點，被廣泛應用于核酸定量等分析中。本文對實時熒光定量的基本原理、定量類型及其在中藥領域中的應用作一綜述。

實時熒光定量PCR；中藥領域；應用

1993年，Higuchi等人將PCR技術和封閉式檢測相結合，對目的核酸數(shù)量進行定量分析，提出了熒光定量PCR技術的概念。1995年美國PE公司成功研制了TaqMan技術，1996年又推出了首臺熒光定量PCR檢測系統(tǒng)，通過檢測每個循環(huán)的熒光強度，并使用Ct值進行分析，達到定量核酸的目的，自此Real-Time PCR技術才得以真正的推廣和應用。到目前為止，實時熒光定量已被廣泛應用于基礎科學研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等科學領域。

1 原理

Real-Time PCR是在PCR反應體系中加入熒光物質(zhì)，利用熒光信號對整個PCR進程進行實時監(jiān)測，從而達到對未知起始模板進行定量分析的目的。它是一種將酶動力學、核酸擴增、光譜分析和實時檢測技術相結合的技術。隨著PCR反應的進行，反應產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光信號，這樣就可以通過熒光信號強度變化實時監(jiān)測PCR產(chǎn)物量的變化，從而得到一條描述PCR動態(tài)進程的曲線，即擴增曲線。

實時熒光定量PCR擴增曲線可以分為4個階段[1]：基線期、早期指數(shù)期、對數(shù)-線性期和平臺期，見圖1。在基線期(通常1～15個循環(huán))，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化；早期指數(shù)期，熒光信號超過背景信號并到達閾值(通常為基線信號標準偏差的10倍[2])，此時循環(huán)數(shù)稱為Ct(Cycle threshold)值或Cp(Crossing point)值[2-3]，Ct值與模板起始濃度的對數(shù)值成反比線性關系，因而Ct值可被用來定量模板起始濃度[2]；對數(shù)-線性期，在理想反應條件下每經(jīng)歷一個循環(huán)，PCR產(chǎn)物加倍；平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計算出起始模板拷貝數(shù)[1-2]。

圖1 實時熒光定量PCR擴增曲線

實時熒光定量PCR能準確地確定初始模板拷貝數(shù)，結果重現(xiàn)性好，誤差小，與常規(guī)PCR在終點定量上相比更具重要意義。實時熒光定量PCR結果不僅可以定性(判斷一段序列的存在與否)，還可定量(確定基因的拷貝數(shù))，而常規(guī)PCR只能做到半定量。另外，實時熒光定量PCR的反應和檢測都是在封閉的反應管中進行的，樣品污染幾率大大降低，無需擴增后的實驗操作，大大節(jié)省了實驗時間，提高了實驗效率[2]。

2 Real-Time PCR定量類型

實時熒光定量分析包括絕對定量和相對定量。絕對定量是對未知樣品絕對拷貝數(shù)進行測定的方法；相對定量不是測定樣品的絕對拷貝數(shù)，而是比較樣品之間同一目的基因的相對表達量，以期分析樣品之間目的基因的表達差異。

2.1 絕對定量

絕對定量是使用一系列已知濃度(通常為5～6個梯度稀釋的濃度)的標準品繪制標準曲線，建立Ct值與起始模板量[總核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)]的對數(shù)值之間的線性關系，達到對未知樣品絕對的定量。

標準曲線的繪制首先是標準品的選擇，標準品可以是DNA(重組質(zhì)粒DNA、基因組DNA、純化的RT-PCR產(chǎn)物及合成的寡核苷酸DNA[5-7])或RNA(體外轉(zhuǎn)錄RNA[5，8-10])。但是為了保持與待測樣品間擴增效率的一致性，標準品應盡量選擇與待測樣品結構近似的樣品，該方法要求梯度稀釋的標準品都必須與待測樣品同時平行擴增，且待測樣品濃度應包含在已知標準品濃度范圍之內(nèi)。

2.2 相對定量

相對定量解析方法相對復雜，一般用于基因表達分析。根據(jù)選用的標準不同可分為以質(zhì)量單位為標準的相對定量和以內(nèi)參基因為標準的相對定量。以質(zhì)量單位(細胞的數(shù)目或核酸的微克數(shù))作為標準的相對定量優(yōu)點是實驗設計概念簡單，數(shù)據(jù)分析處理簡單易學，缺點是很難準確量化初始材料；而以內(nèi)參基因作為標準的相對定量優(yōu)點是能準確量化初始材料的載量，尤其當初始材料受限時，進行相對表達分析十分方便。缺點是要求得到一個或多個在所有待測樣本中恒定表達的內(nèi)參基因。目前，使用較多的是以內(nèi)參基因作為標準的定量方法。

2.2.1 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評價 為了確保定量結果的可靠性和準確性，在qRT-PCR中需選擇合適的內(nèi)參基因?qū)Σ煌瑯悠分g因質(zhì)量、RNA的提取效率以及反轉(zhuǎn)錄效率不同所產(chǎn)生的差異進行校正，從而實現(xiàn)對不同樣品中RNA的定量和數(shù)據(jù)歸一化[11-12]。理想的內(nèi)參基因應滿足以下條件：1)在不同發(fā)育階段和不同組織器官中表達穩(wěn)定[11]；2)表達不受生物學、實驗條件的影響[13]；3)其穩(wěn)定的表達水平與目的基因表達水平相近[10]。在植物qRT-PCR研究中用的最多的內(nèi)參基因通常是看家基因(housekeeping genes)，然而越來越多的研究表明，看家基因在不同類型細胞和不同生理狀態(tài)下的表達并不是恒定不變的[11，14]，若盲目選擇看家基因作為內(nèi)參，可能會導致基因表達分析結果不準確，甚至得到相反的或者錯誤的結論[15]。因此選擇合適的、穩(wěn)定的內(nèi)參用于基因表達的差異分析非常關鍵。目前，geNorm[13]、NormFinder[16]、BestKeeper[17]、Delta CT[18]等分析方法被廣泛用于內(nèi)參基因的篩選與評價[19-21]。Xie等[22]將上述4種方法整合成一個在線的分析工具—RefFinder，用于各種實驗條件下內(nèi)參的篩選，避免了單個分析方法的片面性。

2.2.2 引物的特異性及擴增效率的檢測 為了使結果準確可靠，qRT-PCR中還要求引物的特異性好，擴增效率接近100%。劉正霞等[23]研究顯示，引物的特異性和擴增效率對定量PCR結果分析有顯著影響。

引物的特異性評估：引物的特異性可以通過凝膠電泳、PCR產(chǎn)物克隆測序以及qRT-PCR的熔解曲線來檢查。凝膠電泳的條帶若為單一條帶，則說明PCR產(chǎn)物特異性好，若有多條則說明特異性差，需要優(yōu)化PCR反應條件和體系或重新設計引物；PCR產(chǎn)物克隆測序結果在去除載體序列后與原序列進行比對，分析測得的序列是否位于上下游引物之間；在qRT-PCR中，可以通過熔解曲線來判斷引物的特異性，若熔解曲線為單峰則說明引物的特異性好。通過上述3種方法均可以對設計的引物進行特異性檢測，以便篩選特異性較好的引物進行后續(xù)實驗。

擴增效率的計算：相對定量結果的準確性還受到目的基因和內(nèi)參基因的PCR擴增效率影響。一般來說，擴增效率接近100%是優(yōu)化實驗使得結果重復性好且可靠的最好標志。實際操作時，反應的擴增效率應該在90%～105%之間，如果擴增效率低，可能原因是引物設計不佳，或是反應的條件沒有優(yōu)化；擴增效率大于100%時，可能的原因有非特異性產(chǎn)物擴增，如引物二聚體、錯配等引起的PCR產(chǎn)物產(chǎn)生。

傳統(tǒng)計算擴增效率的方法[6]是將已知模板稀釋成一系列梯度濃度(不少于5個點)，并進行實時熒光定量PCR實驗，利用拷貝數(shù)的對數(shù)值和Ct值建立標準曲線。評價標準曲線的優(yōu)劣有兩個指標，相關系數(shù)(r)和斜率。相關系數(shù)反映標準曲線的直線性，越接近1說明直線性越好，定量越精確；斜率與擴增效率相關，計算公式：擴增效率(E)=10(-1/斜率)-1。在PCR過程中，擴增效率在指數(shù)期相對穩(wěn)定，但是隨著循環(huán)數(shù)的增加，Taq酶、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、引物，甚至DNA模板等各種PCR要素逐漸不敷需求，擴增效率也就越來越趨向于0。通過標準曲線得出的擴增效率不能反映PCR進程中擴增效率的變化。由于PCR結果往往是通過Ct值來計算的，由擴增效率引起的最終差異只能反映在Ct值上的變化[24]。為了減小這種情況引起的誤差，在定量時確保各樣品濃度值在一系列梯度濃度的范圍內(nèi)，即Ct值在標準曲線范圍內(nèi)。此外，尚有根據(jù)PCR進程中的原始數(shù)據(jù)或擴增曲線的形狀，再基于不同的數(shù)學算法開發(fā)出來的一些軟件來計算擴增效率的[25-27]。這些算法或軟件使得擴增效率的計算更加簡單易行，特別是對于那些表達量很低的基因很難通過一系列的梯度稀釋來求擴增效率。該方法缺點是不同軟件基于的算法不同，因此各軟件得到的結果也有差異；噪音導致可用的數(shù)據(jù)點很有限，計算的擴增效率也就不精確。

2.2.3 數(shù)據(jù)處理方法 對于不同的實驗需求，我們可以采用不同的方法進行實驗設計和數(shù)據(jù)分析，在這里只討論以內(nèi)參基因為標準的相對定量方法。常用的方法有雙標準曲線法、2-△△Ct法、用參照基因的△Ct法和Pfaffi法，應用每種方法必須對應適應的條件。

雙標準曲線法[28]：首先分別對目的基因和看家基因的5個(盡量不少于5個點)濃度梯度稀釋的標準品制作兩條標準曲線。各待測樣品與標準品同時進行反應，得到目的基因的Ct值，分別代入目的基因的標準曲線，得到看家基因的Ct值，分別代入看家基因的標準曲線，這樣就可以換算出各待測樣品目的基因和看家基因的起始模板量。其次，利用內(nèi)參對各待測樣品進行歸一化，即用目的基因的定量結果除以看家基因的定量結果。最后對不同樣品之間目的基因的表達量進行比較，通常將對照樣品的表達量作為1，計算出相對量，再進行樣品間相對量比較。

2-△△Ct(Livak)法[29]：2-△△Ct法是定量PCR實驗中分析基因表達相對變化的一種簡便方法，但條件是目的基因和內(nèi)參基因擴增效率都接近100%，且相互間效率偏差在5%以內(nèi)，否則會產(chǎn)生較大的誤差[30]。使用2-△△Ct法之前，必須驗證目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率。其操作步驟如下：首先，對所有的待測樣品和對照樣品，用內(nèi)參基因的Ct值歸一化目的基因的Ct值：△Ct=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)；其次，用對照樣品的△Ct值歸一化待測樣品的△Ct值：△△Ct=△Ct(待測樣品)-△Ct(對照樣品)；最后，計算表達水平比率：表達量的比值=2-△△Ct。如果目的基因和內(nèi)參基因有同樣的擴增效率，但是擴增效率不等于2，那么2-△△Ct法的公式可以修正為用實際擴增效率值代替等式中的2。如果目的基因和內(nèi)參基因擴增效率不相近，可以優(yōu)化或重新設計實驗。

用參照基因的△Ct法：用參照基因的△Ct法是2-△△Ct法的一種變化形式，它更容易掌握且結果相同。與2-△△Ct得到的△Ct值相比，△Ct法是每個樣本之間參照基因與目的基因的Ct值的差值。雖然這種方法的操作步驟簡單，但同樣也能真實衡量基因表達水平，將參照基因的表達水平計算在內(nèi)。結果顯示，主要的差異是校準樣本的表達水平不是1。如果用這個方法得到的表達值除以所選的校準樣本的表達值，計算結果與2-△△Ct法的結果正好相同，即表達量的比值=2(△Ct(內(nèi)參基因)-△Ct(目的基因))

Pfaffi法[31]：當目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率相近時，用2-△△Ct法定量相對基因表達是最合適的方法，但是如果兩個擴增子擴增效率不同，必須選擇另一種方法來確定不同樣本之間目的基因的相對表達量。Pfaffi法則是目前最好的選擇方法，計算公式為：

表達量的比值=C(A-E)/D(F-B)(C和D分別是目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率；A和E分別是對照樣品和待測樣品中目的基因的Ct值；F和B分別是待測樣品和對照樣品中內(nèi)參基因的Ct值)。

2.2.4 歸一化 歸一化是對所有樣品之間的差異進行校正。不同的樣品，即使反應時使用相同量的總RNA，但因細胞來源不同，RNA總表達量并非一致。因此僅僅將反應時RNA量統(tǒng)一，起始的細胞數(shù)也不一定相同。其實在進行表達量分析時，比較的是相同數(shù)量細胞中的某個基因拷貝數(shù)目。實際上要將樣品材料統(tǒng)一到相同細胞數(shù)提取是非常困難的，同時還不能保證RNA提取效率、反轉(zhuǎn)錄效率以及PCR擴增效率完全相同?；谏鲜鲈?，在進行表達量分析時，有必要選擇內(nèi)參基因?qū)λ袠悠愤M行歸一化處理，以獲得目的基因特異性表達的真正差異。

篩選出穩(wěn)定的內(nèi)參基因后，先對目的基因歸一化處理，然后進行表達差異分析。目前進行歸一化分析的方法有兩種：單基因歸一化和多基因歸一化。

實時熒光定量最早被用于基因表達差異分析時，大多文獻報道都是以單個基因作為內(nèi)參基因，對目的基因的表達量進行歸一化[29，32-33]。然而，基于單一內(nèi)參基因進行歸一化存在許多缺點，可能導致比較大的誤差。因此，多個看家基因[15，20]開始被應用于歸一化分析中。

3 在中藥領域中的應用

3.1 基因表達分析

熒光定量PCR最普遍的應用是基因表達分析。從基礎科學研究到實際應用，檢測基因表達都是基本的也是很重要的一項工作。Olofsson等[34]對黃花蒿不同組織中萜類代謝途徑上的基因進行表達差異分析，為評估青蒿素的前體對青蒿素產(chǎn)量的影響提供科學參考。植物在生物和非生物脅迫下，基因表達水平的相對變化與次生代謝產(chǎn)物累積相關性的研究越來越受到科研工作者的青睞。如Cheng等[35]用YE、Ag+和MeJA 3種誘導子組合誘導丹參毛狀根。結果發(fā)現(xiàn)，在處理24、36 h后，SmCPS的表達量顯著上調(diào)，次生代謝產(chǎn)物隱丹參酮和二氫丹參酮Ⅰ的含量也隨之顯著上升，這表明丹參酮類化合物含量的升高可能與SmCPS基因表達量的上調(diào)有關。在植物的不同發(fā)育階段，其次生代謝產(chǎn)物的累積量及基因的表達水平也會不同。如Kim等[36]對人參在葉片不同開放期(閉合階段、中間階段、全開放階段)其體內(nèi)人參皂苷及生物合成途徑上的關鍵酶基因進行檢測。結果顯示，在中間階段和全開放階段人參皂苷生物合成途徑上的酶基因PgSS和PgSE的表達量比閉合階段增加約1.5倍，PgDDS的表達量則增加4倍以上；主根和側根中，人參皂苷的含量在葉片開放的中間階段達到最大值，而葉片中人參皂苷的含量在全開放階段達到最高。此外，實時熒光定量的差異表達分析在中藥領域得到廣泛應用，如在甘草[37]、黃花蒿[38-40]等藥用植物中都有大量的研究。

3.2 中藥品種及真?zhèn)舞b別

中藥的真?zhèn)沃苯佑绊懪R床用藥的準確性和中藥的質(zhì)量，因此對于中藥品種真?zhèn)蔚蔫b別歷來是中藥研究中極為重要的工作。

Xue等[41]依據(jù)骨碎補的正品及其混淆品trnL-trnF間隔序列，設計Scorpion探針，通過實時熒光定量對骨碎補的真?zhèn)芜M行鑒別，同時對多個混合樣品(正品中加入一種混淆品，按一定比例梯度混合)建立標準曲線，以分析正品中混淆品的摻入量。另外，Xue等[42]基于升麻及其替代品之間內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列的長度、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)含量的差異，采用LightCycler定量儀擴增升麻及其替代品的ITS序列，并分析各產(chǎn)物的熔解曲線。通過解鏈溫度的差異區(qū)分鑒別升麻及其替代品，為快速、穩(wěn)定鑒別升麻及其替代品建立了標準。董玉茹等[43]將限制性內(nèi)切酶引入熔解曲線分析中，建立了一種新的單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型方法，成功實現(xiàn)了對金銀花與山銀花、白術與蒼術品種及真?zhèn)蔚蔫b別。此外，有研究者[44-45]基于實時熒光定量PCR技術，分別對鐵皮石斛近緣種冒充鐵皮石斛以及三七粉摻假等現(xiàn)象建立快速的檢測方法。

4 小結

植物在生長、發(fā)育及受外界環(huán)境刺激等過程中，其基因在不同時空的表達存在著很大差異。對基因的表達量進行差異分析，是了解生物體生長、發(fā)育和調(diào)控等機理的一個重要內(nèi)容。Northern雜交、Southern雜交和原位雜交等都可以用來進行目的基因的定量分析，但這些方法耗時且敏感性較差。普通PCR終點定量的缺陷是擴增出來的DNA產(chǎn)物需要通過瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠(EB)染色后才可以顯示出來，這些步驟耗時且不易精確定量。此外，由于酶動力學的特點，在PCR反應進程中有基線期、早期指數(shù)期、對數(shù)-線性期和平臺期，理論上來說，所有樣本的DNA擴增量最后是相同的，但實際上，不同樣本的平臺期是不一樣的。在這種情況下，通過終點定量分析，反而將反應效率中很小的差別放大出來，造成定量的不準確。實時熒光定量為起始定量，誤差相對較小，這使其在定量方面得到快速的發(fā)展。PCR產(chǎn)物長度或組成不同，其熔解曲線(熔鏈溫度)也存在差異，因此可根據(jù)熔解曲線的差異進行物種的鑒別。中藥鑒定要解決其中一個很重要的問題就是真?zhèn)?。實驗過程中，我們可通過設計特異性引物來擴增不同的樣品，從而得到不同的PCR產(chǎn)物，再根據(jù)相應的熔解曲線鑒定中藥材的真?zhèn)魏蛽絺蔚闹兴幉摹４送?，實時熒光定量PCR還可廣泛用于等位基因分析及轉(zhuǎn)基因生物檢測等。

實時熒光定量PCR自建立以來，發(fā)展迅速、應用廣泛，擁有許多優(yōu)點。近年來，許多科研工作者基于實時熒光定量PCR的基本原理對其進行不斷地研究和改進，使實時熒光定量PCR得到了進一步的完善[46]。隨著實時熒光定量PCR的不斷標準化，該技術將在生物學、醫(yī)學基礎研究等科研領域中得到更加廣泛的推廣與應用。

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Real-TimePCRandItsApplicationinStudyofTraditionalChineseMedicine(TCM)

ZHOULiangyun，LIUTan，WANGSheng，TANGJinfu，KANGLiping，GUOLanping*

(StateKeyLaboratoryBreedingBaseofDao-diHerbs，NationalResourceCenterforChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China)

Real-time PCR is a quantitative analysis method of initial template，which real-time monitors the whole PCR reaction by adding fluorescent substance into PCR reaction system to detect the fluorescence signal.Due to its advantages of simple operation，convenient and efficient，tremendous sensitivity，highly sequence-specific，a large dynamic range and low pollution，Real-time PCR has become one of the most widely used methods of nucleic acid quantitation and so on.This review discusses the theory，types of quantitation and its application in detailed TCM study.

Real-Time PCR；TCM study；application

2015-05-25)

國家自然科學基金(81130070，81325023，81473307)；國家科技支撐項目(2012BAI29B02，2012BAI28B002)

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郭蘭萍，研究員，研究方向：中藥資源生態(tài)學及道地藥材形成的環(huán)境機制研究；Tel：(010)64011944，E-mail：glp01@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.2.027