趙巍，胡琴，馬林，秦海林*

(1.北京市藥品檢驗(yàn)所 北京市保健食品化妝品檢驗(yàn)中心，北京 102206；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥物研究所 天然藥物活性物質(zhì)與功能?chē)?guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

·基礎(chǔ)研究·

草麻黃莖中一個(gè)黃酮苷的NMR數(shù)據(jù)歸屬及活性研究

趙巍1，2，胡琴1，馬林2，秦海林2*

(1.北京市藥品檢驗(yàn)所 北京市保健食品化妝品檢驗(yàn)中心，北京 102206；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥物研究所 天然藥物活性物質(zhì)與功能?chē)?guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

目的：對(duì)化合物3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-7-O-β-D-吡喃葡萄糖基山柰酚進(jìn)行DMSO-d6中核磁共振波譜數(shù)據(jù)歸屬并對(duì)其活性進(jìn)行研究。方法：利用溶劑提取法和硅膠柱色譜法對(duì)草麻黃莖中的化學(xué)成分進(jìn)行分離，得到一個(gè)黃酮糖苷類化合物；本文選用DMSO-d6為溶劑，采用一維和二維核磁共振(1D和2D NMR)技術(shù)完成了其1H-和13C-NMR化學(xué)位移的全歸屬。通過(guò)降血脂細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)與具有較強(qiáng)降脂能力的陽(yáng)性對(duì)照相比進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果：通過(guò)波譜分析鑒定其結(jié)構(gòu)為3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-7-O-β-D-吡喃葡萄糖基山柰酚，該化合物對(duì)三酰甘油有明顯的抑制作用。結(jié)論：本研究獲得了分辨比較清晰的β-D-吡喃葡萄糖基和α-L-吡喃鼠李糖基的1H-NMR信號(hào)，發(fā)現(xiàn)該化合物與陽(yáng)性對(duì)照物比較對(duì)三酰甘油有明顯的抑制作用，本文首次報(bào)道了其藥理活性。

草麻黃；3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-7-O-β-D-吡喃葡萄糖基山柰酚；NMR數(shù)據(jù)歸屬；DMSO-d6；降脂活性

草麻黃是中藥麻黃的基原植物之一，為麻黃科Ephedraceae麻黃屬植物草麻黃EphedrasinicaStapf的干燥草質(zhì)莖，主要分布于遼寧、吉林、內(nèi)蒙古、河北、山西、河南西北部及陜西等省區(qū)，有發(fā)汗、散寒、平喘、利水的功效，中醫(yī)用于治療風(fēng)寒感冒、咳喘、支氣管哮喘、水腫等癥[1]。在對(duì)包括草麻黃在內(nèi)的麻黃屬植物的化學(xué)成分研究方面，已報(bào)道了苯異丙胺生物堿、N-取代乙酰胺糖苷、黃酮類化合物和有機(jī)酸等多類成分[2-5]。在我們深入研究草麻黃的化學(xué)成分過(guò)程中，又得到了一個(gè)黃酮類化合物，通過(guò)波譜分析鑒定其結(jié)構(gòu)為3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-7-O-β-D-吡喃葡萄糖基山柰酚。已有文獻(xiàn)報(bào)道了其以氘代甲醇為溶劑的核磁共振波譜數(shù)據(jù)，但報(bào)道的數(shù)據(jù)中存在糖單元信號(hào)分辨不清的問(wèn)題[6]。因此，本文選用DMSO-d6為溶劑，測(cè)定了該化合物的1H 和13C-NMR圖譜，并采用二維核磁共振(2D NMR)技術(shù)完成了其1H和13C-NMR化學(xué)位移的全歸屬。特別是采用1D TOCSY實(shí)驗(yàn)對(duì)β-D-吡喃葡萄糖基和α-L-吡喃鼠李糖基的1H-NMR信號(hào)的偶合常數(shù)進(jìn)行了補(bǔ)充。此外，本文還采用降脂細(xì)胞模型評(píng)價(jià)了3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-7-O-β-D-吡喃葡萄糖基山柰酚對(duì)血脂的影響，結(jié)果表明該化合物對(duì)三酰甘油(TG)的抑制率明顯高于陽(yáng)性藥物的抑制率。

1 儀器與試藥

Q-STAR型質(zhì)譜儀，Bruker Avance-Ⅲ-600型核磁共振波譜儀；柱色譜硅膠(200～300目)和薄層色譜用硅膠GF254均為青島海洋化工廠產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

實(shí)驗(yàn)藥材購(gòu)于安徽亳州藥材市場(chǎng)，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所馬林副研究員鑒定為麻黃科麻黃屬植物草麻黃EphedrasinicaStapf的干燥草質(zhì)莖。

對(duì)照藥物：羅格列酮(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)。HepG2細(xì)胞(美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù))。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取與分離

取草麻黃的干燥草質(zhì)莖30 kg，用80%乙醇回流提取3次，每次加熱回流時(shí)間分別為2、1、1 h；合并提取液，減壓濃縮后得到提取粗浸膏(4.2 kg)。將此粗浸膏與800 mL蒸餾水和1300 mL 80%乙醇水溶液混懸，先連續(xù)用石油醚和乙酸乙酯萃取，繼用正丁醇萃取，減壓回收溶劑后得到正丁醇萃取物(67 g)，該萃取物用200～300目硅膠柱色譜分離，用三氯甲烷-甲醇混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫(100∶0-100∶1-50∶1-25∶1-15∶1-10∶1-5∶1-3∶1-1∶1-0∶1)分離，得到不同的部分。將三氯甲烷-甲醇(5∶1-3∶1)洗脫部分，再進(jìn)行硅膠柱色譜分離，三氯甲烷-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫(5∶1)，得到化合物1(8 mg)。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1為黃色粉末，負(fù)離子模式ESIMS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z593.4 [M-H]-。在1H-NMR 譜中，芳香區(qū)顯示典型的苯環(huán)AA′BB′偶合系統(tǒng)質(zhì)子共振峰δ 7.73 (2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)和6.90 (2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，5′)以及典型的1、2、3、5四取代的苯環(huán)質(zhì)子共振峰δ 7.73 (1H，d，J=1、8 Hz，H-8)和6.43 (1H，d，J=1.8 Hz，H-6)信號(hào)。結(jié)合在1H-NMR譜上沒(méi)有黃酮類化合物H-3的信號(hào)，但顯示有兩個(gè)酚羥基信號(hào)δ 12.61 (1H，s，OH-5)和10.26 (1H，s，OH-4′)，可以確定化合物1為4′、3、5、7-四氧取代的黃酮醇類化合物。在HSQC譜上，上述兩個(gè)羥基質(zhì)子均沒(méi)有與任何碳信號(hào)相關(guān)，進(jìn)一步確證了其為酚羥基。在1H-NMR譜上還給出兩個(gè)糖端基質(zhì)子信號(hào)δ 5.23 (1H，br s，H-1″)和4.98 (1H，d，J=7.2 Hz，H-1?)，以及一個(gè)與次甲基相連的甲基質(zhì)子信號(hào)δ 0.74 (3H，d，J=6.0 Hz，6″-CH3)，結(jié)合在δ 3.11～3.96共有10個(gè)質(zhì)子的多重峰，可以確定化合物1含1個(gè)六碳糖和1個(gè)6-去氧六碳糖。通過(guò)1D TOCSY實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確確定了兩個(gè)糖的各個(gè)質(zhì)子的1H-NMR共振峰，各共振峰的偶合常數(shù)見(jiàn)表1。因此，根據(jù)偶合常數(shù)可以明確確定一個(gè)糖為β-吡喃葡萄糖，另一個(gè)為α-吡喃鼠李糖。在13C-NMR 譜中共有27個(gè)碳信號(hào)，結(jié)合HSQC實(shí)驗(yàn)，將其分類為1個(gè)羰基、8個(gè)不連氫芳香碳、16個(gè)次甲基、1個(gè)亞甲基和1個(gè)甲基；這些數(shù)據(jù)與1H-NMR數(shù)據(jù)完全對(duì)應(yīng)。因此，通過(guò)HMBC實(shí)驗(yàn)中H-6與C-5、C-7、C-8、C-10，H-8與C-6、C-7、C-9、C-10，H-2′/6′與C-2、C-1′、C-3′/5′、C-4′，以及H-3′/5′與C-1′、C-2′/6′、C-4′有遠(yuǎn)程碳?xì)湎嚓P(guān)，可以確定化合物1的黃酮醇母核為山柰酚。特別是通過(guò)HMBC實(shí)驗(yàn)中葡萄糖基的端基質(zhì)子信號(hào)與C-7的遠(yuǎn)程相關(guān)以及鼠李糖基端基質(zhì)子的信號(hào)與C-3的遠(yuǎn)程相關(guān)可以明確確定葡萄糖基與C-7相連，而鼠李糖基與C-3相連(見(jiàn)圖1)。在IDNOE差譜中，通過(guò)照射δH4.98的氫核，發(fā)現(xiàn)δH6.73(H-8)出現(xiàn)增益，進(jìn)一步證實(shí)葡萄糖基連在7位。因此化合物1的結(jié)構(gòu)確定為3-O-α-吡喃鼠李糖基-7-O-β-吡喃葡萄糖基山柰酚，其1H和13C-NMR數(shù)據(jù)歸屬見(jiàn)表1。

2.3 藥理活性

相關(guān)文獻(xiàn)表明黃酮類化合物具有降脂活性，為此采用降脂細(xì)胞模型進(jìn)行研究。取0.25 mmol·L-1油酸(OA)刺激HepG2肝癌細(xì)胞，24 h后能夠?qū)е录?xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積，接種于96孔板中，培養(yǎng)條件37 ℃，5% CO2。每孔100 μL培養(yǎng)基，設(shè)置不含細(xì)胞的對(duì)照孔，分別加入對(duì)照物羅格列酮10-5mmol·L-1和篩選物10-5、10-6mmol·L-1，孵育24 h后測(cè)定胞內(nèi)TG水平。結(jié)果顯示，篩選物能夠使胞內(nèi)TG分別降低23.9%和16.2%，陽(yáng)性藥能夠使TG降低14.9%。表明同一濃度和低濃度下，篩選物對(duì)TG的抑制率明顯高于陽(yáng)性藥物的抑制率。

表 1 化合物1的1H (600 MHz，DMSO-d6) 和 13C (150 MHz，DMSO-d6) NMR 數(shù)據(jù)

注：A.化學(xué)結(jié)構(gòu)；B.HMBC相關(guān)。圖1 化合物1的結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵的HMBC相關(guān)(H→C)

圖2 篩選物與對(duì)照物對(duì)TG的抑制率

3 討論

已有文獻(xiàn)報(bào)道了3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-7-O-β-D-吡喃葡萄糖基山柰酚以氘代甲醇為溶劑的核磁共振波譜數(shù)據(jù)，但報(bào)道的數(shù)據(jù)中存在糖單元信號(hào)分辨不清的問(wèn)題。本研究選用DMSO-d6為溶劑，采用一維和二維核磁共振(1D和2D NMR)技術(shù)完成了其1H和13C-NMR化學(xué)位移的全歸屬，并獲得了分辨比較清晰的β-D-吡喃葡萄糖基和α-L-吡喃鼠李糖基的1H-NMR信號(hào)。此外，發(fā)現(xiàn)該化合物與陽(yáng)性對(duì)照物比較，對(duì)TG有明顯的抑制作用，本文首次報(bào)道了其藥理活性，上述研究對(duì)于麻黃植物的基礎(chǔ)研究具有積極意義。

[1] 肖培根.新編中藥志：第三卷[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001：297.

[2] 丁麗麗，施松善，崔健，等. 麻黃化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志,2006,31(20):1661-1664.

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[4] Zhang D，Deng A J，Ma L，et al.N-Substituted Acetamide Glycosides from the Stems ofEphedrasinica[J].Phytochem Lett，2015，12：320-327.

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AssignmentofNMRDataofaFlavonolGlycosidefromEphedrasinicaandActivityStudy

ZHAOWei1，2，HUQin1，MALin2，QINHailin2*

(1.BeijingInstituteforDrugControl，BeijingCenterforHealthandCosmeticsControl，Beijing102206，China；2.StateKeyLaboratoryofBioactiveSubstanceandFunctionofNaturalMedicines，InstituteofMateriaMedica，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing100050，China)

Objective：To obtain clear nuclear magnetic spectrum signals of 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranosylkaempferol and study its activity.Methods：One glycoside of flavonoid was isolated from the stems ofEphedrasinicaby solvent extraction and column chromatographies over silica gel.Results：The structure of this compound was elucidated to be 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranosylkaempferol，and the full assignment of the NMR data in DMSO-d6was accomplished through 1D and 2D NMR techniques.Conclusion：The compound is found to have hypolipidemic activity for the first time.

Ephedrasinica；3-O-α-L-rhamnopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranosylkaempferol；structure identification；DMSO-d6；hypolipidemic activity

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.11.012

2015-10-16)

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秦海林，研究員，研究方向：藥物化學(xué)；E-mail：qinhailin@imm.ac.cn