高旦，劉葉，惠小維，包海鷹

(吉林農業(yè)大學 中藥材學院，吉林 長春 130118)

側柏葉烏發(fā)活性成分探究△

高旦，劉葉，惠小維，包海鷹*

(吉林農業(yè)大學 中藥材學院，吉林 長春 130118)

目的：研究側柏葉CacluneuPlatycladi的主要化學成分對酪氨酸酶活性的影響，從而確定側柏葉烏發(fā)作用的有效組分。方法：通過提取得到側柏葉所含的揮發(fā)油、總黃酮、鞣質以及樹脂，采用蘑菇酪氨酸酶速率氧化法體外測定酪氨酸酶活性。結果：揮發(fā)油、鞣質均表現為輕度的抑制作用，而總黃酮則表現較強的抑制作用，樹脂表現出較強的激活作用。結論：側柏葉中具有烏發(fā)作用的活性組分可能是樹脂。

側柏葉；側柏葉化學成分；酪氨酸酶活性

側柏葉(Platycladi cacumen)又名叢柏葉，是側柏的干燥嫩枝梢及葉。中醫(yī)認為側柏葉氣清香，味苦澀，性寒，歸肺、肝、脾經。具有涼血止血、化痰止咳，生發(fā)烏發(fā)之功。用于吐血，魈血，咯血，便血，崩漏下血，肺熱咳嗽，血熱脫發(fā)，須發(fā)早白[1]。

明代李時珍《本草綱目》中記載側柏葉“乃多壽之木，所以可以入服食。道家以之點湯常飲?！眰劝厝~作為傳統(tǒng)的中藥，其烏發(fā)功能一直被人忽略。而在諸多古代文獻中記載其主要功能為烏發(fā)和生發(fā)，在《本草綱目》中謂其：浸油，生發(fā)，燒汁，黑發(fā)。和豬脂，沐發(fā)長黑。然而側柏葉烏發(fā)的機理尚不明確[2]。

白發(fā)的病因與發(fā)病機理復雜，現代醫(yī)學研究認為，可能與遺傳、衰老、疾病等導致的黑素干細胞衰老、黑素細胞減少等有關，機制包括bcl-2基因缺失、氧化損傷、氧化應激、微量元素缺乏等。其中，酪氨酸酶(tyrosinase)表達量減少或活性降低是一個重要的因素[3-4]。酪氨酸酶是體內黑素合成的主要限速酶，酪氨酸酶活性降低將使體內黑素合成的反應進行得十分緩慢[5]。目前研究表明，側柏葉主要含有黃酮、揮發(fā)油、鞣質、樹脂、微量元素等化學成分[2]，本實驗選側柏葉的主要化學成分進行研究，考察側柏葉是否通過某種化學成分直接激活酪氨酸酶的催化活性而促進黑色素的形成，為進一步研究側柏葉的烏發(fā)機理提供參考依據。

1 材料與儀器

1.1 藥品

側柏葉購自山東省濟寧市側柏種植基地，經吉林農業(yè)大學中藥材學院包海鷹教授鑒定為側柏Platycladusorientalis(L.)Franco的干燥枝梢和葉。

1.2 試劑

蘑菇酪氨酸酶(tyrosinase)、L-多巴(L-Dopa)均購自美國Sigma公司；磷酸酶氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙醇、石油醚、乙酸乙酯均為分析純。

1.3 儀器

721型分光光度計(上海第三儀器分析廠)。

2 方法與結果

2.1 磷酸緩沖溶液(PBS)的配制

稱取0.2 mol·mL-1磷酸二氫鈉溶液250 mL，加0.2 mol·mL-1的氫氧化鈉溶液118 mL，用水稀釋至1000 mL，定容，即得。

2.2 酪氨酸酶溶液的配制

稱取13.28 g(25 KU)蘑菇酪氨酸酶(1881 U·mg-1)，用PBS定容至25 mL，即1 KU·mL-1，分裝-20 ℃保存，臨用時室溫平衡，即得，稀釋至實驗所需濃度143 U·mL-1。

2.3 L-多巴溶液的配制

精密稱取197.19 mg L-多巴，用PBS溶液定容至100 mL，須現用現配，濃度為197.19 g·mol-1。

2.4 側柏葉中總黃酮的提取

稱取側柏葉2.5 kg，用65%乙醇回流提取2次，提取時間1.5 h，每次料液比1∶15，合并提取液，離心取上清液，濃縮干燥得浸膏，在室溫下干燥，備用。取部分干燥后的乙醇提取物，加一定量的蒸餾水稀釋，依次用石油醚、乙酸乙酯進行萃取，用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮，在室溫下干燥，備用。稱取部分乙酸乙酯萃取物，用10%乙醇溶解，離心(3000 r·min-1)，用AB-8大孔吸附樹脂進行純化，得到的純化產物置于干燥器中保存?zhèn)溆?，即為側柏葉中的總黃酮。

2.5 側柏葉中揮發(fā)油的提取

稱取新鮮的側柏葉2.5 kg，用石油醚(30～60 ℃)進行回流提取，提取時間3 h，料液比1∶12.5，合并提取液濃縮，干燥。取干燥后的適量提取物，放入揮發(fā)油提取器中，用水蒸氣蒸餾法進行提取，得黃色透明液體1.2 g。

2.6 側柏葉中樹脂的提取

按照上述揮發(fā)油的提取工藝，提取揮發(fā)油后剩余的提取液，干燥濃縮，即為側柏葉中的樹脂成分。

2.7 側柏葉中鞣質的提取

稱取新鮮的側柏葉2.5 kg，用65%的含水丙酮在室溫下高速攪碎機內破碎成勻漿狀，甩濾，反復操作3次，合并濾液，減壓濃縮，得到粗的總鞣質。

2.8側柏葉中主要化學成分對酪氨酸酶活性的影響

將上述提取所得到的主要化學成分用適量二甲基亞砜溶解，然后用PBS定容，制成濃度分別為10、20、30 mg·mL-1的3個濃度梯度。以L-多巴溶液為底物，在3 mL的PBS的測活體系中，先加入0.1 mL不同濃度的提取物于比色杯中，再加入2.8 mL預先在37 ℃恒溫水浴保溫的底物溶液，然后加入0.1 mL蘑菇酪氨酸酶溶液，立刻混勻，在37 ℃恒溫條件下測定波長為475 nm的吸光度值[6]。

根據在475 nm下的吸光度值，計算側柏葉的主要化學成分對酪氨酸酶的激活率(%)，并將酶活性激活率(%)達到50%時激活劑的濃度測定為IC50值。同時以不加樣品的測活體系為空白對照。激活率(%)可以根據下式進行：

激活率=[(C-D)-(A-B)]/(A-B)

其中：A=A475-藥+酶；B=A475-藥-酶；

C=A475+藥+酶；D=A475+藥-酶

2.9 數據分析

側柏葉中揮發(fā)油、總黃酮、總鞣質、樹脂對酪氨酸酶活性的影響見表1～4。

表1 側柏葉中揮發(fā)油對酪氨酸酶活性的影響

表2 側柏葉中總黃酮對酪氨酸酶活性的影響

表3 側柏葉中總鞣質對酪氨酸酶活性的影響

表4 側柏葉中樹脂對酪氨酸酶活性的影響

由表1可知，側柏葉中的揮發(fā)油對酪氨酸酶有輕度的抑制作用，并且抑制作用隨著濃度增大有逐漸增大的趨勢。

由表2可知，側柏葉中的總黃酮對酪氨酸酶有顯著抑制作用，并且在藥物濃度達到30 mg·mL-1時，抑制率達113.34%，與陳興芬報道的側柏葉中總黃酮對酪氨酸酶的抑制作用隨黃酮濃度的增大而增大基本一致[2]。由表3可知，側柏葉中的鞣質對酪氨酸酶也有輕度的抑制作用。由表4可知，側柏葉中的樹脂對酪氨酸酶有顯著的激活作用，在藥物濃度達到30 mg·mL-1時，激活率達102.13%，這與《本草綱目》中“浸油，生發(fā)，燒汁，黑發(fā)。和豬脂，沐發(fā)長黑”的記載不謀而合。

3 討論

側柏葉中的樹脂類成分對酪氨酸酶有顯著的激活作用，可能是側柏葉一直作為烏發(fā)中藥的活性成分，但其活性單體成分有待進一步探究。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：215-216.

[2] 陳興芬.側柏葉化學成分提取及活性功能研究[D].南京：南京師范大學，2011.

[3] 付慶霞,王海蘋.白發(fā)病因與發(fā)病機理研究現狀[J].光明中醫(yī),2009,24(2):375-377.

[4] Ken I，Takahiro A，Nguyen TB，et al.Genotoxic；stress abrogates renewalolMelanoc；yte stem cells by triggering their differentiation[J].CeLL，2009，137：1088-1099

[5] Prota G.Progress in the chemistry of melanin and related metabolites[J].Med Re s Rev，1988，8：525-556.

[6] HanamuraT，UchinaE，Aoki H.Skinlightening effect of a polyphenol extract from acerola(malpighiaemarginata DC.)fruit on UV-induced pigmentation[J].BiosciBiochem，2008，72(12)：3211-3218.

StudiesonCharacteristicofHairBlackingIngredientinCacumenPlaycladi

GAO Dan，LIUYe，HUIXiaowei，BAOHaiying*

(CollegeofChineseMedicinalMaterials，JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China)

Objective：To study the main chemical compositions of Cacumen Platycladieffect on tyrosinase activity，so as to determine the Cacumen Platycladiufa role of effective component.Methods：Volatile oil，flavonoids，tannins and resin were extracted from Cacumen Platycladiis，tyrosinase activity was measured by the rate of mushroom tyrosinase oxidation methodinvitro.Results：The volatile oil，the tannins were characterized by mild inhibitory effect，and inhibition of flavonoids was stronger，resin showed stimulating effect.Conclusion：The hair blacking role of Cacumen Platycladi，may be due to the resin.

Cacumen Platycladi；chemical compositions of Cacumen Platycladi；activity of tyrosinase

2015-09-24)

吉林農業(yè)大學大學生科技創(chuàng)新基金(20150320)

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包海鷹，教授，研究方向：中藥學；E-mail：baohaiying2008@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.3.014