煙株對Se（VI）和Se（IV）的吸收及葉片硒亞細胞分布

樊 俊，王 瑞，胡紅青，向必坤，夏鵬亮，鄧建強

（1.湖北省煙草公司恩施州公司，湖北 恩施 445000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，武漢 430070）

煙株對Se（VI）和Se（IV）的吸收及葉片硒亞細胞分布

樊 俊1，2，王 瑞1，胡紅青2*，向必坤1，夏鵬亮1，鄧建強1

（1.湖北省煙草公司恩施州公司，湖北 恩施 445000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，武漢 430070）

為了解煙草對不同價態(tài)硒的吸收及耐性機制，以水培煙株為材料，研究了不同濃度（0、2、5、10、20 mg/L）Se（VI）和Se（IV）對煙株硒吸收及葉片硒亞細胞分布的影響。結(jié)果表明：（1）水培液中加入Se（VI）和Se（IV）處理，低濃度（＜2 mg/L）對煙株生長有促進效果，高濃度（＞5 mg/L）有抑制作用，且相同硒濃度下表現(xiàn)為Se（IV）毒性大于Se（VI）；（2）施硒處理煙株各部位硒含量增加顯著，葉片以有機硒為主，無機硒主要以Se（IV）形態(tài)存儲；（3）煙株葉片和莖稈對Se（VI）的親和力大于Se（IV），而根系對Se（IV）的親和力大于Se（VI）；（4）煙株葉片吸收的硒主要貯存在細胞質(zhì)和細胞壁中，其次為線粒體和葉綠體；（5）同等硒用量下，Se（VI）處理葉片總硒及細胞壁、細胞質(zhì)中硒含量大于 Se（IV）處理。綜合分析得出，水培條件下，煙株對Se（VI）的吸收能力和耐受性均大于Se（IV），原因為煙株吸收的Se（VI）更易合成含硒氨基酸或蛋白質(zhì)等積累在細胞質(zhì)中和被細胞壁固定，進而緩解了硒的毒性。

硒；煙株；亞細胞分布；生長；吸收

硒是植物生長的有益元素，有研究發(fā)現(xiàn)植物體內(nèi)約有10種含硒的有機化合物［1］，其主要作用是增強免疫能力和抗逆性，促進植物生長［2］。適量的硒能刺激硒積聚植物的生長，而強烈抑制硒非積聚植物的生長，在較高濃度下，大部分植物出現(xiàn)硒中毒癥狀，其生長和生理活動受到抑制［3-4］。國內(nèi)外主要研究植物對不同形態(tài)硒的吸收［5-6］，關(guān)于植物亞細胞水平分布研究多見于Cd、Cu、Zn、As等（非）金屬元素［7-8］，而關(guān)于不同價態(tài)硒在植物亞細胞水平分布以及在植物葉片中的轉(zhuǎn)化的研究較少。

本文以煙草為試驗材料，采用水培的方法，研究不同濃度的Se（VI）和Se（IV）處理對煙株生長和硒含量的影響，分析了煙株各部位對硒的吸收能力、煙株葉片組織中硒的轉(zhuǎn)化和亞細胞水平硒分布的差異，為了解煙株對不同價態(tài)硒的富集以及耐性機理提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

云煙87煙苗，分析純硒酸鈉［Se（VI）］和亞硒酸鈉［Se（IV）］，不透光塑料盆。

1.2試驗方法

試驗在溫室大棚進行，選取長勢一致的煙苗（四葉一心）用Hoagland營養(yǎng)液進行水培試驗。應(yīng)用長方形不透光塑料盆，上面覆蓋泡沫板，鉆孔，用海綿包裹煙苗莖部固定在孔中，將根系浸泡在營養(yǎng)液內(nèi)，每盆栽煙苗3株。先用1/4營養(yǎng)液培養(yǎng)7 d，再用1/2營養(yǎng)液培養(yǎng)7 d，然后換成完全營養(yǎng)液。每7天更換1次營養(yǎng)液，每天補充損失水分。每2天通1次氣，每次1 h。用全營養(yǎng)液培養(yǎng)14 d后分別加入硒酸鹽和亞硒酸鹽，硒濃度分別為2、5、10、20 mg/L，同時設(shè)置對照（硒濃度為0），共9個處理，4次重復(fù)，每處理共12株。試驗過程中，第1次加硒15 d后，換營養(yǎng)液，再加入對應(yīng)濃度的2種價態(tài)硒，再培養(yǎng)15 d后進行煙株采收取樣。

1.3樣品采集與分析測定

每個處理選取長勢一致的煙株4株（每盆1株），進行整株收獲，用蒸餾水洗凈，105 ℃殺青30 min，70 ℃烘干，研磨過60目篩，保存?zhèn)溆?。煙株農(nóng)藝性狀采用YC/T142—1998方法進行測定，生物量采用稱重法測定。每個處理另取長勢一致的煙株4株（每盆1株）選中部葉相同位置的鮮葉片組織，剪碎混合后，應(yīng)用改進后的差速離心法分離不同的煙葉亞細胞組分［9］，葉片有機硒和無機硒采用超聲破碎提取，各組分和形態(tài)硒應(yīng)用AFS9800原子熒光光譜法測定［10］。

1.4數(shù)據(jù)處理

本研究運用Michaelis-Menten方程研究煙葉硒含量（C）與培養(yǎng)液硒用量（S）的關(guān)系［11］，即：

式中，Cmax為煙株可達到的最大硒含量（mg/kg）；Ks為煙株硒含量達到最大值一半時培養(yǎng)液中有效性硒含量（mg/L），表征煙株對培養(yǎng)液中硒吸收能力的大小。

試驗數(shù)據(jù)用EXCEL2003和DPS7.05統(tǒng)計分析軟件進行處理。

2　結(jié)　果

2.1Se（VI）和Se（IV）對煙株生長的影響

由表1看出，隨著Se（VI）和Se（IV）濃度的增加，煙株葉長、葉寬、根長、葉數(shù)和株高都呈先增加再降低的趨勢，在2 mg/L處理達最大值。硒濃度大于5 mg/L時，兩種價態(tài)硒處理煙株農(nóng)藝性狀指標(biāo)均小于對照，表明煙株生長受到了抑制。施用等量高濃度（＞5 mg/L）硒，煙株農(nóng)藝性狀指標(biāo)表現(xiàn)為Se（VI）處理好于Se（IV），說明高濃度Se（IV）在水培條件下對煙株的毒害作用大于Se（VI）。

表1　Se（VI）和Se（IV）對水培煙株農(nóng)藝性狀的影響Table 1 Effects of selenate and selenite on plant agronomical characters of hydroponic tobacco plants

2.2Se（VI）和Se（IV）對煙株硒含量及有效性的影響

由表2看出，隨著不同價態(tài)硒用量的增加，煙株各部位硒含量增加顯著。Se（VI）處理，煙株根系硒含量在10 mg/L達最大值，較對照增加了50.7倍；莖稈和葉片硒含量在20 mg/L達最大值，分別較對照增加了81.6倍和132.8倍；Se（IV）處理，煙株根系、莖稈、葉片硒含量在20 mg/L達最大值，分別較對照增加了68.0、36.3和57.0倍。等量硒濃度，煙株根系硒含量為Se（IV）大于Se（VI）處理；莖稈和葉片硒含量為Se（VI）大于Se（IV）處理。

表2　Se（VI）和Se（IV）對煙株硒含量的影響 mg/kgTable 2 Effects of selenate and selenite on Se content of tobacco plants

由表3看出，Se（VI）處理，煙株葉片和莖稈Ks分別為4.44和 13.43 mg/L，較Se（IV）處理降低了70.6%和25.7%；Cmax分別為303.72和281.43 mg/kg，較Se（IV）處理增加了67.7%和91.7%。Se（VI）處理煙株根系Ks和Cmax分別為2.34和204.12 mg/kg，是Se（IV）處理的2.6倍和0.79倍。上述分析說明水培煙株葉片和莖稈對Se（VI）的親和力大于Se（IV），而根系對Se（IV）的親和力大于Se （VI）。

表3　煙株各部位硒含量與水培液硒用量的Michaelis-Menten方程擬合參數(shù)Table 3 Fitting parameters of Michaelis-Menten equation on hydroponic Se concentration and Se content of different parts of tobacco

2.3Se（VI）和Se（IV）對煙株葉片硒價態(tài)的影響

從表4看出，Se（VI）處理，葉片Se（IV）和Se（VI）含量較對照均有顯著增加，分別占總硒含量的7.6%～35.0%和 1.3%～32.6%，無機形態(tài)硒以Se（IV）為主；Se（IV）處理，葉片Se（IV）含量顯著增加，Se（VI）含量增加不明顯，分別占總硒含量的23.8%～51.3% 和0.3%～3.7%，無機形態(tài)硒主要以Se（IV）為主。施用兩種價態(tài)硒，煙株葉片無機硒主要以Se（IV）的形態(tài)存儲，Se（VI）處理雖然葉片無機態(tài) Se（VI）含量增加，但仍以Se（IV）為主要存儲形態(tài)。另外，兩種價態(tài)硒處理，葉片有機硒與無機硒比值大于 1，說明煙株吸收的硒，在葉片中主要以有機硒的形態(tài)為主。

表4　Se（VI）和Se（IV）對煙株葉片硒價態(tài)的影響Table 4 Effects of selenate and selenite on Se valences in leaves

2.4Se（VI）和Se（IV）對煙株葉片亞細胞硒分布的影響

由表5看出，Se（VI）處理，煙株葉片各亞細胞組分硒含量增加顯著，總硒含量在10 mg/L達最大值，較對照增加了78.7倍，效果顯著；葉片硒主要貯存在細胞質(zhì)中（占總硒含量的47.6%～63.6%），其次為細胞壁（占總硒含量的24.5%～27.0%），再次為線粒體（占總硒含量的5.4%～17.9%），葉綠體硒含量最低（占總硒含量的 3.4%～9.8%）。Se（IV）處理，煙株葉片細胞壁和細胞質(zhì)硒含量增加顯著，葉綠體和線粒體硒含量變化不明顯；總硒含量在10 mg/L達最大值，較對照增加了19.3倍，效果顯著；葉片硒主要貯存在細胞質(zhì)（占總硒含量的58.2%～71.7%）和細胞壁（19.3%～33.8%）中，線粒體和葉綠體含量較少。比較不同價態(tài)硒對煙株葉片亞細胞組分硒含量的影響，表明兩種價態(tài)硒均主要貯存在細胞質(zhì)中，然后是細胞壁，再次為線粒體，葉綠體硒含量最低。另外，煙株葉片對Se（VI）的吸收能力和耐受性均大于 Se（IV）（Se（VI）處理葉片總硒含量及細胞壁和細胞質(zhì)中硒含量大于 Se（IV）），說明環(huán)境中的 Se（VI）更易被煙株葉片吸收，并合成含硒氨基酸或蛋白質(zhì)等物質(zhì)積累在細胞質(zhì)中和被細胞壁固定而緩解硒的毒性。

表5　Se（VI）和Se（IV）對煙株葉片亞細胞硒含量的影響Table 5 Effects of selenate and selenite on subcellular level of Se content in leaves

3　討　論

本研究中水培條件下施用Se（VI）和Se（IV），低濃度（＜2 mg/L）對煙株的生長發(fā)育有促進作用；高濃度（＞5 mg/L）則有明顯的抑制作用，與已有報道認為［3-4］，適量硒濃度促進植物生長，提高植株生物量，但過量硒對植株有毒害作用相一致。研究表明相同高濃度 Se（IV）對煙株生長的抑制大于Se（VI），可能與植物對Se（VI）與Se（IV）的吸收轉(zhuǎn)化途徑不同有關(guān)［12-13］，植物對Se（IV）和Se（VI）的吸收、轉(zhuǎn)化和分配有很大不同，兩種形態(tài)硒的吸收和轉(zhuǎn)運機制相對獨立［3］。另外，可能與吸收的 Se（VI）較Se（IV）更易合成含硒蛋白質(zhì)或被細胞壁固定而增加煙株對硒的耐性有關(guān)。

植物體內(nèi)硒轉(zhuǎn)運的主要形態(tài)為Se（VI），以Se（IV）為硒源，被植物根部吸收后氧化成為Se（VI）和其他硒化物向地上部轉(zhuǎn)移至葉片，由于這一轉(zhuǎn)化過程比根吸收的過程要慢很多，因此大量的Se（IV）會積累在根內(nèi)［12］，與文中研究結(jié)論相一致。本文利用Michaelis-Menten方程擬合發(fā)現(xiàn)水培煙株葉片和莖稈對Se（VI）的吸收能力大于Se（IV）。有研究認為，植物在土壤盆栽條件下，根系對Se（VI）的吸收能力大于 Se（IV）［14］，與本文中水培條件下煙株根系對Se（VI）的吸收能力小于 Se（IV）的研究結(jié)論不一致，其原因可能為土壤對Se（IV）的吸附固定能力顯著大于Se（VI），而使Se（IV）生物有效性降低有關(guān)。

施用Se（IV）和Se（VI），煙株葉片硒形態(tài)以有機硒為主，無機形態(tài)只占較少部分，說明煙株在高硒環(huán)境下，葉片吸收的硒可以通過與氨基酸或蛋白質(zhì)等相結(jié)合進行解毒。另外，施用 Se（IV）和 Se（VI），煙株葉片中的無機硒都以Se（IV）為主要形態(tài)，可能煙株吸收的Se（VI）從根部轉(zhuǎn)移到地上部，在葉片中被還原成Se（IV），然后轉(zhuǎn)化為有機硒化物進入其他組織；而煙株吸收的 Se（IV）及其代謝產(chǎn)物主要積累在根部，少部分氧化為Se（VI）轉(zhuǎn)移到地上部，然后在葉片中再還原為Se（IV）參與硒的代謝［15］。

（非）重金屬積累通常會對植物亞細胞結(jié)構(gòu)造成嚴重破壞［16］，進而導(dǎo)致植物體出現(xiàn)各種生理生化反應(yīng)［17］，而其在細胞壁的沉淀以及細胞內(nèi)的區(qū)隔化分布是植物內(nèi)部解毒的兩個重要途經(jīng)［18］。液泡和細胞質(zhì)是植物細胞代謝副產(chǎn)品及廢物囤積場所，其中含有的多種蛋白質(zhì)、有機酸、有機堿等物質(zhì)能與（非）重金屬相結(jié)合，使其在細胞內(nèi)被區(qū)隔化，而降低（非）重金屬的毒性［19］。本研究施用不同價態(tài)的外源硒，煙株葉片硒主要貯存在細胞質(zhì)中，其次為細胞壁，線粒體和葉綠體硒含量最低，說明煙株葉片可通過區(qū)隔化分布和細胞壁沉淀兩種途徑來降低外界環(huán)境中硒對煙株的毒害，增強植株的耐受性。

4　結(jié)　論

水培液中加Se（VI）和Se（IV）處理，低濃度（＜2 mg/L）對煙株生長有促進作用，高濃度（＞5 mg/L）有明顯的抑制效果，相同硒濃度下表現(xiàn)為 Se（IV）毒性大于Se（VI）。煙株葉片以有機硒為主，無機硒主要以 Se（IV）形態(tài)存儲。水培煙株葉片和莖稈對 Se（VI）的親和力大于Se（IV），而根系對Se（IV）的親和力大于 Se（VI）。煙株葉片吸收的硒主要貯存在細胞質(zhì)和細胞壁中。同等硒用量下，Se（VI）處理葉片總硒含量及細胞壁、細胞質(zhì)中硒含量均大于Se（IV）處理，表明煙株對Se（VI）的吸收能力和耐受性均大于Se（IV）。另外，煙株對不同價態(tài)硒耐性差異的分子機制是今后進一步研究的方向。

［1］ 黃峙，向軍儉，郭寶江. 硒蛋白的分子生物學(xué)研究進展［J］. 生物化學(xué)與生物物理進展，2001，28（5）：642-645.

［2］ 吳軍，劉秀芳，徐漢生. 硒在植物生命活動中的作用［J］.植物生理學(xué)通訊，1999，35（5）：417-422.

［3］ Yu X Z， Gu J D. Metabolic responses of weeping willows to selenate and selenite［J］. Environmental Science and Pollution Research， 2007， 14（7）: 510-517.

［4］ Simona D G， Silvia L， Fernando M， et al. Brassica juncea can improve selenite and selenate abatement in selenium contaminated soils through the aid of its rhizospheric bacterial population［J］. Plant and Soil， 2006， 285: 233-244.

［5］ Emese K， Peter R， Hillestr?m， et al. Effect of foliar application of selenium on its uptake and speciation in carrot［J］. Food Chemistry， 2009， 115（4）: 1357-1363.

［6］ 王其兵，吳金綏. 落花生不同器官對硒元素吸收和累積動態(tài)的研究［J］. 植物學(xué)報，1997，39（2）：164-168.

［7］ Nishizono H， Ichikawa H， Suziki S， et al. The role of the root cell wall in the heavy metal tolerance of Athyrium yokoscense［J］. Plant and Soil， 1987， 101: 15-20.

［8］ Küpper H， Zhao F J， McGrath S P. Cellular CompartmentationofZincinleaveofthe hyperaccumlatorthalaspicaerulescens［J］.Plant Physiology， 1999， 119: 305-311.

［9］ 徐君，賈榮，施國新，等. 鎘在水花生葉片中的亞細胞分布及其毒理學(xué)［J］. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2012，23（4）：1070-1076.

［10］ 賀與平，李維香，何素芳，等. 氫化物發(fā)生原子熒光光譜法測定螺旋藻中無機硒和有機硒［J］. 光譜實驗室，2009，26（6）：1404-1408.

［11］ Liu X L， Zhang S Z， Shan X， et al. Combined toxicity of cadmium and arsenate to wheat seedlings and plant uptake and antioxidative enzyme responses to cadmium and arsenateco-contamination［J］.Ecotoxicology Environmental Safety， 2007， 68: 305-313.

［12］ Arvy M P. Selenate and selenite up take and translocation in bean plants （Phaseolus vulgaris）［J］. Journal of Experimental Botany， 1993， 44: 1083-1087.

［13］ 江用彬，季宏兵，李甜甜，等. 環(huán)境硒污染的植物修復(fù)研究進展［J］. 礦物巖石地球化學(xué)通報，2007，26（1）：98-104.

［14］ 王松山，吳雄平，梁東麗，等. 不同價態(tài)外源硒在石灰性土壤中的形態(tài)轉(zhuǎn)化及其生物有效性［J］. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2010，30（12）：2499-2505.

［15］ 王曉芳，陳思楊，羅章，等. 植物對硒的吸收轉(zhuǎn)運和形態(tài)轉(zhuǎn)化機制［J］. 農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學(xué)報，2014，31（6）：539-544.

［16］ 周紅衛(wèi)，施國新，杜開和，等. Cd2+污染對水花生生理生化及超微結(jié)構(gòu)的影響［J］. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2003，14 （9）：1581-1584.

［17］ 谷巍，施國新，巢建國，等. 汞、鎘、銅污染對魚草細胞膜系統(tǒng)的毒害作用［J］. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2008，19（5）：1138-1143.

［18］ Brune A， Urbach W， Dietz K J. Compartmentation and transport of zinc in barley primary leaves as basic mechanism involved in zinc tolerance［J］. Plant Cell and Environment， 1994， 17: 153-162.

［19］ 周守標(biāo)，徐禮生，吳龍華，等. 鎘和鋅在皖景天細胞內(nèi)的分布及化學(xué)形態(tài)［J］. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2008，19（11）：2515-2520.

Effect of Selenate and Selenite on Selenium Uptake and Subcellular Distribution in Leaves of Flue-cured Tobacco

FAN Jun1，2， WANG Rui1， HU Hongqing2*， XIANG Bikun1， XIA Pengliang1， DENG Jianqiang1
（1. Enshi Prefecture Company of Hubei Provincial Tobacco Corporation， Enshi， Hubei 445000， China； 2. College of Resource and Environment， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

In order to understand the absorption and resistance mechanism of Se on tobacco， a hydroponic experiment was conducted to study the absorption and subcellular distribution of Se in tobacco leaves under different concentrations （0， 2， 5， 10， 20 mg/L） of Se（VI） and Se（IV）. The results showed that （1） At low concentrations （＜2 mg/L） Se improved the growth of tobacco plant， but it showed obvious inhibitory effects to tobacco plant at high concentrations （＞5 mg/L） and the negative effects of Se（IV） were more serious than Se（VI） at the same concentration of Se. （2） The content of Se in different parts of tobacco plant increased significantly with the application of different valences of Se. The Se forms in leaves were mainly organic Se， and Se（IV） was the dominating form of inorganic Se. （3） For leaves and stalks the affinity of selenate was higher than selenite and for roots it was the opposite. （4） Se was mainly stored in the cytoplasm， and then the cell wall， with the mitochondria， chloroplasts had less Se. （5） The Se content of leaves， Se in the cell wall and cytoplasm from the Se（VI） treatment were higher than the Se（IV） treatment， suggesting that plants have better absorption ability and tolerance to Se（VI） than Se（IV）. The reasons for this was that Se （VI） was easier to be used in synthesizing proteins or amino acids and be fixed in the cell wall such that the toxicity of Se was alleviated.

selenium； tobacco； subcellular distribution； growth； absorb

S572.01

1007-5119（2016）04-0037-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.04.007

國家煙草專賣局科技項目“‘清江源’生態(tài)富硒特色煙葉生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)研究與應(yīng)用”（110201202014）；湖北省煙草公司科技項目“恩施地區(qū)硒資源開發(fā)及在煙葉上的應(yīng)用效果研究”｛鄂煙科［2013］18號｝

樊 ?。?985-），博士，農(nóng)藝師，主要從事煙草富硒栽培技術(shù)研究。E-mail：fanjunwhy@163.com。*通信作者，E-mail：hqhu@mail.hzau.edu.cn

2015-11-12

2016-04-08