李同彪，周晨妍，朱新術(shù)，王燕

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)，453003)

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N-端二硫鍵及芳香族氨基酸對木聚糖酶XynZF-2熱穩(wěn)定性的影響

李同彪，周晨妍*，朱新術(shù)，王燕

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)，453003)

為提高GH11家族中溫木聚糖酶XynZF-2的熱穩(wěn)定性，將其N-端替換成GH11家族的耐熱性木聚糖酶EvXyn11的相應(yīng)序列，并在該段序列引入芳香族氨基酸殘基(P9Y、H14F)，構(gòu)建雜合木聚糖酶基因xynEV-34，將木聚糖酶基因xynZF-2和xynEV-34分別在E.coliBL21中表達，并分析溫度和pH對酶活性的影響。結(jié)果表明，雜合木聚糖酶XynEV-34的最適溫度為48 ℃，相比原酶XynZF-2提高了8 ℃。在40 ℃保溫1 h，原酶XynZF-2殘余酶活性下降到44.36%，而突變酶Xyn34殘余酶活性為77.96%。在45 ℃，突變酶XynEV-34的半衰期t1/245℃為23 min，較重組酶XynZF-2(t1/245℃=7 min)提高了16 min。同時，兩種酶的最適pH均為5.0，但pH穩(wěn)定性由原來的4.4～9.0擴增到了3.0～9.0。由此表明，二硫鍵以及芳香族氨基酸的引入，對該酶的熱穩(wěn)定性以及pH穩(wěn)定性都有明顯改善。

木聚糖酶；二硫鍵；芳香族氨基酸；熱穩(wěn)定性

木聚糖是由木糖、阿拉伯半乳聚糖以及葡甘聚糖等組成的含量豐富的細胞壁多糖，是半纖維素的主要成分，其主鏈?zhǔn)怯搔?1,4糖苷鍵連接的D-木糖殘基組成[1]。木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是一種糖苷類水解酶，可以隨機內(nèi)切木聚糖的β-1,4糖苷鍵產(chǎn)生還原性的低聚木糖[2]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)木聚糖酶在糖苷類水解酶5、7、8、10、11和43等家族分布廣泛，根據(jù)結(jié)構(gòu)、理化特性以及催化模式的不同，主要分為F10和GH11家族[3]。F10家族的木聚糖酶蛋白結(jié)構(gòu)呈桶狀型[4]，而GH11家族的木聚糖酶呈右手半握狀[3]。

木聚糖酶可以提高半纖維素原料的工業(yè)利用率以及飼料利用率，同時，可以用于紙漿漂白、食品加工、紡織、生物燃料等多個領(lǐng)域[5]。然而，隨著木聚糖酶工業(yè)用途的不斷拓展，其工業(yè)適用性越來越受到低熱穩(wěn)定性的限制[6]。因此，改善木聚糖酶的熱穩(wěn)定性已成為廣泛研究的焦點。表面帶電殘基、鹽橋、氫鍵、芳香族氨基酸、N-端和α-螺旋處二硫鍵的引入可以增加木聚糖酶局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而可以有效改善木聚糖酶的熱穩(wěn)定性[7]。如WANG等利用Swiss-PdbViewer分析來源于T.lanuginosusDSM10635的木聚糖酶TLX，在N-端引入一個二硫鍵(Q1C-Q24C)，在大腸桿菌BL21中基因表達發(fā)現(xiàn)，二硫鍵突變酶最適溫度提高了10 ℃，在pH 8.0和70 ℃條件下，二硫鍵突變酶的半衰期提高了20倍。通過圓二色譜測定解鏈溫度發(fā)現(xiàn)，解鏈溫度從66 ℃增加到了74 ℃。因此，N-端二硫鍵的引入使得動力學(xué)和熱力學(xué)穩(wěn)定性大幅度提高[8]。

木聚糖酶基因xynZF-2是由本實驗室從黑曲霉(Aspergillusniger)XZ-3S中分離獲得，該酶屬于中溫木聚糖酶，最適溫度為40 ℃，高溫條件下熱穩(wěn)定性較差難以滿足工業(yè)要求[9]。本研究利用生物信息學(xué)比對木聚糖酶XynZF-2基因序列(GenBank Accession No.JQ700382)與耐熱木聚糖酶EvXyn11基因序列(GenBank Accession No.EU591347)的同源性，通過N-端替換引入二硫鍵，并在替換的N-端區(qū)域引入芳香族基酸，增加芳香族氨基酸含量以期望提高木聚糖酶XynZF-2熱穩(wěn)定性。

1　材料與方法

1.1材料

EscherichiacoliBL21(DE3)、pET-28a均購自Novagen公司，重組質(zhì)粒pET-28a-xynZF-2由本實驗室構(gòu)建在E.coliBL21上并保存；TaqDNA聚合酶、DL1000 DNA Marker、限制性內(nèi)切酶、T4DNA Ligase、X-gal、IPTG及購自TaKaRa公司；DNA片段回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自Sangon公司；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購自碧云天生物技術(shù)有限公司；樺木木聚糖購自Sigma公司；其他試劑為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2木聚糖酶初級結(jié)構(gòu)比對分析以及三維建模

通過The ProtParam program (http://web.expasy.org/protparam/) 分析木聚糖酶的理化性質(zhì)[10]，BLAST和DNAMAN6.0同源序列比對與木聚糖酶XynZF-2同源性較高的耐熱木聚糖酶基因，PROSITE (http://prosite.expasy.org)預(yù)測木聚糖酶功能位點，利用Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)對木聚糖酶XynZF-2建模，同時，并通過DS ViewerPro6.0分析木聚糖酶的三維結(jié)構(gòu)。

1.3N-端替換區(qū)域基因合成

將XynZF-2的N-端48個氨基酸替換成EvXyn11 N-端相應(yīng)的34個氨基酸，以EvXyn11 N-端的34個氨基酸為模板，與來源于褐色高溫單孢菌(Thermomonosporafusca)的耐熱木聚糖酶TfxA的N-端區(qū)域比對，在EvXyn11 N-端的34個氨基酸中引入芳香族氨基酸，依據(jù)大腸桿菌密碼子偏愛性，設(shè)計重組的EvXyn11 N-端的34個氨基酸基因序列Ev34，根據(jù)Ev34和xynZF-2基因序列設(shè)計引物(表1)，并由金唯智生物科技有限公司合成。

表1　引物序列

注：下劃線為酶切位點。

1.4突變基因的擴增與重組載體的構(gòu)建

以pET-28a-xynZF-2為模板，采用重疊延伸PCR法擴增突變基因xynEV-34，反應(yīng)條件見參考文獻[9]，雙酶切突變基因xynEV-34和質(zhì)粒pET-28a，T4DNA Ligase連接雙酶切產(chǎn)物，16 ℃過夜，構(gòu)建表達載體pET-28a-xynEV-34，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，經(jīng)含有Kan抗性的平板篩選出單克隆菌落，提取重組質(zhì)粒pET-28a-xynEV-34，經(jīng)雙酶切驗證后，送金唯智生物科技有限公司測序。

1.5重組木聚糖酶的誘導(dǎo)表達與純化

突變基因測序后，重組菌株BL21/pET-28a-xynZF-2和BL21/pET-28a-xynEV-34，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，采用超聲波細胞破碎等方法提取粗酶液[11]。利用鎳金屬螯合層析柱純化含有His標(biāo)簽蛋白的重組木聚糖酶XynEV-34和XynZF-2，純化后樣品經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳(15%分離膠和5%濃縮膠)檢測[9]。

1.6木聚糖酶酶活性測定

采用DNS法測定木聚糖酶活性[9]。1.5 mL 0.5%樺木木聚糖溶液(pH 4.6)與1 mL適當(dāng)稀釋的酶液，40 ℃下反應(yīng)15 min，加入2.5 mL DNS溶液，沸水浴7 min顯色，冷卻后加入5 mL蒸餾水，測定OD540值。在上述條件下，以每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量定義為1個單位(U)。

1.7酶學(xué)性質(zhì)分析

通過最適溫度、熱穩(wěn)定性、最適pH以及pH穩(wěn)定性等酶學(xué)性質(zhì)對比研究純化后的原酶XynZF-2和突變酶XynEV-34，具體操作方法見參考文獻[9]。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理

每個實驗進行3次重復(fù)，取其平均值，最終實驗數(shù)據(jù)均用SPSS11.0軟件進行處理，并繪制出相應(yīng)的圖形。

2　結(jié)果與分析

2.1重組木聚糖酶結(jié)構(gòu)分析

BLAST比對木聚糖酶XynZF-2和EvXyn11氨基酸序列同源性為63%，且兩者均屬于GH11家族木聚糖酶。同時，對耐熱性木聚糖酶EvXyn11三維同源建模發(fā)現(xiàn)，EvXyn11 N-端區(qū)域含有一個二硫鍵(Cys5-Cys32)。因此，以木聚糖酶XynZF-2為母本，將N-端的48個氨基酸替換成耐熱性木聚糖酶EvXyn11相應(yīng)的34個氨基酸。同時，木聚糖酶EvXyn11的N-端34個氨基酸與耐熱木聚糖酶TfxA的N-端區(qū)域的氨基酸殘基比對分析，如圖1所示，EvXyn11與TfxA 的N-端芳香族氨基酸位點分布基本相同，為提高EvXyn11 N-端芳香族氨基酸含量，在第9、14位點引入芳香族氨基酸(P9Y、H14F)，構(gòu)建雜合木聚糖酶XynEV-34。以相似性最高，PDB號分別為1TE1(68%相似與XynZF-2)和2VUL(73%相似與XynEV-34)的木聚糖酶的3D結(jié)構(gòu)為模板對XynZF-2和XynEV-34同源建模。建模結(jié)果表明，XynZF-2和XynEV-34模型與原序列相似度分別為91%和99%，置信度均為100%，符合建模要求。突變酶與原酶結(jié)構(gòu)相似，都屬于GH11家族，由一個簡單的α-螺旋以及兩個反向的β-折疊片層組成，呈右手半握狀結(jié)構(gòu)。然而，原酶XynZF-2活性中心位點(Glu103和Glu194)與突變酶(Glu89和Glu194)不一致，這是由于N-端替換導(dǎo)致氨基酸數(shù)量減少所致(圖2、圖3)。

圖1　耐熱木聚糖酶EvXyn11和TfxA 的N-端區(qū)域序列比對Fig.1　N-terminal amino acid alignment of EvXyn11 with TfxA(注：下劃線為二硫鍵位點，箭頭為突變位點，陰影部分為芳香族氨基酸)

圖2　雜合木聚糖酶XynEV-34三維結(jié)構(gòu)Fig.2　The 3D structure of the hybrid xylanase XynEV-34

圖3　木聚糖酶XynZF-2三維結(jié)構(gòu)Fig.3　The 3D structure of the xylanase XynZF-2

2.2雜合木聚糖酶基因的擴增與表達載體的構(gòu)建

由金唯智合成的N端基因序列Ev34約112bp，構(gòu)建在pUC57載體上。以pUC57-Ev34為模板，通過PCR擴增得到目的片段Ev34，如圖4所示。利用重疊延伸PCR技術(shù)擴增雜合木聚糖酶基因xynEV-34，如圖5所示，雜合木聚糖酶基因xynEV-34電泳條帶明顯低于原酶基因xynZF-2。雙酶切(EcoRⅠ、HindⅢ)雜合基因xynEV-34和質(zhì)粒pET-28a，構(gòu)建重組表達載體pET-28a-xynEV-34，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，基因測序結(jié)果顯示雜合基因與預(yù)期結(jié)果一致。

M-DNA marker；1-Ev34的PCR產(chǎn)物圖4　Ev34的PCR擴增Fig.4　PCR amplification of Ev34

M-DNA marker；1-xynZF-2的PCR產(chǎn)物；2-xynEV-34的PCR產(chǎn)物圖5　xynZF-2和xynEV-34的PCR擴增Fig.5　PCR amplification of xynZF-2 and xynEV-34

2.3雜合木聚糖的表達與純化

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌株BL21/pET-28a-xynZF-2和BL21/pET-28a-xynEV-34，通過超聲波破碎，高速離心得到粗酶液，并通過鎳金屬螯合層析柱純化粗酶液，SDS-PAGE電泳檢測如圖6所示。另外，通過The ProtParam program (http://web.expasy.org/protparam/) 分析計算重組酶XynZF-2和XynEV-34的分子質(zhì)量發(fā)現(xiàn)，突變酶XynEV-34分子質(zhì)量相對原酶XynZF-2(32 kDa)，僅僅減少了1 kDa左右。因此，圖6顯示的純化后兩種木聚糖酶條帶相差不明顯。

M-蛋白質(zhì)Marker；1-純化后的XynZF-2；2-純化后的XynEV-34圖6　重組木聚糖酶XynZF-2 and XynEV-34的SDS-PAGE分析Fig.6　SDS-PAGE analysis of the recombinant xylanase XynZF-2 and XynEV-34

2.4酶學(xué)性質(zhì)分析

2.4.1重組木聚糖酶最適溫度以及熱穩(wěn)定性的分析

對純化后的重組木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，如圖7所示，突變酶XynEV-34最適溫度為48 ℃，相比原酶XynZF-2的40 ℃，最適溫度提高了8 ℃。溫度對重組木聚糖酶熱穩(wěn)定性的影響如圖8所示，原酶XynZF-2熱穩(wěn)定性較差，在40 ℃條件下保溫60 min，殘余酶活性下降到44.36%，而突變酶XynEV-34保溫60 min，殘余酶活性為77.96%。由此可見，40 ℃條件下，突變酶XynEV-34熱穩(wěn)定性明顯提高。在45 ℃條件下，原酶XynZF-2與突變酶XynEV-34分別保溫60 min，如圖8所示，原酶XynZF-2的半衰期t1/245℃為7 min，突變酶XynEV-34的t1/245℃半衰期為23 min，提高了16 min；保溫20 min后，原酶XynZF-2基本喪失酶活性，而突變酶XynEV-34殘余酶活性仍高達57.92%。通過N-端替換引入的二硫鍵和芳香族氨基酸使木聚糖酶XynZF-2的熱穩(wěn)定性明顯改善。

圖7　重組木聚糖酶酶最適溫度比較Fig.7　Comparison of the optimum temperature of the recombinant xylanases

圖8　重組木聚糖酶XynEV-34和XynZF-2熱穩(wěn)定性比較Fig.8　Comparison of the thermostability between the recombinant xylanase XynEV-34 and XynZF-2

2.4.2重組木聚糖酶最適pH以及pH穩(wěn)定性的分析

測定pH對重組木聚糖酶酶活性的影響發(fā)現(xiàn)，原酶XynZF-2與突變酶XynEV-34的最適pH都在5.0左右，基本沒有改變(圖9)。同時，將原酶XynZF-2與突變酶XynEV-34在不同pH的緩沖液中保溫1 h，測定各自相對酶活性發(fā)現(xiàn)，由圖10可見，原酶XynZF-2在pH4.5～9.0之間的相對酶活性在50%以上，而突變酶Xyn34在pH3.0～9.0之間的相對酶活性在50%以上，由此可見，突變酶XynEV-34的pH穩(wěn)定區(qū)間相比原酶XynZF-2明顯擴大。由此可以推斷，N-端替換可能使得木聚糖酶XynEV-34局部結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，從而使得該酶pH穩(wěn)定性增強。

圖9　重組木聚糖酶最適pH比較Fig.9　Comparison of the optimum pH of the recombinant xylanases

圖10　重組木聚糖酶pH穩(wěn)定性比較Fig.10　Comparison of the pH stability of the recombinant xylanases

3　討論

研究表明，通過中溫和耐熱木聚糖酶的氨基酸序列比對，可以有效確定與木聚糖酶耐熱性相關(guān)的氨基酸殘基以及結(jié)構(gòu)區(qū)域[12]。另外，在木聚糖酶結(jié)構(gòu)中理性的引入二硫鍵，可以明顯改善木聚糖酶的熱穩(wěn)定性，二硫鍵主要作用在蛋白的折疊區(qū)域，降低蛋白去折疊狀態(tài)的熵值以穩(wěn)定蛋白構(gòu)象，從而提高木聚糖酶的熱穩(wěn)定性[13]。

本研究通過同源序列分析，將木聚糖酶XynZF-2的N-端48個氨基酸替換成木聚糖酶EvXyn11 N-端含有二硫鍵(Cys5-Cys32)相應(yīng)的34個氨基酸，增強β-折疊片之間的穩(wěn)定性。同時，EvXyn11的N-端的34個氨基酸與耐熱木聚糖酶TfxA的N-端區(qū)域的氨基酸殘基比對及結(jié)構(gòu)分析，在EvXyn11 N-端的β鏈B1上引入芳香族氨基酸(P9Y、H14F)，增強β鏈B1與內(nèi)部結(jié)構(gòu)之間的疏水作用，穩(wěn)定N-端局部結(jié)構(gòu)，進而提高整個酶分子的穩(wěn)定性。同時，構(gòu)建對突變酶XynEV-34酶學(xué)性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，突變酶最適溫度為48 ℃，相比原酶提高了8 ℃；相比原酶XynZF-2，突變酶XynEV-34的t1/245℃半衰期提高了16 min。由此可以得出，木聚糖酶XynZF-2的N-端引入二硫鍵以及芳香族氨基酸使得其熱穩(wěn)定性明顯改善。這種通過同源序列比對以及結(jié)構(gòu)分析來改造木聚糖酶的熱穩(wěn)定性，為其他木聚糖酶的分子改造提供了思路和方法，同時也為木聚糖酶工業(yè)用途的拓展奠定了基礎(chǔ)。

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Effect of N-terminal disulfide bridge and aromatic residues on the thermal stability of xylanase XynZF-2

LI Tong-biao, ZHOU Chen-yan*,ZHU Xin-shu, WANG Yan

(School of Life Science and Technology, Xinxiang Medical University, Xinxiang 45300, China)

In order to improve the thermostability of a mesophilic family GH11 xylanase XynZF-2, the N-terminus of xylanase XynZF-2 was substituted with the corresponding sequence of a hyperthermostability family GH11 xylanase EvXyn11. The aromatic residues (P9Y and H14F) were introduced into this corresponding sequence of xylanase EvXyn11 to construct the hybrid xylanase genexynEV-34. XynZF-2- and XynEV-34-encoding genes were expressed inE.coliBL21, respectively, and effects of pH and temperatures on the activity of xylanase were analyzed. Compared to the optimum temperature of XynZF-2, the optimum temperature of XynEV-34, increasing by 8 ℃, was 48 ℃. In addition, the Xyn34 and XynZF-2 respectively retained about 77.96% and 44.36% of activity after treatment at 40℃ for 60 min. Compared to XynZF-2 witht1/245℃of 7 min,t1/245℃of XynEV-34 was increased to 23 min. Optimum pH values of the XynZF-2 and XynEV-34 did not change notably. However, the pH range for stability of XynEV-34 was broadened from 4.4～9.0 to 3.0～9.0. This study demonstrated that the introduction of a disulfide bridge and aromatic residues could improve the thermostability and pH stability of the XynZF-2 notably.

xylanase; disulfide bridge; aromatic residues; thermostability

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601005

碩士研究生(周晨妍副教授為通訊作者，E-mail:zhouchenyan2008@163.com)。

河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點項目(13A180861;14A180018)；河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計劃項目(2011GGJS-125)；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院科研項目培育基金(2013ZD113)；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院研究生科研創(chuàng)新支持計劃資助項目(YJSCX20434Y)

2015-07-01，改回日期：2015-09-08