阿里木江·賽提瓦爾地, 劉俊遠(yuǎn), 俞婷婷, 韓志剛

新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 肺內(nèi)一科(烏魯木齊　830011)

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抗人stathmin單克隆抗體和紫杉醇對(duì)肺癌細(xì)胞系QG-56的生長(zhǎng)抑制和誘導(dǎo)凋亡作用*

阿里木江·賽提瓦爾地, 劉俊遠(yuǎn), 俞婷婷, 韓志剛△

新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 肺內(nèi)一科(烏魯木齊830011)

目的探討抗人stathmin單克隆抗體(McAb)、紫杉醇(PTX)單用或聯(lián)合應(yīng)用對(duì)肺癌細(xì)胞系QG-56的生長(zhǎng)抑制及誘導(dǎo)凋亡作用。方法以不同濃度的抗人stathmin McAb、PTX分別組成McAb組、PTX組和聯(lián)合用藥組，另設(shè)不加藥的對(duì)照組，分別作用于QG-56細(xì)胞24、48、72、96 h，觀察細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)的變化，MTT法檢測(cè)各組QG-56細(xì)胞的增殖抑制情況，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組QG-56細(xì)胞凋亡率。結(jié)果不同濃度的McAb組、PTX組和聯(lián)合用藥組細(xì)胞數(shù)量明顯減少、形態(tài)不規(guī)則，部分細(xì)胞核固縮和胞質(zhì)減少，而對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。抗人stathmin McAb、PTX單用和聯(lián)合應(yīng)用均能抑制QG-56細(xì)胞增殖，呈劑量-時(shí)間依賴效應(yīng)，聯(lián)合用藥組細(xì)胞抑制率較McAb組、PTX組明顯增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩藥聯(lián)用具有協(xié)同效應(yīng)?？谷藄tathmin McAb、PTX單用與聯(lián)用均能誘導(dǎo)QG-56細(xì)胞凋亡，聯(lián)合用藥組誘導(dǎo)凋亡作用更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論抗人stathmin McAb、PTX單用與聯(lián)用均能抑制QG-56細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，兩藥聯(lián)合作用于人肺癌QG-56細(xì)胞具有協(xié)同作用。

stathmin單克隆抗體; 紫杉醇; 肺癌; 增殖; 凋亡

肺癌是對(duì)人類健康與生命危害最大的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升，化療是晚期肺癌的主要治療方法，但晚期肺癌患者對(duì)化療藥物的耐受性較差，目前靶向治療成為肺癌研究的熱點(diǎn)[1-2]。stathmin是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的腫瘤基因治療的新靶點(diǎn)，是細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中至關(guān)重要的可溶性蛋白質(zhì)，其高表達(dá)于多種惡性腫瘤患者[3]。研究[4-5]顯示，細(xì)胞內(nèi)、外多種生物活性物質(zhì)可與stathmin直接或間接作用，引起細(xì)胞生物學(xué)改變，控制細(xì)胞周期，改變細(xì)胞增殖、分化和活性等。紫杉醇(PTX)是目前世界公認(rèn)的廣譜、強(qiáng)活性抗癌藥物，具有獨(dú)特的抗癌機(jī)理，尤其是對(duì)肺癌、卵巢癌、乳腺癌的治療有效率高達(dá)75%[6]。本研究旨在探討抗人stathmin單克隆抗體(McAb)與PTX單用或聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人肺癌QG-56細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制及誘導(dǎo)凋亡作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞與主要試劑

人肺癌細(xì)胞系QG-56來(lái)自新疆醫(yī)科大學(xué)抗體工程研究所；PTX購(gòu)于北京華素制藥股份有限公司；抗人stathmin McAb由新疆醫(yī)科大學(xué)抗體工程研究所制備；新生小牛血清、0.25%胰酶溶液、RPMI-1640培養(yǎng)液均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；AnnexinV/ PI染色試劑盒購(gòu)于深圳精美公司；噻唑藍(lán)(MTT)、分析純二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將人肺癌細(xì)胞系QG-56接種于含10%胎牛血清、100 u/mL鏈霉素的IMDM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、CO2濃度5%的孵育箱中培養(yǎng)。細(xì)胞為上皮樣細(xì)胞，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)每2～3 d傳代1次， 待細(xì)胞生長(zhǎng)接近80%時(shí)收集并用于實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.2QG-56細(xì)胞形態(tài)變化觀察取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期QG-56細(xì)胞，2×105/孔接種于6孔板，4 h后按加入成分的不同分為3組。 McAb組：加入不同濃度(10、20、40、80、160)μg/mL的抗人stathmin McAb；PTX組：加入不同濃度(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6) μg/mL的PTX；聯(lián)合用藥組：同時(shí)加入不同濃度的抗人stathmin McAb和PTX(McAb 10 μg/mL+PTX 0.1 μg/mL、McAb 20 μg/mL+PTX 0.2 μg/mL、McAb 40 μg/mL+PTX 0.4 μg/mL、McAb 80 μg/mL+PTX 0.8 μg/mL、McAb 160 μg/mL+PTX 1.6 μg/mL)。另設(shè)不加藥的對(duì)照組。除對(duì)照組外，各組每一藥物濃度均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別處理24、48、72、96 h后于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3MTT法檢測(cè)QG-56細(xì)胞增殖的抑制率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期QG-56細(xì)胞，5×103/孔接種于96孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)4 h后，按加入成分不同分為3組：McAb組，PTX組和聯(lián)合用藥組(加入藥物和藥物濃度同1.2.2)，另設(shè)不加藥的對(duì)照組。各組每一藥物濃度均設(shè)5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24、48、72、96 h后加入5 mg/mL的MTT 20 μL，培養(yǎng)4 h，棄上清，加入150 μL DMSO。采用酶標(biāo)儀測(cè)各孔OD490nm，計(jì)算各組抑制率。抑制率(%)=(對(duì)照組OD490nm-實(shí)驗(yàn)組OD490nm)/對(duì)照組OD490nm×100%。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)QG-56細(xì)胞凋亡率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期QG-56細(xì)胞，2×105/孔接種于6孔板，4 h后按加入成分的不同分為3組：McAb組、PTX組及聯(lián)合用藥組(加入藥物和藥物濃度同1.2.2)，另設(shè)不加藥的對(duì)照組，各組每一藥物濃度均設(shè)4個(gè)復(fù)孔。用0.25%胰酶溶液收集培養(yǎng)24、48、72、96 h的樣本，加75%乙醇4 ℃固定24 h，PBS洗2次，1 mg/mL RNase A 37 ℃消化30 min，100 μg/mL碘化丙啶4 ℃染色20 min。采用流式細(xì)胞儀分析，每組樣本計(jì)數(shù)分析104個(gè)細(xì)胞，最后應(yīng)用ModFitl T V2.0軟件處理數(shù)據(jù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1各組QG-56細(xì)胞形態(tài)的改變

加藥前各組細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)基本一致。培養(yǎng)48 h后，McAb組、PTX組及聯(lián)合用藥組細(xì)胞數(shù)量均減少，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞質(zhì)空泡或減少，細(xì)胞呈半懸浮狀態(tài)；對(duì)照組培養(yǎng)24、48、72、96 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)良好、細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間增加逐漸增多，細(xì)胞形態(tài)一致，染色質(zhì)疏松，細(xì)胞質(zhì)豐富。

2.2各組QG-56細(xì)胞的增殖抑制情況

2.2.1McAb、PTX對(duì)QG-56細(xì)胞的增殖抑制率

與陰性對(duì)照相比，McAb和PTX處理后QG-56細(xì)胞的增殖抑制率明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，McAb和PTX對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)時(shí)間(rMcAb=0.554，P=0.002；rPTX=0.492，P=0.001)和劑量(rMcAb=0.612，P=0.001；rPTX=0.591，P=0.001)依賴趨勢(shì)(表1和表2)。

2.2.2McAb聯(lián)合PTX對(duì)QG-56細(xì)胞的增殖抑制率聯(lián)合用藥組對(duì)QG-56細(xì)胞增殖的抑制作用較McAb組和PTX組單藥處理時(shí)明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，析因方差分析顯示，兩藥聯(lián)用呈現(xiàn)交互效應(yīng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

表1　McAb對(duì)QG-56細(xì)胞增殖的抑制作用

表2　單用紫杉醇對(duì)QG-56細(xì)胞增殖的抑制作用±s)

表3　McAb和PTX聯(lián)用對(duì)QG-56細(xì)胞增殖的抑制作用

2.3各組QG-56細(xì)胞凋亡率比較

聯(lián)合用藥組出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞凋亡增加，且呈時(shí)間(r=0.576，P=0.001)和劑量(r=0.634，P=0.001)依賴趨勢(shì)。同一時(shí)間點(diǎn)和不同濃度組間凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同一藥物濃度和不同時(shí)間點(diǎn)凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與McAb組、PTX組比較，聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表4～表6)。

表4　McAb作用后QG-56細(xì)胞凋亡率的改變

表5　PTX作用后QG-56細(xì)胞凋亡率的改變

表6　McAb和PTX單用或聯(lián)用后QG-56細(xì)胞凋亡率的改變

3　討論

肺癌是目前全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，約2/3的患者確診時(shí)已屬中晚期，失去了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)?；煘橥砥诜伟┑闹饕委煼椒ǎS著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，患者對(duì)化療藥物耐受性減弱，化療效果不理想[7]。隨著藥物遺傳學(xué)和基因?qū)W的迅速發(fā)展，研究[8]發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中的基因表達(dá)與腫瘤化療療效密切相關(guān)。因此，依據(jù)腫瘤患者組織中基因表達(dá)情況，采用靶向治療策略提高腫瘤患者化療效果，減少毒副反應(yīng)成為新的治療思路。

stathmin是從淋巴瘤中篩選的特征性基因的表達(dá)產(chǎn)物，屬于高度保守的胞質(zhì)磷蛋白，可在細(xì)胞周期的不同階段通過(guò)其磷酸化和去磷酸化作用對(duì)細(xì)胞的維管系統(tǒng)動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用，高效調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化[9]。stathmin在多種惡性腫瘤組織中均有高水平表達(dá)，為腫瘤基因治療提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)，通過(guò)靶向治療，抑制其表達(dá)可干擾惡性腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖[10]。研究[11-12]報(bào)道，stathmin的高水平表達(dá)是惡性腫瘤細(xì)胞維持高增殖率和轉(zhuǎn)化表型所必須的，抑制stathmin基因表達(dá)，不僅能逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤表型，還可抑制腫瘤細(xì)胞增殖。紫杉醇是目前唯一一種具有獨(dú)特抗微管作用機(jī)制的天然抗癌藥物，主要從紫衫的樹干和樹枝中提取而成，不僅能促進(jìn)微管聚合，形成穩(wěn)定的微管聚合物，顯著減少游離的微管數(shù)量，抑制細(xì)胞有絲分裂，還能抑制細(xì)胞增殖，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡[13]。本研究結(jié)果顯示，PTX和抗人stathmin McAb單用或聯(lián)合應(yīng)用均可明顯抑制QG-56的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，且增殖抑制作用和誘導(dǎo)凋亡作用均呈時(shí)間-劑量依賴關(guān)系；此外，兩藥聯(lián)用比單用時(shí)的增殖抑制作用、誘導(dǎo)凋亡作用更明顯，提示兩藥對(duì)肺癌細(xì)胞存在協(xié)同抑制作用。與原少斐等[14-15]研究報(bào)道相似，提示抗人stathmin McAb聯(lián)合PTX治療肺癌具有明顯優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，抗人stathmin McAb、PTX單用與聯(lián)用均能抑制QG-56細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，兩藥聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人肺癌QG-56細(xì)胞具有協(xié)同抑制作用，不僅為肺癌患者體內(nèi)研究提供了基礎(chǔ)和依據(jù)，還提供了新的研究思路和治療方案，提示抗人stathmin McAb聯(lián)合PTX應(yīng)用具有良好的應(yīng)用前景。

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Effect of Anti-human Stathmin Monoclonal Antibody and Paclitaxel on the Growth Inhibition and Inducing Apoptosis of Lung Cancer Cell Line QG-56

AlimijiangSaitiwaerdi,LiuJunyuan,YuTingting,HanZhigang△.

FirstDepartmentofInternalMedicineforLung,TheAffiliatedCancerHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumchi830011,China

ObjectiveTo explore the effect of anti-human stathmin monoclonal antibody (McAb) and paclitaxel (PTX) in single or combined application on the growth inhibition and inducing apoptosis of lung cancer cell line QG-56. MethodsThe single drug group and the combined drug group were set according to the different concentrations of anti-human stathmin McAb and PTX respectively, while the control group received no drugs. The drugs were used on QG-56 cells for 24, 48, 72 and 96 hours respectively to observe the changes of cell count and morphology. Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method was used to detect the proliferation and inhibition of QG-56 cells, while flow cytometry (FCM) was adopted to detect the apoptotic rate of QG-56 cells. ResultsThe cell count reduced significantly, the morphology was irregular, and the partial karyopyknosis and cytoplasm decreased in the single drug group and the combined drug group with different concentration of drugs, while cells had favorable growth conditions in the control group. Anti-human stathmin McAb and PTX in single or combined application could both inhibit the proliferation of QG-56 cells at a dosage-time-dependent manner. However, the combined drug group was significantly better in the inhibition rate of cells than the single drug groups (P<0.05), and the combination of two drugs had synergistic effect. Anti-human stathmin McAb and PTX in single or combined application could both induce the apoptosis of QG-56 cells, but the combined drug group was more significant in inducing apoptosis (P<0.05). ConclusionAnti-human stathmin McAb and PTX in single or combined application can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of QG-56 cells, but the combination of two drugs has a synergistic effect on human lung cancer QG-56 cells.

Stathmin monoclonal antibody; Paclitaxel; Lung cancer; Proliferation; Apoptosis

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.04.010

中國(guó)高校醫(yī)學(xué)期刊臨床專項(xiàng)資金(No:11522538)

韓志剛，E-mail: 1378213986@qq.com

R734.2

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