劉永紅，楊淵華，梁宗鎖

(1.西安職業(yè)技術(shù)學(xué)院，a.生物工程系；b.黨委組織部，西安 710077；2浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院浙江省植物次生代謝與調(diào)控重點實驗室，杭州 310018)

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半夏組織培養(yǎng)及其生物堿代謝調(diào)控的研究

劉永紅1a，楊淵華1b，梁宗鎖2

(1.西安職業(yè)技術(shù)學(xué)院，a.生物工程系；b.黨委組織部，西安 710077；2浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院浙江省植物次生代謝與調(diào)控重點實驗室，杭州 310018)

以野生半夏塊莖為外植體，研究不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對半夏愈傷組織誘導(dǎo)的影響，發(fā)現(xiàn)MS添加0.3 mg/L Kin和1.0 mg/L IBA的培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)出分化出芽點和根的愈傷組織；MS添加0.3 mg/L NAA和1.5 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基中外植體直接分化為小塊莖。小塊莖接種于無植物生長調(diào)節(jié)劑的MS液體培養(yǎng)基中振蕩懸浮培養(yǎng)6周，逐漸抽葉長根成為半夏組培苗。比較愈傷組織、小塊莖、組培苗及野生塊莖的生物堿含量及顯微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)愈傷組織的分化程度低于半夏野生塊莖及組培小塊莖，但生物堿含量卻高于二者，分別為0.0205 、0.0189、0.0161 g/g。為消除植物生長調(diào)節(jié)劑對次生代謝產(chǎn)物積累的不確定影響，可建立一種高度分化、經(jīng)濟、穩(wěn)定的體系——無植物生長調(diào)節(jié)劑的半夏組培苗懸浮培養(yǎng)體系，為進一步的半夏生物堿代謝調(diào)控提供模式材料。

半夏；愈傷組織；組培苗；生物堿；代謝調(diào)控

0　引　言

半夏(Pinelliaternata(Thunb.) Breit.)又名地文、水玉(《本經(jīng)》)，守田、示姑(《別錄》)，羊眼半夏(《唐本草》)，是天南星科多年生草本植物。植株生3小葉的復(fù)葉，基部有珠芽，佛焰苞綠色，漿果卵狀橢圓形，全國大部分地區(qū)都有分布[1]。通常以干燥塊莖入藥，是一種常用大宗藥材。半夏所含化學(xué)成分的種類較多，但其含量都不高。已檢測分離到的半夏化學(xué)成分有生物堿、葡萄糖苷、半夏淀粉、甾醇類、氨基酸、揮發(fā)油、芳香族成分、有機酸類、黃酮類、半夏蛋白、鞣質(zhì)以及多種微量元素等[2]。生物堿是半夏藥理作用的主要成分之一，具有鎮(zhèn)吐痛，抗心律失常，抗壞血栓，抗腫瘤、抗菌、抗氧化以及糖苷酶抑制等作用[3]。

隨著野生半夏資源的減少，人工栽培半夏病毒感染導(dǎo)致的產(chǎn)量和品質(zhì)下降，通過半夏組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)脫毒苗和人工種子的研究多見報道[4-6]。而關(guān)于半夏組織培養(yǎng)中不同分化程度的愈傷組織、小塊莖、組培苗的誘導(dǎo)，以及以半夏組培苗懸浮培養(yǎng)體系研究活性成分的次生代謝調(diào)控途徑少見報道。一般情況下，研究植物次生代謝調(diào)控的材料為盆栽植物或離體植物組織及細胞培養(yǎng)，前者易受環(huán)境影響，后者由于分化程度偏低而次生代謝物含量不高[7]。本試驗探究了半夏不同分化程度組培誘導(dǎo)物,如愈傷組織、小塊莖、組培苗的誘導(dǎo)條件以及小塊莖的繼代、增殖分化情況，在此基礎(chǔ)上，嘗試了無植物生長調(diào)節(jié)劑的半夏組培苗培養(yǎng)體系的建立，并比較了半夏組培物及野生半夏的生物堿含量，以期建立一種不受植物生長調(diào)節(jié)劑干擾的、經(jīng)濟可行的、高度分化的代謝調(diào)控模式體系——無植物生長調(diào)節(jié)劑的半夏組培苗懸浮培養(yǎng)體系。

1　材料與方法

1.1材料

半夏采自陜西太白山大峪口野生半夏，經(jīng)西安職業(yè)技術(shù)學(xué)院植物學(xué)教研團隊通過形態(tài)鑒定、顯微鑒定及與標本對照，鑒定為天南星科(Araceae)半夏屬(Pinellia)植物三葉半夏(Pinelliaternata(Thunb.) Breit.)。

1.2基本培養(yǎng)條件

MS基本培養(yǎng)基,添加30 g/L蔗糖和6 g/L的瓊脂，pH值為5.8，植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA、2,4-D、IBA、NAA、Kin以不同配比添加。配好的培養(yǎng)基每100 mL 三角燒瓶中分裝25 mL左右,121 ℃高壓滅菌20 min。培養(yǎng)溫度(25±2) ℃,每天12 h光照12 h黑暗,光照強度2000～3000 lx。

1.3植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

半夏野生塊莖流水沖洗30 min，剝除表皮,用70%的酒精浸泡1 min , 無菌水沖洗后再用0.1% HgCl2溶液浸泡13 min, 無菌水沖洗后, 用滅菌的刀片切成0.5 ～ 0.8 cm3的方塊，接入以下不同MS培養(yǎng)基中：a) 0.3 mg/L 2,4-D + 2.5 mg/L Kin ; b) 0.3 mg/L 2,4-D + 2.5 mg/L 6-BA ; c) 0.5 mg/L Kin + 0.5 mg/L NAA ; d) 0.3 mg/L Kin + 1.0 mg/L IBA; e) 0.3 mg/L NAA + 1.5 mg/L 6-BA；f) 野生半夏樣品。每處理重復(fù)3次，培養(yǎng)2月后觀察結(jié)果。誘導(dǎo)出的組織培養(yǎng)物在相應(yīng)的培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)。

1.4小塊莖的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)

消毒的野生半夏塊莖，接種于g) MS + 0.3 mg/L NAA + 1.5 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6周后，誘導(dǎo)出半夏無菌苗(編號h)。將無菌苗的葉片葉柄分別切成約1.0 cm2或1.0 cm的大小，接入i) MS +0.3 mg/L NAA + 1.2 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中，每瓶接種葉片葉柄外植體5個，培養(yǎng)40 d后觀察結(jié)果。小塊莖的繼代培養(yǎng)在以下培養(yǎng)基中進行：j) MS不添加植物生長調(diào)節(jié)劑; k) MS + 0.5 mg/L NAA ;l) MS + 1.0 mg/L ABA; 組培小塊莖的生長速率(GR)、分化情況(DR)按文獻[8]方法計算。

1.5組培苗的誘導(dǎo)和液體懸浮培養(yǎng)

將在MS無植物生長調(diào)節(jié)劑固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)的小塊莖接種于無植物生長調(diào)節(jié)劑的MS液體培養(yǎng)基中。于超凈工作臺上每(4.00±0.5) g小塊莖接入含130 mL MS液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，置于28 ℃下震蕩(120 r/min)培養(yǎng)，5星期后小塊莖逐漸抽葉長根成為半夏組培苗(編號m、 n)，計算半夏組培苗的平均生長量。

1.6愈傷組織、栽培塊莖、組培塊莖顯微結(jié)構(gòu)比較

MS添加0.3 mg/L Kin和1.0 mg/L IBA培養(yǎng)基上誘導(dǎo)增殖的愈傷組織(編號d)、MS不添加植物生長調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)的小塊莖、野生半夏塊莖，分別用徒手切片法[9]制成臨時切片，觀察其顯微結(jié)構(gòu)。

1.7半夏培養(yǎng)物總生物堿的檢測

半夏野生塊莖，組培小塊莖、愈傷組織、組培苗收獲后，烘干，粉碎，采用酸性染料比色法測定總生物堿的含量[10]。實驗重復(fù)3次，取平均值。

2　結(jié)果與分析

2.1不同生長調(diào)節(jié)劑組合對半夏愈傷組織誘導(dǎo)的影響

5種不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合的培養(yǎng)基上，半夏塊莖外植體的分化狀態(tài)不同。誘導(dǎo)出不同生理狀態(tài)的愈傷組織和器官，MS添加0.3 mg/L 2,4-D和2.5 mg/L Kin的培養(yǎng)基中，外植體膨大不明顯，脫分化為白色愈傷組織；用同濃度的6-BA代替Kin，外植體脫分化為綠色的愈傷組織，其上可看到少量芽點；MS添加0.5 mg/L Kin和0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)基中，外植體膨大為疏松帶根愈傷組織；用較高濃度的IBA代替NAA時，外植體脫分化的愈傷組織長有較多芽點及根；MS添加0.3 mg/L NAA和1.5 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基中，外植體直接分化為小塊莖；可以看出，組培小塊莖的形態(tài)類似于野生半夏塊莖(圖1)。外植體在添加不同植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)進程如表1所示。

表1　不同生長調(diào)節(jié)劑組合對半夏愈傷組織和器官誘導(dǎo)的影響

注：外植體培養(yǎng)50 d后觀察結(jié)果。

圖1　不同培養(yǎng)基上半夏愈傷組織和分化器官的誘導(dǎo)情況

2.2半夏小塊莖的誘導(dǎo)和增殖分化

半夏塊莖接種在添加0.3 mg/L NAA和1.5 mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可誘導(dǎo)出半夏無菌苗。以無菌苗的葉片和葉柄為外植體，在MS 添加0.3 mg/L NAA和1.2 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基中，可誘導(dǎo)出半夏小塊莖，小塊莖繼代培養(yǎng)于MS不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中，可較長時間維持在小塊莖的狀態(tài)。添加NAA的培養(yǎng)基上，小塊莖生出較多的根；添加ABA的培養(yǎng)基上，從小塊莖上可長出二級、三級小塊莖，如圖2所示。當添加NAA和ABA后，半夏小塊莖的生長速率較不添加要高，成苗比率有所降低(表2)。

圖2　半夏小塊莖的誘導(dǎo)和增殖分化情況

培養(yǎng)基類型生長速率/(g·d-1)成苗比率/%MS+0.5mg/LNAA0.119±0.00313±4MS+1.0mg/LABA0.091±0.00211±4MS不添加植物生長調(diào)節(jié)劑0.022±0.00217±3

注：實驗重復(fù)3次，實驗結(jié)果以平均值±標準偏差表示。

2.3組培苗的誘導(dǎo)和液體懸浮培養(yǎng)生長曲線

將在MS無植物生長調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)的小塊莖接種于無植物生長調(diào)節(jié)劑的MS液體培養(yǎng)基中振蕩懸浮培養(yǎng)6周，逐漸抽葉長根成為半夏組培苗。如圖3所示。

圖3　組培苗的誘導(dǎo)和液體懸浮培養(yǎng)

圖4　半夏小塊莖組培苗在MS無植物生長調(diào)節(jié)劑的液體培養(yǎng)基中的生長曲線

組培小塊莖剛接入液體培養(yǎng)基時，增殖緩慢，可能是從固體培養(yǎng)轉(zhuǎn)入液體懸浮培養(yǎng)的一個適應(yīng)期，從第6 d開始，生長加速，開始抽芽長根，隨后逐漸長成為組培小苗，并在原有小塊莖的基礎(chǔ)上增殖出新的小塊莖，小塊莖組培苗的液體懸浮培養(yǎng)生長曲線如圖4所示。

2.4愈傷組織、組培苗小塊莖、栽培塊莖顯微結(jié)構(gòu)比較

在MS添加0.3 mg/L Kin和1.0 mg/L IBA培養(yǎng)基上誘導(dǎo)增殖的愈傷組織(d)，懸浮培養(yǎng)的組培苗塊莖，半夏野生塊莖的顯微結(jié)構(gòu)如圖5所示?？梢钥闯?，半夏愈傷組織的結(jié)構(gòu)疏松而分化程度較低，電子顯微鏡下觀察到的是細胞團。組培小塊莖的結(jié)構(gòu)相對致密些，已分化出表皮組織和基本組織。而野生塊莖的結(jié)構(gòu)高度分化，可觀察到表皮，皮層和基本組織等。在組培苗小塊莖和栽培塊莖的細胞內(nèi)都觀察到一些細胞后含物，推測可能是淀粉粒。

圖5　愈傷組織d、組培苗小塊莖、野生塊莖顯微結(jié)構(gòu)比較

2.5野生塊莖、愈傷組織、小塊莖和組培苗總生物堿含量的比較

采用酸性染料比色法測定了半夏野生塊莖、愈傷組織、組培小塊莖、組培苗的生物堿含量，發(fā)現(xiàn)在MS添加0.3 mg/L Kin和1.0 mg/L IBA培養(yǎng)基上誘導(dǎo)增殖的愈傷組織(d)生物堿含量最高，為0.0205 g/g ；野生塊莖的生物堿含量高于組培小塊莖和組培苗；而半夏組培苗的生物堿含量又高于組培小塊莖，分別為 0.0177 g/g和 0.0161 g/g(圖6)。

圖6　半夏組培誘導(dǎo)物和栽培塊莖的總生物堿含量比較

3　討　論

不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對半夏組培誘導(dǎo)物的形態(tài)發(fā)生狀況有顯著影響。添加2,4-D和Kin，外植體易愈傷化；添加NAA和IBA，外植體愈傷化的同時會產(chǎn)生根；添加6-BA，外植體易分化出芽狀結(jié)構(gòu)，這可能和這些植物生長調(diào)節(jié)劑能促進細胞分裂和分化、誘導(dǎo)根原基和芽原基形成、及其濃度相對比值的高低有關(guān)[11]。本實驗選用的5種植物生長調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)出不同形態(tài)特征的組織培養(yǎng)物，為后續(xù)不同的研究方向—細胞懸浮培養(yǎng)、芽、根、組培苗等器官懸浮培養(yǎng)打下基礎(chǔ)。

據(jù)報道，ABA主要用于抑制種子的萌發(fā)[12]，ABA作為生長抑制劑用于半夏小塊莖，其抑制小塊莖發(fā)芽的同時，促進母體小塊莖上不斷增殖出次級小塊莖[13]。在小塊莖懸浮培養(yǎng)時可添加ABA提高小塊莖的產(chǎn)量，但添加ABA用于實際生產(chǎn)的成本比較高；據(jù)報道半夏生物堿主要集中于塊莖及其根的表皮中[14]，因此推測半夏長根組培苗的生物堿含量高于無根小塊莖。半夏小塊莖無植物生長調(diào)節(jié)劑懸浮培養(yǎng)時，易抽芽長根成為半夏組培苗，檢測發(fā)現(xiàn)半夏組培苗懸浮培養(yǎng)體系的生物堿含量高于小塊莖懸浮培養(yǎng)體系，這表明組半夏培苗培養(yǎng)體系不僅方便經(jīng)濟，而且更適宜生物堿的生產(chǎn)。

形態(tài)特征及顯微結(jié)構(gòu)觀察表明，野生塊莖的分化程度高于組培小塊莖，兩者都可觀察到分化的表皮和基本組織，基本組織的細胞中貯藏有后含物淀粉粒；愈傷組織的分化程度最低，只看到一些細胞團，無淀粉粒。而生物堿含量檢測結(jié)果表明愈傷組織的生物堿含量最高，高于野生塊莖、組培苗和組培小塊莖，推測這可能和植物生長調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用有關(guān)——愈傷組培繼代培養(yǎng)于含植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中，而小塊莖和組培苗繼代于無植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中。關(guān)于植物生長調(diào)節(jié)劑對次生代謝產(chǎn)物積累的報道各有說法[15-17]，推測植物生長調(diào)節(jié)劑的添加提高了半夏生物堿代謝途徑中關(guān)鍵酶的比活力，從而促進了生物堿的合成代謝[18]。本實驗中，探討了無植物生長調(diào)節(jié)劑的組培物繼代及懸浮培養(yǎng)環(huán)境，以消除植物生長調(diào)節(jié)劑對次生代謝產(chǎn)物積累的不確定影響，為進一步建立一個相對穩(wěn)定的次生代謝調(diào)控模式體系打下基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯： 許惠兒)

Study on Tissue Culture ofPinelliaTernataand Metabolism Regulation ofPinelliaAlkaloids

LIUYonghong1a,YANGYuanhua1b,LIANGZongsuo2

(1a. Department of Bioengineering; 1b. the Party Committee Organization Department, Xi’an Vocational and Technical College, Xi’an 710077, China; 2. Key Laboratory of Plant Secondary Metabolism and Regulation of Zhejiang Province, School of Life Sciences, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China)

Tubers of wildPinelliaternata(P.ternata) were used to study the effect of different combination of plant growth regulators (PGRs) on induction ofPinelliaternatacalli. It is found that calli of buds and roots can be induced in the MS culture medium in which 0.3 mg/L Kin and 1.0 mg/L IBA are added; in the MS culture medium in which 0.3 mg/L NAA and 1.5 mg/L 6-BA are added, PLBs were induced without the formation of calli. PLBs were inoculated in MS liquid medium without PGRs, and turned intoPinelliaseedlings about 6 weeks later. Alkaloid content and microstructure of calli, PLBs, seedlings, and wild tubers were compared. It is found that differentiation rate of calli is lower than that of wild tubers and PLBs, whereas alkaloid content of calli is higher than that of wild tubers and PLBs. Alkaloid contents of calli, wild tubers and PLBs are 0.0205, 0.0189, and 0.0161 g/g, respectively. To eliminate uncertain effect of PGRs on metabolite synthesis, a highly differentiated, cheap, and stable system: free-PGR suspension cultures ofP.ternatais set up to further offer mode materials for alkaloid metabolism regulation ofP.ternata.

Pinelliaternata; calli; seedlings; alkaloids; metabolism regulation

10.3969/j.issn.1673-3851.2016.09.021

2016-03-18

陜西省教育廳科研計劃項目(15JK2159)

劉永紅(1974-)，女，陜西寶雞人，講師，博士，主要從事藥用植物學(xué)方面的研究。

梁宗鎖，E-mail：liangzs@ms.iswc.ac.cn

R932

A

1673- 3851 (2016) 05- 0759- 06 引用頁碼： 090703