李玉濤， 王　一， 徐月娟， 張艷紅， 郭士成,4， 趙振宏, 李　強, 盧大儒,6, 金　力,6,王久存,6, 錢　成, 吳俊杰,*

1.復(fù)旦大學(xué)現(xiàn)代人類學(xué)教育部重點實驗室，上?！?00433 2.東南大學(xué)第二人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，南京　210003 3.復(fù)旦大學(xué)校醫(yī)院，上?！?00433 4.Department of Bioengineering, University of California at San Diego, CA 92093, USA 5.第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海　200433 6.復(fù)旦大學(xué)(泰州)健康科學(xué)研究院，泰州　225300 7.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胸外科，上?！?00032

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·論著·

C反應(yīng)蛋白基因rs2808630、吸煙與非小細(xì)胞肺癌易感性的相關(guān)性

李玉濤1， 王一1， 徐月娟2， 張艷紅3， 郭士成1,4， 趙振宏1, 李強5, 盧大儒1,6, 金力1,6,王久存1,6, 錢成7*, 吳俊杰1,5*

1.復(fù)旦大學(xué)現(xiàn)代人類學(xué)教育部重點實驗室，上海200433 2.東南大學(xué)第二人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，南京210003 3.復(fù)旦大學(xué)校醫(yī)院，上海200433 4.Department of Bioengineering, University of California at San Diego, CA 92093, USA 5.第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海200433 6.復(fù)旦大學(xué)(泰州)健康科學(xué)研究院，泰州225300 7.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胸外科，上海200032

目的： 探討C反應(yīng)蛋白(CRP)基因rs2808630多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的相關(guān)性。方法： 根據(jù)連接酶連接反應(yīng)原理，對上海及江蘇泰州地區(qū)974例NSCLC患者和1 005例健康人進(jìn)行CRP基因rs2808630基因分型，分析該位點與NSCLC的相關(guān)性。結(jié)果： CRP基因rs2808630位點TC較TT患NSCLC風(fēng)險增加(P=0.034)，但校正后不相關(guān)。吸煙人群中該位點攜帶TC 基因型者較攜帶 TT基因型者患NSCLC風(fēng)險增加 [比值比(OR)=1.329，95% 可信區(qū)間(CI) 1.017～1.736，P=0.037]，攜帶TC基因型者患鱗癌的風(fēng)險是攜帶TT基因型者的1.383倍(95% CI 1.023～1.870，P=0.035)；進(jìn)一步分層分析發(fā)現(xiàn)，吸煙人群中攜帶TC基因型者患NSCLC的風(fēng)險是攜帶TT基因型者的1.479倍(95% CI 1.058～2.067，P= 0.022)。 結(jié)論： CRP基因rs2808630 T>C可能與吸煙協(xié)同導(dǎo)致NSCLC，尤其是鱗癌的發(fā)生。

C反應(yīng)蛋白；rs2808630位點；病例-對照研究；吸煙；非小細(xì)胞肺癌

肺癌是全球患病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，起病較為隱匿，大部分患者發(fā)現(xiàn)時已為晚期，且5年生存率低于20%[1-2]。吸煙是肺癌發(fā)生的危險因素，與肺癌患者預(yù)后相關(guān)[2-3]。肺癌分為小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)兩大類，其中NSCLC發(fā)病率占肺癌的85%～90%[2]。NSCLC主要分為腺癌、鱗癌兩種病理類型，其中鱗癌與吸煙密切相關(guān)[4]。

肺癌、肝癌、食管癌等多種癌癥的發(fā)生與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[5-6]。炎癥微環(huán)境有利于誘導(dǎo)基因突變和表觀遺傳學(xué)特征的改變，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抗凋亡、促進(jìn)癌細(xì)胞擴(kuò)散[7-8]。C反應(yīng)蛋白(Creactive protein，CRP)是一種敏感的非特異性炎癥標(biāo)志物，最初從急性肺炎球菌性肺炎患者血漿中分離得到，因其對肺炎鏈球菌C多糖有高親合性，故命名為CRP。CRP屬于pentraxin(PTX)蛋白家族，參與機(jī)體防御，能識別外來病原體和宿主的受損細(xì)胞，并通過體液和細(xì)胞免疫將其清除。巢式病例對照研究[9]顯示，CRP水平升高與肺癌風(fēng)險增加有關(guān)。在惡性腫瘤如肺癌、肝癌、大腸癌、食管癌等患者血清中CRP水平升高，且與預(yù)后較差相關(guān)[10-13]。CRP基因rs2808630的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)與非西班牙裔黑人血清中CRP水平降低相關(guān)[14]。歐洲人群的全基因組關(guān)聯(lián)分析顯示，rs2808630增加肺癌風(fēng)險[15]。因此，探索rs2808630及吸煙與中國人群肺癌發(fā)生的相關(guān)性至關(guān)重要。

1　資料與方法

1.1一般資料2009年1月—11月在第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院、江蘇省泰州市第一人民醫(yī)院等醫(yī)院收集NSCLC患者的血液樣本。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診的新發(fā)NSCLC患者，無其他器官惡性腫瘤史，無年齡、性別限制。對照組按年齡、性別和地區(qū)進(jìn)行頻數(shù)匹配，選擇同一時期相應(yīng)地區(qū)或社區(qū)健康體檢者的血液樣本。本研究通過復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院倫理委員會審核批準(zhǔn)；流行病學(xué)調(diào)查資料收集及血液樣本采集均獲得研究對象知情同意。1.2DNA提取及基因分型檢測采用Qiagen血液DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)，提取全血基因組DNA?；蚍中蜋z測參照Zhang等[16]的方法進(jìn)行。基因分型質(zhì)量控制按照質(zhì)量控制(QC)流程進(jìn)行，包括>95%的基因分型檢出率、重復(fù)檢出的基因型、內(nèi)部陽性對照樣品檢測。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行處理。人口統(tǒng)計變異值、人群吸煙狀況、癌癥家族史、對照組與病例組等位基因頻率差異及哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)檢驗采用χ2檢驗分析。分別對等位基因模型、基因型模型、顯性模型和隱性模型進(jìn)行非條件Logistic回歸分析，計算比值比(odds ratios，OR)和95%可信區(qū)間(95%CI)，校正年齡、性別、吸煙狀況和癌癥家族史后進(jìn)一步計算OR和95%CI。按年齡、性別、吸煙情況、家族史和肺癌組織學(xué)類型對各種模型分別進(jìn)行分析。檢驗水準(zhǔn)(α)為0.05。

2　結(jié)　果

2.1研究對象的一般情況納入NSCLC病例974例，其中第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院536例，復(fù)旦大學(xué)(泰州)健康科學(xué)研究院352例，上海其他醫(yī)院86例；對照組1 005例。結(jié)果(表1)顯示：病例組和對照組研究對象的年齡分布和性別構(gòu)成差異無統(tǒng)計學(xué)意義；病例組吸煙者占70.03%，對照組吸煙者占49.95%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；病例組中有癌癥家族史者占34.60%，對照組中有癌癥家族史者占14.63%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

2.2rs2808630位點多態(tài)性與NSCLC易感性相關(guān)性CRP基因rs2808630位點TT基因型1 395個、TC基因型528個、CC基因型56個，基因型檢出率為100%。CRP基因rs2808630 T/C位點基因型頻率符合HWE定律(P=0.457)，說明調(diào)查群體達(dá)到遺傳平衡，即本次群體調(diào)查數(shù)據(jù)可信。

表1　研究對象的一般情況

*部分患者的年齡和吸煙情況缺失，故未能納入統(tǒng)計

結(jié)果(表2)顯示：rs2808630位點等位基因T和C頻率在病例組中分別是82.9%和17.1%，在對照組中分別為84.7%和15.3%，兩組間等位基因頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。TC基因型個體較TT基因型個體患NSCLC的風(fēng)險明顯增加(P=0.034)，但經(jīng)性別、年齡、吸煙情況和癌癥家族史校正后兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.082)。顯性模型中，TC+CC基因型個體患NSCLC的風(fēng)險較野生純合TT基因型攜帶者增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(校正后P=0.095)。隱性模型中，CC基因型個體與TT+TC基因型個體患NSCLC的風(fēng)險差異無統(tǒng)計學(xué)意義(校正后P=0.976)。上述結(jié)果說明，rs2808630位點T>C突變與NSCLC患病風(fēng)險關(guān)系不明顯。2.3rs2808630位點多態(tài)性與NSCLC易感性的分層分析校正后分層分析顯示，等位基因T>C突變吸煙者患NSCLC風(fēng)險增加(P=0.036)，且鱗癌風(fēng)險也增加(P=0.039，表3)?；蛐湍Ｐ椭校cTT基因型吸煙者相比，TC基因型吸煙者患NSCLC的風(fēng)險增加1.329倍(OR=1.329，95%CI 1.017～1.736，P= 0.037)，且攜帶TC基因型者患鱗癌風(fēng)險增加1.383倍(OR=1.383，95%CI 1.023～1.870，P= 0.035)；攜帶CC基因型者與攜帶野生型TT基因型者的各因素差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，表明TC是rs2808630位點的NSCLC風(fēng)險基因型(表4)。顯性模型中，TC+CC基因型吸煙者較TT基因型吸煙者患NSCLC風(fēng)險顯著升高1.335倍(P=0.030)，且攜帶TC+CC基因型者鱗癌風(fēng)險是攜帶TT基因型者的1.381倍(P=0.030，表5)。隱性模型中未見陽性結(jié)果(表6)。

表2　CRP基因rs2808630多態(tài)性與NSCLC易感性相關(guān)性分析

a校正性別、年齡、吸煙情況和癌癥家族史

進(jìn)一步分層分析，吸煙者等位基因T>C的突變使患鱗癌風(fēng)險顯著上升(P=0.010)，TC基因型吸煙者患鱗癌風(fēng)險是TT基因型吸煙者的1.479倍(OR=1.479，95%CI 1.058～2.067，P=0.022；表7)。

表3　等位基因模型中CRP基因 rs2808630多態(tài)性與NSCLC易感性的相關(guān)性

a校正性別、年齡、吸煙情況和癌癥家族史中其他3種. ADC：腺癌；SCC：鱗癌

表4　基因型模型中CRP基因 rs2808630多態(tài)性與NSCLC易感性的相關(guān)性

a校正性別、年齡、吸煙狀況和癌癥家族史中其他3種. ADC：腺癌；SCC：鱗癌

表5　顯性模型中CRP 基因rs2808630多態(tài)性與NSCLC易感性的相關(guān)性

a校正性別、年齡、吸煙情況和癌癥家族史中其他3種. ADC：腺癌；SCC：鱗癌

表6　隱性模型中CRP 基因rs2808630多態(tài)性與NSCLC易感性的相關(guān)性

a校正性別、年齡、吸煙情況和癌癥家族史中其他3種. ADC：腺癌；SCC：鱗癌

表7　吸煙分層各模型中CRP基因 rs2808630多態(tài)性與鱗癌易感性的相關(guān)性

a校正性別、年齡和癌癥家族史

3　討　論

CRP能抑制MCA-38小鼠結(jié)腸腺癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[17]；人頭頸部鱗癌細(xì)胞系BHY、PCI 1和PCI 13等細(xì)胞系分泌的CRP能降低髓樣樹突狀細(xì)胞的遷移能力[18]；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞通過分泌白細(xì)胞介素-6(IL-6)誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生CRP，后者可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞釋放IL-1β，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管生成[19]。因此認(rèn)為，CRP參與癌癥的發(fā)生發(fā)展。

小鼠慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型中，香煙煙霧提取物能促進(jìn)炎癥因子釋放[20]。吸煙可導(dǎo)致人肺部炎癥和氧化應(yīng)激，增加COPD風(fēng)險[21]。CRP、纖維蛋白原和白細(xì)胞水平的同時上升與COPD 急性加重風(fēng)險增加相關(guān)[22]。COPD患者氣道出現(xiàn)過度炎癥及基質(zhì)破壞，一些蛋白家族如解毒酶、蛋白酶、抗蛋白酶和細(xì)胞因子的SNP被認(rèn)為參與COPD和肺癌的發(fā)生[23]。CRP基因rs2808630位點位于3′非翻譯區(qū)(3′untranslated region，3′UTR)遠(yuǎn)端，處于非進(jìn)化保守區(qū)域[14]。中國人群中，rs2808630與rs1205強連鎖(D’=1.0)，而rs1205 CC+CT 與COPD風(fēng)險增加相關(guān)[24]。結(jié)果提示，CRP rs2808630可能在中國人群中參與COPD、吸煙相關(guān)腫瘤的發(fā)生。

陜西省[25]、湖北省[26]人群的病例-對照研究中，CRP T>C突變與肺癌的患病風(fēng)險無顯著相關(guān)性，但這些研究中樣本量較小，且未考慮該位點在不同致病因素(如吸煙等)暴露下與肺癌易感性的關(guān)系，結(jié)果可能存在偏倚。本研究擴(kuò)大樣本量，通過吸煙、家族史、癌癥類型等分層分析，發(fā)現(xiàn)rs2808630位點TC基因型在吸煙史者中患NSCLC的風(fēng)險增加，TC基因型攜帶者患鱗癌風(fēng)險也明顯增加；進(jìn)一步分層分析顯示，攜帶TC基因型的吸煙者更易患鱗癌。此位點突變可能通過影響血清CRP蛋白水平[14]，并與吸煙共同導(dǎo)致氣道炎癥如COPD等[20-22]的發(fā)生，最終導(dǎo)致肺癌尤其是鱗癌[4]的發(fā)生。

綜上所述，CRP基因rs2808630位點TC基因型與中國人群吸煙者NSCLC發(fā)生風(fēng)險升高有關(guān)，而且，攜帶該基因型的吸煙者罹患鱗癌的風(fēng)險更顯著，提示該位點與吸煙協(xié)同參與肺癌尤其是鱗癌的發(fā)生發(fā)展，但機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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[本文編輯]姬靜芳

C-reactive protein rs2808630 T>C in smokers increases non-small cell lung cancer susceptibility

LI Yu-tao1, WANG Yi1, XU Yue-juan2, ZHANG Yan-hong3, GUO Shi-cheng1,4, ZHAO Zhen-hong1, LI Qiang5, LU Da-ru1,6, JIN Li1,6, WANG Jiu-cun1,6, QIAN Cheng7*, WU Jun-jie1,5*

1. Ministry of Education Key Laboratory of Contemporary Anthropology, Fudan University, Shanghai 200433, China 2. Department of Oncology, The Second People’s Hospital of Nanjing, Southeast University, Nanjing 210003, Jiangsu, China 3. Hospital of Fudan University, Shanghai 200433, China 4. Department of Bioengineering, University of California at San Diego, CA 92093, USA 5. Department of Respiratory Medicine, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China 6. Fudan Institute of Health Sciences, Taizhou 225300, Jiangsu, China 7. Department of Thoracic Surgery, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China

Objective： To explore the association between C reactive protein (CRP) rs2808630 and non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods： CRP rs2808630 Genotyping of 974 NSCLC patients and 1 005 healthy controls from Shanghai and Taizhou of Jiangsu Province based on double ligation and multiplex fluorescence PCR. The effect of rs2808630 on NSCLC susceptibility was analyzed. Results： Compared with TT genotype, rs2808630 TC genotype significantly increased NSCLC risk (P=0.034), but this association became insignificant after adjusting with age, gender, smoking status, and family history. However, in the subgroup of smokers, TC genotype was significantly associated with increased NSCLC risk after adjustment (OR=1.329, 95% CI 1.017-1.736,P=0.037). In addition, TC genotype exhibited a significantly elevated risk of squamous cell carcinoma (OR=1.383, 95% CI 1.023-1.870,P=0.035). Further stratified analysis revealed that TC genotype posed a much higher risk of squamous cell carcinoma among smokers (OR=1.479, 95% CI 1.058-2.067,P=0.022). Conclusions： The interaction between rs2808630 T>C and smoking behavior might play an important role in leading to NSCLC especially squamous cell carcinoma.

C-reactive protein; rs2808630; case-control study; smoking; non-small cell lung cancer

2015-12-31[接受日期]2016-03-28

國家自然科學(xué)基金(81372236)，國家科技支撐計劃重點項目(2011BAI09B00)，上海博士后科學(xué)基金(12R21411500)，上海市科學(xué)技術(shù)委員會科研計劃項目(12nm0500900)，上海國際合作基金項目(14430712002)，復(fù)旦大學(xué)高端計算中心支持項目. Supported by National Natural Science Foundation of China (81372236), Key Projects in the National Science & Technology Pillar Program (2011BAI09B00), Shanghai Postdoctoral Science Foundation (12R21411500), Shanghai Science and Technology Research Program (12nm0500900), Shanghai Foundation for International Cooperation (14430712002) and Fudan University High-End Computing Center Fund.

李玉濤，碩士. E-mail:18721714989@163.com

Corresponding authors). Tel: 021-64041990, E-mail: qian.cheng@zs-hospital.sh.cn; Tel: 021-31162477, E-mail: wjjxcc@126.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20151059

R 734.2

A