利用發(fā)酵法生產(chǎn)四甲基吡嗪研究進展

侯孝元 顧如林 梁文龍 肖梓軍

（中國石油大學（華東）生物工程與技術中心，青島 266580）

利用發(fā)酵法生產(chǎn)四甲基吡嗪研究進展

侯孝元 顧如林 梁文龍 肖梓軍

（中國石油大學（華東）生物工程與技術中心，青島 266580）

2，3，5，6-四甲基吡嗪（2，3，5，6-Tetramethylpyrazine，TTMP）是一種重要的食品香料添加劑，同時具有治療心腦血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病和腎小球疾病等的藥用價值?；仡櫫宋⑸锇l(fā)酵法生產(chǎn)TTMP的研究進展，并分析了TTMP的產(chǎn)生機制，總結(jié)了提高生產(chǎn)TTMP的有效途徑，包括篩選內(nèi)源性高產(chǎn)菌株、發(fā)酵過程優(yōu)化、外源添加銨鹽和分階段的發(fā)酵控制等策略。提出合成TTMP的過程是一個生化反應過程，是生物酶催化代謝產(chǎn)生乙偶姻和乙偶姻與銨離子自發(fā)生成TTMP兩個階段綜合作用的結(jié)果，利用分階段溫度控制的發(fā)酵策略可有效提高TTMP產(chǎn)量。對產(chǎn)物的提取和純化進行了介紹，并根據(jù)目前的進展、面對的挑戰(zhàn)和發(fā)展趨勢對發(fā)酵法生產(chǎn)TTMP研究前景進行了展望。

2，3，5，6-四甲基吡嗪；發(fā)酵；合成機理；高產(chǎn)策略

近年來隨著石化原料的逐漸短缺和由此帶來的環(huán)境惡化等問題，利用可再生資源為原料加工生產(chǎn)化學品可以從源頭解決資源短缺和環(huán)境污染問題，實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展。目前市場上銷售的四甲基吡嗪主要是化學法合成的，普遍存在污染環(huán)境問題。而生物發(fā)酵生產(chǎn)的2，3，5，6-四甲基吡嗪（2，3，5， 6-Tetramethylpyrazine，TTMP）雖然價格昂貴，但消費者更傾向于這種天然TTMP產(chǎn)品。直接從植物中提取TTMP，因植物中含量少提取率不高而沒能實現(xiàn)工業(yè)化，利用微生物發(fā)酵工程合成天然TTMP則具有良好發(fā)展前景成為研究焦點。

本文將從TTMP的生產(chǎn)現(xiàn)狀和合成機理出發(fā)，結(jié)合本課題組前期的研究成果，綜述微生物發(fā)酵生產(chǎn)TTMP取得的進展與成就，包括菌種的發(fā)現(xiàn)與改造、發(fā)酵過程的培養(yǎng)基優(yōu)化與過程控制、高效分離提取工藝等方面，旨為后續(xù)有關提高TTMP產(chǎn)量的研究究提供參考。

1 TTMP的用途和生產(chǎn)現(xiàn)狀

1.1 TTMP的用途

TTMP是一類含氮的雜環(huán)化合物，具有烘烤和堅果的特殊香味［1］，其香味閾值極低，被廣泛應用于食品添加劑。TTMP天然存在于乳制品、豆制品、榛子、醋、面包、酒精類飲料和咖啡等食品中［2，3］，賦予其特殊香味。影響微生物發(fā)酵生產(chǎn)TTMP的一種重要中間產(chǎn)物是乙偶姻，即3-羥基-2-丁酮，乙偶姻具有令人愉悅的奶油香氣，作為食品香味添加劑被廣泛應用［3］，但乙偶姻的分離提取較困難。

TTMP不僅用作食品、飲料等行業(yè)的香味添加劑，在醫(yī)學上TTMP是中草藥川芎根莖的主要活性生物堿成分，具有擴張血管、抑制血小板黏附聚集和血栓形成等良好的藥理作用［4］，是重要的醫(yī)藥中間體，引起國內(nèi)外學者的廣泛關注。隨著對TTMP研究的深入，發(fā)現(xiàn)其在治療心腦血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病和腎小球疾病等方面具有一定療效［5-8］。中國白酒在制曲和堆積發(fā)酵中產(chǎn)生四甲基吡嗪，經(jīng)蒸餾帶入酒中，賦予中國白酒以健康功能［9］。食醋在發(fā)酵和儲存過程也能產(chǎn)生吡嗪［10］，使其具有降血糖血脂及促進鈣的吸收等功效［11-13］。

1.2 微生物發(fā)酵生產(chǎn)TTMP現(xiàn)狀

生產(chǎn)TTMP的方法主要有直接從植物中提取、化學合成和生物合成3種。直接萃取法由于提取原料來源有限，且在原料中TTMP含量少，提取產(chǎn)量低，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。TTMP的化學合成法的化學合成成本較低，但原料來源短缺和易造成環(huán)境污染，且反應一般較劇烈，對設備要求也較高［14-18］。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)TTMP，主要以糖為碳源，經(jīng)微生物發(fā)酵和化學反應制得天然TTMP，已知能生產(chǎn)TTMP的菌種包括谷氨酸棒狀桿菌突變菌株［19］、乳酸桿菌［20］和芽孢桿菌及其突變菌株［21］，其中以芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)量最高，研究最多。生物合成法優(yōu)點在于原料來源廣、反應條件溫和、環(huán)境污染小、產(chǎn)品綠色天然，缺點是產(chǎn)量較低、價格高。

利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)TTMP的相關研究起步較晚，生物合成途徑生產(chǎn)TTMP的技術遠未成熟。1993年，Yamaguchi等［22］以葡萄糖為碳源利用Bacillus natto液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的總吡嗪量為42 mg/L。Besson等［23，24］通過向固體培養(yǎng)基中添加乙偶姻來提高TTMP產(chǎn)量，雖然TTMP產(chǎn)量明顯提高，最終產(chǎn)量也僅為0.58 g/L，對于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)來說，TTMP產(chǎn)量仍很低。由此可見，直接利用野生菌發(fā)酵生產(chǎn)TTMP的產(chǎn)量較低。為進一步提高微生物發(fā)酵生產(chǎn)TTMP的能力，需要利用多種生物工程技術來提高微生物生產(chǎn)TTMP的能力，這些生物工程技術包括優(yōu)良菌株的選育和誘變技術，以及優(yōu)化培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件的發(fā)酵工程技術。

利用多種生物工程技術提高TTMP產(chǎn)量，經(jīng)過系統(tǒng)的研究后，Xiao等［21］經(jīng)誘變篩選獲得一株突變菌，用廉價的大豆胨和維生素代替蛋白胨和酵母粉，在5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵，并在培養(yǎng)基中加入磷酸氫二銨（Diammonium phosphate，DAP），TTMP產(chǎn)量達到4.33 g/L。有機氮源的替換和DAP的加入使發(fā)酵生產(chǎn)TTMP的研究有了快速的發(fā)展。

2 合成機理研究

1962年，Kosuge等［25］首次在枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中檢測到特殊香味物質(zhì)，然后經(jīng)過分離得到的晶體經(jīng)分析其結(jié)構(gòu)為甲基取代的含氮雜環(huán)化合物TTMP。Reineccius等［26］在可可豆的發(fā)酵物中檢測到TTMP，進一步驗證了微生物具有代謝產(chǎn)生TTMP的能力。從首次發(fā)現(xiàn)微生物能夠發(fā)酵生產(chǎn)TTMP后，關于微生物中TTMP生成機制就一直是研究的焦點。

Kosuge等［27］提出生物發(fā)酵液中TTMP是由芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的乙偶姻與氨基酸反應生成，但對于氮以何種形式與乙偶姻反應并未涉及。Besson等［23，24］通過向Bacillus subtilis IFO 3013的發(fā)酵液中外源添加乙偶姻，經(jīng)檢測TTMP的生成速率和最終產(chǎn)量明顯提高，提出乙偶姻是合成TTMP的重要前體。Adachi等［28，29］通過向培養(yǎng)基中分別加入氨基酸（甘氨酸、谷氨酸、纈氨酸、精氨酸或天冬氨酸）和氯化銨作為唯一氮源，均可檢測到TTMP的生成，作者提出發(fā)酵體系中TTMP是由發(fā)酵產(chǎn)生的乙偶姻與氨基酸的氨基部分形成，參與反應的可能是銨離子。Huang等［30］利用乙偶姻與醋酸銨反應模型體系，利用同位素標記的方法對中間體二氫吡嗪進行定性，提出TTMP是由乙偶姻和銨離子反應生成。目前普遍接受的TTMP合成機理是微生物通過糖類代謝產(chǎn)生乙偶姻后再與銨離子反應產(chǎn)生TTMP。

關于乙偶姻與銨離子的反應機制一直存在爭議，爭議的核心問題是發(fā)酵體系中微生物代謝產(chǎn)生的乙偶姻與銨離子反應生成TTMP過程是否為酶促反應。一些人認為此過程是酶促反應，但對與之相關的酶或基因并未有報道。另一觀點是，TTMP生成過程是一種生物化學-化學（Biochem-chem）反應過程，即乙偶姻是在生物酶催化下合成的，但從乙偶姻到TTMP的生成是一種非酶催化的自發(fā)過程。Kim等［20］通過發(fā)酵和化學合成偶聯(lián)方式實現(xiàn)乙偶姻與銨離子反應合成TTMP，驗證了第二種觀點［31］。吳建峰等［32］利用B. subtilis S12產(chǎn)TTMP原位反應驗證乙偶姻與銨離子反應過程與生物酶無關。Xiao等［33］利用兩步溫控法，進一步驗證乙偶姻與銨離子的反應為非酶催化的熱力學自發(fā)過程。

以上研究證實生物發(fā)酵生產(chǎn)TTMP是由乙偶姻和銨離子反應產(chǎn)生的，因此發(fā)酵生產(chǎn)TTMP實際分為兩個階段：第一階段是微生物發(fā)酵產(chǎn)生前體乙偶姻（圖1-The 1st step）；第二個階段是乙偶姻與銨離子反應生成TTMP，該過程為自發(fā)的熱力學過程（圖1-The 2nd step）。銨離子可經(jīng)氨基酸降解產(chǎn)生［30］，也可直接來源于外源添加的無機銨鹽［21，32，34］。

除主要產(chǎn)物TTMP外，可檢測到一些副產(chǎn)物OXZ、2，3，5-三甲基吡嗪和2-乙基-3，5，6-三甲基吡嗪［21，33，36］。兩步溫控的反應過程顯示，生成OXZ的反應可逆，隨反應進行生成的OXZ又分解用來合成TTMP，而且此可逆反應受溫度影響明顯，當溫度較高時，基本檢測不到OXZ的生成［33］。根據(jù)發(fā)酵生產(chǎn)TTMP的反應機制，提高微生物發(fā)酵生產(chǎn)TTMP的方法有兩種：一是獲得優(yōu)良菌株，提高前體乙偶姻的積累量；二是向發(fā)酵液中添加銨鹽提高乙偶姻轉(zhuǎn)化率和四甲基吡嗪的產(chǎn)率。

圖1 TTMP和副產(chǎn)物合成途徑［33，35］

3 高產(chǎn)策略

3.1 提高發(fā)酵液中前體乙偶姻的量

最早關于提高TTMP產(chǎn)量主要從發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化和培養(yǎng)條件優(yōu)化兩方面進行。發(fā)酵培養(yǎng)基主要考慮碳源和氮源的優(yōu)化，微生物對碳源的利用具有選擇性，選擇合適碳源能加快細胞生長與代謝產(chǎn)物合成。氮源對微生物的生長發(fā)育具有重要作用，它們主要用來合成細胞中的含氮物質(zhì)。培養(yǎng)條件主要從pH、溫度和溶氧量3個方面優(yōu)化，pH是影響微生物生長的重要環(huán)境參數(shù)；溫度不僅影響微生物的生長，而且對代謝過程中的關鍵酶活性也有重要影響，從而影響代謝產(chǎn)物的合成；溶氧量對細胞生長、代謝途徑和產(chǎn)物的生成產(chǎn)生影響，溶氧量高有利于代謝產(chǎn)生更多乙偶姻，減少副產(chǎn)物乙醇、乳酸等的產(chǎn)生。

上述方法主要是通過影響生物本身生理代謝，提高乙偶姻的量來增加TTMP的產(chǎn)量。雖然可以提高發(fā)酵液中乙偶姻的量，但改變不明顯。外源添加前體乙偶姻可以有效提高TTMP的產(chǎn)量［23，24］，但乙偶姻價格較高，且高濃度的乙偶姻對細胞具有毒性，破壞細菌原有代謝平衡，而且外源添加的乙偶姻利用率不高［24］，因此篩選和誘變來獲得內(nèi)源性積累前體乙偶姻的菌種至關重要。

大部分TTMP合成菌株是一類產(chǎn)芽孢的桿菌屬，受先前關于用芽孢桿菌進行吡嗪發(fā)酵研究報告的啟發(fā)［23，24］，Xiao等［21］采取生理富集的策略來篩選菌株，首先將菌懸液80℃熱處理10 min，然后涂布進行初篩，最后誘變處理復篩獲得TTMP高產(chǎn)菌株Bacillus sp. RX3-17，TTMP產(chǎn)量達到4.33 g/L。Zhu等［37］利用類似方法加熱處理酒曲后篩選，從中篩得一株內(nèi)源性積累前體乙偶姻的菌株B. subtilis XZ1124，其TTMP的產(chǎn)量達到4.08 g/L，再次證明熱處理方法篩選產(chǎn)芽孢類TTMP高產(chǎn)菌株的有效性。

上述篩選內(nèi)源前體乙偶姻積累菌株的策略是根據(jù)芽孢耐受高溫的特性，熱處理后再篩選可減少工作量。篩選得到的菌株前體乙偶姻是逐漸積累的，避免外源添加對細胞毒性較大的缺點。Xiao等［38］綜述了提高發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻產(chǎn)量的策略，主要從菌種篩選，基因工程，培養(yǎng)基優(yōu)化，發(fā)酵過程控制等方面論述提高乙偶姻產(chǎn)量的方法，對提高微生物合成TTMP產(chǎn)量具有重要指導意義。

3.2 增加銨離子來源

TTMP分子結(jié)構(gòu)中的氮來源于銨離子，因此提高發(fā)酵體系中銨離子的濃度有利于促進TTMP的合成。培養(yǎng)基中加入的有機氮源，在微生物發(fā)酵過程產(chǎn)生少量的銨離子，不能滿足乙偶姻向TTMP轉(zhuǎn)化時的需求，因此需要外源添加無機銨鹽，例如硫酸銨、碳酸銨、硝酸銨、醋酸銨、草酸銨和磷酸銨等，可提高乙偶姻的利用率。不同的銨鹽對產(chǎn)量的影響效果不同，研究表明當加入磷酸銨鹽時，對TTMP生成速率和產(chǎn)量影響最大［21，39，40］。發(fā)酵培養(yǎng)基中加入過多銨鹽對細胞生長和糖的利用不利，需要確定合適的銨鹽加入量。利用銨鹽的補加策略，在發(fā)酵合成乙偶姻的后期獲得大量乙偶姻時，加入適量的銨鹽可避免對細胞生長的抑制。

選擇合適的銨鹽有兩層意義，一是滿足細胞生長的需求以及與乙偶姻反應的需要，二是穩(wěn)定和調(diào)節(jié)反應過程的pH。Huang［34］發(fā)現(xiàn)磷酸銨中的磷酸根在乙偶姻與銨離子反應形成席夫堿的過程作為質(zhì)子供體和受體，而且過量的磷酸根可以維持反應液的pH穩(wěn)定在中性，更有利于TTMP的形成。

3.3 分階段控制策略

雖然發(fā)酵過程添加乙偶姻和銨鹽可以提高TTMP的產(chǎn)量，但兩種物質(zhì)的加入在一定程度上破壞微生物原有的代謝平衡，引起微生物數(shù)量的減少，從而引起乙偶姻積累量的降低，使TTMP的產(chǎn)量降低，而兩階段策略解決了上述矛盾。分階段策略包括糖補加策略、銨鹽補加策略、分階段pH控制策略和兩步溫度控制策略。

乙偶姻是微生物的初級細胞代謝產(chǎn)物，生產(chǎn)TTMP菌株以糖為碳源，已知菌種主要以葡萄糖和蔗糖為碳源，因此提高培養(yǎng)基中糖濃度有利于乙偶姻的積累，然而細胞對糖的濃度有耐受范圍，高濃度糖導致細胞生長環(huán)境滲透壓增高，抑制細胞生長。糖濃度因素限制了更高濃度乙偶姻的獲得，但分批量的加入糖，使細胞快速增值和代謝，積累前體乙偶姻，發(fā)酵后期積累一定量乙偶姻時補加無機銨鹽，使乙偶姻快速轉(zhuǎn)化為TTMP，提高乙偶姻的有效利用率和TTMP產(chǎn)量。Hao和Xu［41］和徐巖和朱朱峰［42］以枯草芽孢桿菌利用上述糖補加策略和銨鹽補加策略：首先在培養(yǎng)基中分批添加葡萄糖使菌體能夠發(fā)酵產(chǎn)生大量乙偶姻，在發(fā)酵液中加入磷酸銨鹽，補充銨離子促進TTMP合成，經(jīng)過補加策略乙偶姻的積累量和TTMP的產(chǎn)量分別提高了2.4倍和6.8倍。

研究發(fā)現(xiàn)，乙偶姻與銨離子反應生成TTMP過程在pH為中性時轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量最高，而不同微生物其最適生長pH不同。如Bacillus subtilis CCTCC M208157菌株在pH5.5時生長最快，乙偶姻的生成速度快，積累量高。Zhu等［43］控制pH5.5時發(fā)酵獲得最大乙偶姻積累量，再調(diào)節(jié)pH至7.0，實現(xiàn)乙偶姻向TTMP的快速轉(zhuǎn)化，最終獲得TTMP產(chǎn)量為7.43g/L，產(chǎn)量提高22.2%［43］。利用兩階段pH控制策略，可明顯提高前體乙偶姻的積累量和TTMP的產(chǎn)量。

上述策略雖提高TTMP產(chǎn)量，但因發(fā)酵后期菌體還有活性，不可避免的引起酶催化下乙偶姻的降解，且低溫乙偶姻和銨離子的反應速率低，銨鹽的加入影響乙偶姻的積累等導致TTMP產(chǎn)量變化較小。TTMP生物合成機制的研究顯示從乙偶姻到TTMP的反應是自發(fā)的非酶催化反應，乙偶姻與銨離子的反應是在熱動力學作用下進行的，因此升高溫度可加快反應，縮短反應時間，增加TTMP產(chǎn)量。Xiao等［33］利用兩步溫度控制策略，以Bacillus subtilis CICC 10211菌株在37℃下發(fā)酵積累乙偶姻，當發(fā)酵29 h后，微生物開始消耗乙偶姻，此時停止發(fā)酵過程，向發(fā)酵液中加入磷酸氫二銨（按乙偶姻與銨離子比為1∶3），升高反應溫度（65℃至95℃），反應溫度95℃時，得到TTMP含量為8.34 g/L的發(fā)酵液，這是有報道芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)TTMP的最高水平，檢測顯示隨溫度升高反應速率和產(chǎn)量都增加，但溫度提高容易引起TTMP的揮發(fā)和能量消耗。

3.4 添加氧化劑

經(jīng)過上述多種方法，TTMP產(chǎn)量得到大幅度提高，但乙偶姻與銨離子反應生成TTMP的產(chǎn)率低。導致產(chǎn)率低的原因可能是在TTMP的生成過程存在中間體2，3，5，6-四甲基-2，5-二氫吡嗪，需要氧化反應脫去兩個氫才能生成TTMP。此過程可能為歧化反應，二氫吡嗪部分氧化為TTMP，另一部分轉(zhuǎn)化為還原產(chǎn)物，但在此過程通入氧氣并不能增加氧化產(chǎn)物的比例［31］。加入較強氧化劑，可能會增加TTMP的產(chǎn)量，因此在兩步溫控反應第二階段，向發(fā)酵液中加入強氧化劑雙氧水檢測TTMP產(chǎn)量的變化，結(jié)果表明強氧化劑雙氧水的加入可以明顯增加產(chǎn)物TTMP的量。通過以上不同高產(chǎn)策略的實施，TTMP產(chǎn)量有所提高，不同菌株TTMP生產(chǎn)能力比較，見表1。兩步溫度控制的發(fā)酵策略是目前最有效的提高TTMP產(chǎn)量的方法。

表1 不同高產(chǎn)策略下TTMP的產(chǎn)量

4 TTMP的分離提取

乙偶姻容易溶于水和有機溶劑的獨特性質(zhì)，使其下游過程很難找到一種高效的分離方法，相對于乙偶姻的分離提取，TTMP的純化更簡單，因此將發(fā)酵液中的乙偶姻轉(zhuǎn)化為易分離的TTMP，不僅避免乙偶姻回收困難，而且增加了產(chǎn)品價值，這種方法稱作FDR［38］（Fermentation-Derivatization-Recovery）。

TTMP溶解度對溫度很敏感，當溫度為37℃時，溶解度為4.77 g/L，當溫度為4℃時，TTMP在水中的溶解度為1.06 g/L，低溫時溶解度較小，因此從復雜的發(fā)酵液中分離得到TTMP的方法相對比較簡單。直接將反應結(jié)束后的反應液降溫析出晶體，過濾并用冰水洗滌即可得到純度達到99%的TTMP。該方法得到的TTMP純度高，但總的收率較低，主要是過濾洗滌晶體過程，濾出液中仍溶解有較多TTMP，這部分產(chǎn)品可再經(jīng)蒸發(fā)、結(jié)晶、過濾等步驟回收。TTMP易揮發(fā)，反應液經(jīng)蒸餾得到的餾分，利用冷凍干燥回收TTMP，可以獲得更高的回收率，但處理方法復雜，需要大量能量，不適宜工業(yè)生產(chǎn)。

5 展望

TTMP作為香味添加劑和醫(yī)藥中間體，需求量越來越大。目前，基于化石原料的化學合成法是TTMP工業(yè)生產(chǎn)的主要方法，面臨資源短缺和環(huán)境污染問題，而隨著微生物發(fā)酵生產(chǎn)TTMP研究的不斷發(fā)展，天然TTMP產(chǎn)品產(chǎn)量會不斷增加，產(chǎn)品更受消費者青睞，發(fā)展前景更廣闊。

雖然經(jīng)過眾多研究人員不斷研究，微生物發(fā)酵生產(chǎn)TTMP的產(chǎn)量有所提高，但還不適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。限制性因素主要有微生物發(fā)酵產(chǎn)生的乙偶姻量少、乙偶姻向TTMP轉(zhuǎn)化率低和TTMP回收率低，要克服這些瓶頸問題，主要從以下方面考慮。（1）提高菌株內(nèi)源性乙偶姻積累量。菌株對乙偶姻的耐受性有限，不利于乙偶姻的積累，因此篩選內(nèi)源性高產(chǎn)乙偶姻菌種，利用基因工程獲得乙偶姻高產(chǎn)菌株來提高發(fā)酵產(chǎn)生的乙偶姻量是研究重點。（2）提高乙偶姻有效轉(zhuǎn)化率。乙偶姻和銨根離子反應生成TTMP時最高產(chǎn)量也僅為理論產(chǎn)量的53%，需進一步探究轉(zhuǎn)化率低的原因，提高乙偶姻有效利用率獲得更高產(chǎn)量的TTMP。（3）提高回收率。已知TTMP分離提取方法回收率不高，造成產(chǎn)品浪費。微生物生產(chǎn)的主要弊端是發(fā)酵液成分復雜，產(chǎn)物不易分離純化，因此優(yōu)化培養(yǎng)基組成、開發(fā)高效率低成本的分離純化方法是提高TTMP回收率，降低生產(chǎn)成本，促進TTMP大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)前體。

目前微生物發(fā)酵生產(chǎn)TTMP，主要是以葡萄糖為碳源，因此開發(fā)能夠利用其它糖（如木糖）為碳源的菌株，利用價值更高。

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（責任編輯狄艷紅）

Research Progress on Production of Tetramethylpyrazine by Fermentation

HOU Xiao-yuan GU Ru-lin LIANG Wen-long XIAO Zi-jun
（Centre for Bioengineering & Biotechnology，China University of Petroleum，Qingdao 266580）

2，3，5，6-tetramethylpyrazine（TTMP）as an important food flavor additive， it has additional medicinal values， such as in cardiovascular and cerebrovascular health， respiratory system diseases and glomerular disease. In this paper， we reviewed the research progress on fermentation production of TTMP， analyzed the synthesis mechanism of TTMP， and summarized the effective strategies to increase the yield of TTMP， including the screening of endogenous high-yield strains， the optimization of fermentation process， the feeding of ammonium salt，and multi-step fermentation control. We concluded that the production of TTMP can be divided into two stages， i. e. the enzymatic synthesis of precursor acetoin and then the spontaneous condensation of TTMP from acetoin and ammonium. Further， the fermentation strategy with multiplestep temperature control effectively increased the production yield. The extraction and purification of the product were introduced as well. The future prospects of fermentation production of TTMP are discussed in light of the current progress， challenges， and trends in this field.

2， 3， 5， 6-tetramethylpyrazine；fermentation；synthesis mechanism；high-yield strategies

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.010

2015-03-25

國家自然科學基金項目（21376264）

侯孝元，男，碩士，研究方向：微生物發(fā)酵與酶催化；E-mail：hxyuan111@126.com

肖梓軍，男，博士，副教授，研究方向：微生物技術；E-mail：zjxiao@upc.edu.cn