ARTP技術(shù)選育吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)菌株及發(fā)酵優(yōu)化

譚劍 熊欣 梁萬利 彭華松 張雪洪

（上海交通大學 微生物代謝國家重點實驗室，上海 200240）

ARTP技術(shù)選育吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)菌株及發(fā)酵優(yōu)化

譚劍 熊欣 梁萬利 彭華松 張雪洪

（上海交通大學 微生物代謝國家重點實驗室，上海 200240）

從一株高產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺（PCN）的綠針假單胞菌P3株出發(fā)，利用常壓室溫等離子體誘變技術(shù)進行誘變育種，從初篩的20株突變株中獲得了一株P(guān)CN產(chǎn)量達到2 093 mg/L的突變株P(guān)3-9，為出發(fā)菌株的125%。隨后通過單因素實驗考察了各種營養(yǎng)因子對該高產(chǎn)菌株合成PCN的影響，結(jié)果表明發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源、氮源分別為甘油和蛋白胨，外源添加Fe3+或Fe2+對于積累PCN有顯著促進作用，而添加苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸對PCN產(chǎn)量無明顯影響。優(yōu)化后，該突變株的PCN產(chǎn)量高達2 810 mg/L，是目前國際上通過誘變育種獲得的較高PCN產(chǎn)量。

吩嗪-1-甲酰胺；常壓室溫等離子體；培養(yǎng)基優(yōu)化

吩嗪-1-甲酰胺（Phenazine-1-carboxamide，PCN）是一種天然的吩嗪類化合物，具有廣譜的抗真菌活性，主要由假單胞菌屬合成［1-3］。與已經(jīng)獲得的農(nóng)藥藥證的第一代吩嗪類生物農(nóng)藥——申嗪霉素［4，5］相比，該抗生素具有更好的安全性、穩(wěn)定性及對植物病原真菌的抑菌活性［6，7］，在防治水稻紋枯病和小麥赤霉病等方面具有重要的應(yīng)用價值［8］。據(jù)報道，目前能合成PCN的微生物菌株有綠針假單胞菌PCL1391［2］，銅綠假單胞菌PAO1［9］，PUPa3［10］，PUP6［11］，MML221［8］等，但由于PCN產(chǎn)率較低，尚未能大規(guī)模推廣應(yīng)用。

由清華大學和北京思清源生物科技公司合作研發(fā)的常壓室溫等離子體（Atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變育種系統(tǒng)利用了ARTP在放電時產(chǎn)生的各種電子流對微生物基因進行損傷從而誘導其進行誘變，能在常壓室溫下操作，具有成本低、安全性高、操作簡便等優(yōu)越性，取得了良好的實際應(yīng)用效果［12，13］。綠針假單胞菌HT66為本實驗室從水稻根際分離的一株可以天然合成吩嗪-1-甲酰胺（PCN）的野生型菌株，PCN產(chǎn)量可達425 mg/L，是目前國際上報道的吩嗪化合物產(chǎn)量最高的野生菌株；張平原［14］從綠針假單胞菌HT66出發(fā)，經(jīng)過多輪的紫外線和亞硝基胍處理，獲得了高產(chǎn)突變株P(guān)3，PCN產(chǎn)量為野生株的3.9倍。為了避免長期使用相同誘變技術(shù)導致菌株出現(xiàn)鈍化現(xiàn)象，本研究以P3為出發(fā)菌株，嘗試以一種新型的ARTP技術(shù)進行誘變育種［15，16］，并對突變株的發(fā)酵條件進行初步的優(yōu)化，進一步提高PCN產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

出發(fā)菌株：綠針假單胞菌P3（Pseudomonas Chlororaphis P3），由實驗室保存。

King’s B固體培養(yǎng)基［17，18］（g/L）：蛋白胨20，甘油 18.915，K2HPO40.514，MgSO40.732，瓊脂20，pH 7.5。

種子培養(yǎng)基（g/L）：成分除無瓊脂外同King’s B固體培養(yǎng)基，60 mL裝于250 mL凹槽三角瓶中。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：基礎(chǔ)成分同種子培養(yǎng)基，具體成分實驗中優(yōu)化。

1.2 方法

1.2.1 PCN檢測方法 取24 h發(fā)酵液0.4 mL，加入20 μL 6 mol/L鹽酸酸化后，用3.6 mL乙酸乙酯震蕩萃取5 min，取0.4 mL萃取液吹干后加入1 mL乙腈溶解，以HPLC檢測。

HPLC檢測條件：色譜柱為WondaSil-WR反相柱，流動相為乙腈-25 mmol/L乙酸銨，流動相比例：0-2min，8%乙腈-92% 25 mmol/L乙酸銨；2-20 min，乙腈濃度由8%升至60%，乙酸銨濃度由92%下降至40%；20-21 min，8%乙腈-92%乙酸銨。檢測波長254 nm，柱溫30℃，流速1.0 mL/min。

1.2.2 ARTP誘變 本實驗以PCN高產(chǎn)突變株P(guān)3作為出發(fā)菌，利用ARTP技術(shù)對菌株進行誘變處理。取對數(shù)期的P3菌懸液（OD600值為0.6左右），用0.01 mol/L PBS緩沖液洗滌3次后取10 μL的菌液均勻涂抹于金屬載片。設(shè)置儀器功率為100 W，氣流量10 SLM，照射距離2 mm。實驗中以時間為變量，各組處理時間分別為0 s、20 s、30 s、45 s、60 s、90 s、120 s，制作致死率曲線。根據(jù)致死率，以20s照射時長為最佳誘變條件重復等離子體的照射誘變，以獲得最佳誘變效果。將誘變菌液稀釋后涂布King’s B平板，觀察菌株在平板上的生長情況，根據(jù)菌落產(chǎn)生PCN晶體的時間和大小初步篩選出高產(chǎn)突變株，最后進行搖瓶發(fā)酵，HPLC檢測PCN產(chǎn)量。1.2.3 不同營養(yǎng)因子對PCN發(fā)酵的影響

1.2.3.1 碳源的影響 在King’s B培養(yǎng)基中，以等摩爾數(shù)的碳原子為基準分別添加甘油、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖作為碳源，28℃，180 r/min，搖床培養(yǎng)24 h后檢測PCN產(chǎn)量，每組設(shè)3個平行實驗。

1.2.3.2 氮源的影響 根據(jù)不同氮源的含氮量，往King’s B培養(yǎng)基中分別添加相同摩爾量的有機氮源（蛋白胨、玉米漿、牛肉膏）和無機氮源（硫酸銨）作為氮源，其他條件同上。

1.2.3.3 微量元素的影響 根據(jù)植物根際中礦物質(zhì)成分分布，分別添加Cu2+、Fe3+、Mn2+和Zn2+四種陽離子為考察對象，陽離子最終濃度為1 mmol/L，保持陰離子為Cl-，其他條件同上。

1.2.3.4 氨基酸的影響 分別添加等摩爾濃度（1mmol/L或5 mmol/L）的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸到King’s B培養(yǎng)基中，并設(shè)空白對照組，其他條件同上。

2 結(jié)果

2.1 誘變菌株的篩選

2.1.1 ARTP誘變致死率曲線 根據(jù)致死率公式制作綠針假單胞菌P3株的誘變致死率曲線，如圖1所示。

由圖1-A可知，等離子體照射與P3株的致死率存在著明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。照射時間20 s時，致死率為77.54%；照射時間45-90 s時，致死率在98%以上；照射時間為120 s時，菌株被完全殺死。為保證較高的正突變率，可使致死率保持在75%左右，因此本實驗選擇20 s為最適宜的照射時長，并進行多次誘變實驗，結(jié)果如圖1-B所示。

圖1 綠針假單胞菌P3株的ARTP致死率曲線（A）和平板培養(yǎng)菌落圖（B）

2.1.2 誘變株篩選與PCN產(chǎn)量測定 經(jīng)過ARTP誘變處理，根據(jù)固體平板培養(yǎng)基上單菌落產(chǎn)生綠色結(jié)晶（PCN）時間的先后和晶體量篩選出20株突變株，進行在King’s B培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)，并通過HPLC檢測PCN產(chǎn)量，如圖2所示。大部分初篩的誘變菌株P(guān)CN產(chǎn)量與出發(fā)菌株P(guān)3相比均有提高，只有少量菌株產(chǎn)量降低（圖2-A）；其中，誘變株P(guān)3-9產(chǎn)量最高，為P3株的125%左右，達到2 093 mg/L，說明ARTP誘變對于提高菌株P(guān)CN產(chǎn)量有著良好的效果，并選擇突變株P(guān)3-9進行后續(xù)實驗。圖2-B為突變株P(guān)3-9的HPLC檢測圖，PCN保留時間為17.199 min。

2.2 發(fā)酵優(yōu)化

2.2.1 碳源對PCN合成的影響 考察5種發(fā)酵常用碳源對PCN產(chǎn)量的影響，結(jié)果（圖3）表明不同的碳源對PCN產(chǎn)量影響差異很大。其中，以甘油為碳源的培養(yǎng)基中PCN產(chǎn)量最高，為2 100 mg/L左右，而以麥芽糖作為碳源PCN產(chǎn)量僅為不到100 mg/L，以葡萄糖及蔗糖為碳源時的PCN產(chǎn)量稍高于空白組，分別為161 mg/L和234 mg/L。

圖2 ARTP誘變初篩菌株與出發(fā)菌株P(guān)3的PCN產(chǎn)量比（A）和菌株P(guān)3-9的HPLC檢測圖（B）

圖3 碳源對PCN合成的影響

2.2.2 氮源對PCN合成的影響 分別以有機氮源蛋白胨、牛肉膏、玉米漿和無機氮源硫酸銨、硝酸鉀為對象，考察不同氮源對PCN產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，以蛋白胨為氮源進行發(fā)酵PCN產(chǎn)量最高，達2 031 mg/L，而添加工業(yè)常用的玉米漿和無機氮源硫酸銨、硝酸鉀幾乎無PCN產(chǎn)生。以牛肉膏為氮源PCN的產(chǎn)率與蛋白胨相比相對較低，僅為231 mg/L。

圖4 不同氮源對PCN合成的影響

2.2.3 微量元素對產(chǎn)PCN的影響 本實驗以Cu2+、Fe3+、Mn2+和Zn2+四種陽離子為考察對象，添加各種陽離子（濃度為1 mmol/L）到King’s B培養(yǎng)基中，陰離子均為Cl-，發(fā)酵24 h后檢測PCN產(chǎn)量，結(jié)果（圖5）表明，與空白對照組相比，加入Cu2+的實驗組中PCN產(chǎn)量反而降低，加入Mn2+和Zn2+對于PCN產(chǎn)量無明顯影響；而加入Fe3+對于PCN的積累有明顯促進作用，比空白對照組高出約760 mg/L，高達2 810 mg/L。

圖5 不同微量元素對PCN產(chǎn)量的影響

為了進一步驗證鐵離子對PCN產(chǎn)量的促進作用，并探究不同價態(tài)鐵離子和不同陰離子對PCN合成的影響，本實驗分別考察了2 mmol/L濃度的氯化亞鐵、氯化鐵、硫酸亞鐵和硫酸鐵對PCN合成的影響。結(jié)果（圖6）顯示，空白對照組中PCN產(chǎn)量為2 073 mg/L，而添加了Fe2+和Fe3+的實驗組的PCN產(chǎn)量普遍保持在2 800 mg/L左右，產(chǎn)量提高了35%，說明Fe2+和Fe3+對于促進PCN積累均有顯著效果。在同種陽離子條件下，陰離子種類對于PCN產(chǎn)量的影響不明顯，進一步驗證了鐵離子對于PCN產(chǎn)量的影響。此外，與添加Fe3+相比，添加Fe2+的PCN產(chǎn)量略低20-30 mg/L，且Fe2+不穩(wěn)定，高溫下易被氧化，故可考慮在培養(yǎng)基中添加適量FeCl3溶液，提高PCN產(chǎn)量。

圖6 添加Fe2+和Fe3+對PCN產(chǎn)量的影響

2.2.4 氨基酸對PCN合成的影響 外源添加濃度為1 mmol/L和5 mmol/L氨基酸，研究苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸對PCN合成的影響。由結(jié)果（圖7）可知，與空白對照組相比，添加色氨酸后 PCN產(chǎn)量略微降低，由此推測可能高濃度的色氨酸對合成途徑存在一定的反饋抑制作用。添加1 mmol/L的苯丙氨酸和酪氨酸對于PCN產(chǎn)量無明顯影響，而當添加濃度為5 mmol/L時，苯丙氨酸和酪氨酸對于PCN的積累有輕微的促進作用。

圖7 不同氨基酸對PCN產(chǎn)量的影響

3 討論

假單胞菌產(chǎn)生吩嗪類抗生素吩嗪-1-甲酰胺具有廣譜的抑菌性，具有良好的應(yīng)用前景［1-3］，但大部分研究仍處于實驗室階段，與工業(yè)化生產(chǎn)仍有較大差距［8-11］。本研究利用ARTP誘變育種方法對P3株進行處理，并篩選到一株產(chǎn)量為P3株125%的高產(chǎn)突變株P(guān)3-9，并對菌株P(guān)3-9的發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化。單因素實驗結(jié)果顯示，生物柴油合成工業(yè)的副產(chǎn)物甘油及常作為發(fā)酵氮源的蛋白胨均有利于P3-9株在發(fā)酵過程中PCN的的積累。微量元素作為生物活性物質(zhì)的組成成分或新陳代謝過程中生理活性作用的調(diào)節(jié)因子，對綠針假單胞菌PCL1391中PCN的合成［19］和銅綠假單胞菌M18中吩嗪-1-羧酸（PCA）的合成［20］有著重要的影響。本研究中，外源添加Fe3+可有效促進菌株P(guān)CN的合成，與Tjeerd van Rij等［19］的結(jié)果一致，推測Fe3+可能是特定酶的輔助因子或者參與了吩嗪化合物的氧化還原反應(yīng)，從而明顯地促進了次級代謝產(chǎn)物的合成，具體的作用機理有待進一步研究［21］。在假單胞菌的代謝網(wǎng)絡(luò)中，吩嗪化合物與芳香族氨基酸共用部分合成途徑［19］。但本研究中外源添加低濃度的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸對于PCN產(chǎn)量效果并未像PCL1391中所報道的PCN產(chǎn)量提高數(shù)倍的情況［19］，分析可能由于培養(yǎng)基中的復雜氮源已經(jīng)包含少量氨基酸類物質(zhì)所造成。后續(xù)可通過響應(yīng)面［22］等方法研究不同營養(yǎng)因素對綠針假單胞菌中的PCN合成的影響，并確定最優(yōu)培養(yǎng)基組分。另外，發(fā)酵條件如溫度、溶氧量及pH值也是影響次級代謝產(chǎn)物積累的重要因素，通過對發(fā)酵條件進行優(yōu)化可進一步為實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供可能。

4 結(jié)論

（1）通過ARTP誘變實驗，制定致死率曲線并確定了最佳誘變時間20 s，并通過初篩獲得了20株誘變突變株，其中突變株P(guān)3-9的PCN產(chǎn)量最高，為出發(fā)菌株P(guān)3株的125%左右。由此可知，ARTP誘變育種是一種提高綠針假單胞菌PCN產(chǎn)量的有效手段。

（2）初步探索了培養(yǎng)基中各營養(yǎng)因子對誘變高產(chǎn)株合成PCN的影響，確定了用于發(fā)酵積累PCN的最佳碳源和氮源分別為甘油和蛋白胨，外源添加Fe3+和Fe2+對于積累PCN有顯著的促進作用。外源添加少量苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸對于PCN產(chǎn)量無顯著影響。

（3）由于工業(yè)育種技術(shù)的不斷發(fā)展和假單胞菌自身對環(huán)境的敏感性，誘變育種及發(fā)酵優(yōu)化可以作為有效的手段來提高吩嗪類抗生素的產(chǎn)量。

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（責任編輯李楠）

Breeding of a Phenazine-1-carboxamid-producing Strain by ARTP Mutation and Its Optimization of Fermentation

TAN Jian XIONG Xin LIANG Wan-li PENG Hua-song ZHANG Xue-hong
（State Key Laboratory of Microbial Metabolism，School of Life Sciences and Biotechnology，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240）

Using an atmospheric and room temperature plasma（ARTP）jet to mutagenize a phenazine-1-carboxamide-producting strain Pseudomonas Chlororaphis P3， the mutant strain P3-9 with the highest phenazine-1-carboxamide（PCN）yield of more than 2 093 mg/L was obtained from the primary-screened 20 mutant ones， and it was 125% that by the original strain. Furthermore， single factor experiment was used to investigate the effects of varied nutrient factors on the PCN synthesis of P3-9. The results showed that the best carbon source and nitrogen source were glycerol and tryptone respectively. Adding Fe3+or Fe2+had a significant effect on PCN production， and no measurable effect while adding aromatic amino acids of phenylalanine， tryptophan and tyrosine. After the optimization， the PCN yield of strain P3-9 reached 2 810 mg/L，which was the highest yield of PCN by mutation breeding in the world so far.

phenazine-1-carboxamide；atmospheric and room temperature plasma；medium optimization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.029

2015-05-08

國家自然科學基金項目（31270084），國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（“863”計劃）（2012AA022107），國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 （“973”計劃） （2012CB721005）

譚劍，男，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物的生物合成與調(diào)控；E-mail：kevintan_2014@163.com

彭華松，男，博士，副教授，研究方向：微生物代謝調(diào)控；E-mail：hspeng@sjtu.edu.cn