楊 濱，馬攀勤，孫 進(jìn)*，夏 欣，仵明瑞

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HPLC法測(cè)定鹽酸普拉克索平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)

楊 濱1，馬攀勤2，孫 進(jìn)1*，夏 欣1，仵明瑞1

(1. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110016; 2. 寧夏康亞藥業(yè)有限公司，寧夏銀川 750000)

目的測(cè)定鹽酸普拉克索在不同介質(zhì)中的平衡溶解度及其在正辛醇-水/緩沖溶液體系中的表觀油水分配系數(shù)，為設(shè)計(jì)鹽酸普拉克索新劑型提供依據(jù)。方法采用搖瓶-高效液相色譜法測(cè)定鹽酸普拉克索在水中和不同pH值緩沖液中的平衡溶解度及表觀油水分配系數(shù)。結(jié)果37 ℃時(shí)鹽酸普拉克索在水中的平衡溶解度為570 g·LPPP-1PPP，平衡溶解度隨pH值的增大而變小，表觀油水分配系數(shù)隨pH值的增大而增大。結(jié)論 37 ℃時(shí)鹽酸普拉克索易溶于水，pH值影響平衡溶解度和油水分配系數(shù)，但變化趨勢(shì)都較小。

藥劑學(xué)；平衡溶解度；表觀油水分配系數(shù)；高效液相色譜法；鹽酸普拉克索

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是中老年人常見的一種慢性進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，常見的臨床癥狀為靜止性震顫、進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)遲緩，嚴(yán)重者伴有記憶障礙等癡呆癥狀PPP[1]PPP。PD的主要病理學(xué)特征是多巴胺能神經(jīng)元缺失及殘存神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)路易小體（Lewy 小體）的出現(xiàn)PPP[2]PPP。鹽酸普拉克索的化學(xué)名為（-）-2-氨基-6-丙基胺-4,5,6,7-四氫苯并噻唑二鹽酸鹽，分子式為CBBB10BBBHBBB19BBBCBBBl2BBBNBBB3BBBS，相對(duì)分子質(zhì)量為284.25，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

Fig. 1 Chemical structure of pramipexole dihydrochloride

鹽酸普拉克索片（pramipexole dihydrochloride immediate release tablets，Mirapex IR）首先由德國(guó)勃林格殷格翰(Boehringer-Ingehelm)公司開發(fā)，1997年5月在美國(guó)上市，大量的臨床試驗(yàn)證明，鹽酸普拉克索對(duì)于PD的治療具有安全、有效、毒性低并且不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)PPP[3-5]PPP。藥物的平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)與其在生物體內(nèi)的膜滲透性具有很大相關(guān)性，有助于預(yù)測(cè)藥物在體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。目前，在國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)中，均未見對(duì)鹽酸普拉克索平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)的報(bào)道。本文作者參考相關(guān)文獻(xiàn)，采用搖瓶-HPLC法測(cè)定鹽酸普拉克索在水和不同介質(zhì)中的平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)，為預(yù)測(cè)鹽酸普拉克索的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)及設(shè)計(jì)鹽酸普拉克索新劑型提供依據(jù)。

1 儀器與材料

HITACH高效液相色譜儀包括四元泵和DAD檢測(cè)器（日本日立公司），HZQ-C水浴振蕩機(jī)(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)，EU-pH700 pH 計(jì)(美國(guó) Eutech 公司)，KQ-100超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)，TGL-16臺(tái)式冷凍離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，LDZ5-2低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)，AR1140電子分析天平(美國(guó)Ohaus公司)，BT25十萬(wàn)分之一電子分析天平(德國(guó)Sartorius公司)。

鹽酸普拉克索對(duì)照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.8%，US，批號(hào)1553859)，鹽酸普拉克索原料藥（純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99.8%，實(shí)驗(yàn)室自制），氨水、磷酸、碳酸（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），乙腈(色譜純，天津康科德科技有限公司)，其余試劑（分析純，市售），水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 0.1 mol·LPPP-1PPP的鹽酸溶液的配制

按《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版附錄的方法配制，用pH計(jì)測(cè)定其pH值為1.2。

2.1.2 磷酸鹽緩沖液的配制

按《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版附錄的方法配制不同pH值的系列磷酸鹽緩沖液，測(cè)定pH值分別為3.0、5.0、6.50、7.01和7.45。

2.1.3 鹽酸普拉克索儲(chǔ)備液的配制

稱取鹽酸普拉克索對(duì)照品5 mg，置于100 mL量瓶中，用pH值為3.0的磷酸緩沖液定容，得質(zhì)量濃度為50 mg·LPPP-1PPP鹽酸普拉克索溶液作為儲(chǔ)備液。

2.2 測(cè)定方法學(xué)研究

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ODS柱( 150 mm × 4. 6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：碳酸銨緩沖液（用氨水調(diào)pH值為9.5）-乙腈（體積比為80∶20）；流速：1.0 mL·minPPP-1PPP；檢測(cè)波長(zhǎng)：262 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.2 專屬性實(shí)驗(yàn)

按“2.1.3”條方法制備鹽酸普拉克索對(duì)照溶液，將流動(dòng)相和鹽酸普拉克索對(duì)照溶液分別注入高效液相色譜儀，按“2.2.1”條色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，主藥峰和溶劑峰可以完全分開，在上述的色譜條件下溶劑不影響主藥的測(cè)定，說(shuō)明測(cè)試方法的專屬性較強(qiáng)。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取鹽酸普拉克索儲(chǔ)備液適量，用pH值為3.0的磷酸緩沖液稀釋，分別配制成質(zhì)量濃度為1、2.5、4、5、6、7.5和10 mg·LPPP-1PPP的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL進(jìn)樣，并記錄色譜圖。以鹽酸普拉克索質(zhì)量濃度(，mg·LPPP-1PPP) 為橫坐標(biāo)，峰面積（）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為=1.251 5×10PPP4PPP-1.630 4×10PPP3PPP，=0.999 9。結(jié)果表明，鹽酸普拉克索質(zhì)量濃度在1~10 mg·LPPP-1PPP內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

量取鹽酸普拉克索儲(chǔ)備液適量，按“2.2.2”條方法配制高（6 mg·LPPP-1PPP）、中（5 mg·LPPP-1PPP）和低（4 mg·LPPP-1PPP）3種質(zhì)量濃度的對(duì)照溶液，按“2.2.1”條色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)質(zhì)量濃度測(cè)定6次，記錄峰面積。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度，按公式：準(zhǔn)確度=測(cè)定質(zhì)量濃度值/真實(shí)質(zhì)量濃度值× 100%，求出高、中、低質(zhì)量濃度的準(zhǔn)確度。結(jié)果高、中、低3種質(zhì)量濃度的回收率分別為98.44%、99.13%和99.57%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn)

量取鹽酸普拉克索儲(chǔ)備液適量，按“2.2.2”條方法配制高（6 mg·LPPP-1PPP）、中（5 mg·LPPP-1PPP）和低（4 mg·LPPP-1PPP）3種質(zhì)量濃度的對(duì)照溶液，按“2.2.1”條色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)質(zhì)量濃度測(cè)定6次，記錄峰面積，計(jì)算日內(nèi) RSD，連續(xù)測(cè)定 3 d，計(jì)算日間 RSD。結(jié)果高、中和低3種質(zhì)量濃度對(duì)照溶液的日內(nèi) RSD 分別為0. 68%、0. 72%和0. 65%，日間 RSD 分別為1.72%、1.83%和1.12%，表明方法的精密度良好。

2.3 平衡溶解度的測(cè)定

將過(guò)量的鹽酸普拉克索置于5 mL Ep管中，分別加入pH值為5.74的水、pH值為1.2的鹽酸水溶液以及pH值分別為3.0、5.0、6.50、7.01、7.45的磷酸鹽緩沖液，超聲溶解直至溶液過(guò)飽和，放入37 ℃水浴恒溫?fù)u床振搖72 h，1.2×10PPP4PPPr·minPPP-1PPP離心10 min。取上清液用pH值為3.0的磷酸緩沖液適當(dāng)稀釋后，取20 μL注入高效液相色譜儀，按“2.2.1”條色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。按外標(biāo)法計(jì)算鹽酸普拉克索在各種溶液中的平衡溶解度。結(jié)果表明，37 ℃時(shí)鹽酸普拉克索在水中的平衡溶解度為570 mg·LPPP-1PPP，在各種溶液中的平衡溶解度隨溶液pH值的變化不大，結(jié)果見表1。

Table 1 Equilibrium solubility of pramipexole dihydrochloride in buffer solutions with various pH at 37 ℃ (± s, n=3)

表1 37 ℃時(shí)鹽酸普拉克索在不同pH值緩沖溶液中平衡溶解度(± s, n=3)

Table 1 Equilibrium solubility of pramipexole dihydrochloride in buffer solutions with various pH at 37 ℃ (± s, n=3)

Buffer solutionpHρBBBequilibrium solubilityBBB/( g·LPPP-1PPP)Buffer solutionpHρBBBequilibrium solubilityBBB/( g·LPPP-1PPP) 0.1 mol·LPPP-1PPP Hydrochloric acid1.2579.4 ± 4.0Phosphate buffer6.5562.4 ± 3.9 Phosphate buffer3.0576.0 ± 4.3Phosphate buffer 7.01553.5 ± 3.3 Phosphate buffer5.0577.0 ± 4.3Phosphate buffer 7.45550.8 ± 3.7 Water 5.74569.6 ±5.0

2.4 表觀油水分配系數(shù)的測(cè)定

2.4.1 渦旋時(shí)間考察

取質(zhì)量濃度為500 mg·LPPP-1PPP的鹽酸普拉克索溶液（被正辛醇飽和的pH值為7.01的磷酸鹽緩沖液溶解）1 mL，加入正辛醇溶液（被pH值7.0的磷酸鹽緩沖液飽和）7 mL，分別渦旋5、20、45和60 min，3 000 r·minPPP-1PPP離心10 min。棄去正辛醇層，取下層水相，用pH值3.0的磷酸鹽緩沖液稀釋至線性范圍內(nèi)，取20 μL注入高效液相色譜儀，按“2.2.1”條色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。按外標(biāo)法計(jì)算鹽酸普拉克索的質(zhì)量濃度，乘以稀釋倍數(shù)，計(jì)算正辛醇層中水相質(zhì)量濃度(BBBwBBB)，即BBBoBBB=(-BBBwBBB)×1/7。式中：為初始加入的鹽酸普拉克索溶液質(zhì)量濃度，BBBoBBB為油相中藥物的質(zhì)量濃度。結(jié)果見表2。

Table 2 Effect of vortex time on the balanced distribution

由表2可以看出，渦旋20 min以上，水相質(zhì)量濃度幾乎不再減少，即認(rèn)為已達(dá)到分配平衡，因此，選擇渦旋時(shí)間為20 min。

2.4.2 不同 pH值下鹽酸普拉克索lg的測(cè)定

稱取一定量鹽酸普拉克索原料藥，置于10 mL量瓶中，分別用水（pH值為5.74）、pH值為1.2 的鹽酸水溶液以及pH值分別為3.0、5.0、6.50、7.01和7.45的磷酸鹽緩沖液（均已被正辛醇飽和）定容，配制不同pH值下的供試溶液。帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出各供試溶液的質(zhì)量濃度（）。

分別取上述供試溶液各1 mL作為水相，分別加入已被對(duì)應(yīng)溶液飽和的正辛醇溶液7 mL作為油相，渦旋20 min，3 000 r·minPPP-1PPP離心10 min，棄去上層油相，取一定量水相，用pH值為3.0的磷酸鹽緩沖液定容。取20 μL注入高效液相色譜儀，按“2.2.1”條色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算鹽酸普拉克索的質(zhì)量濃度，乘以稀釋倍數(shù)，計(jì)算水相質(zhì)量濃度(BBBwBBB)。

藥物表觀油水分配系數(shù)(BBBappBBB)的數(shù)學(xué)表達(dá)式PPP[6-7]PPP為BBBappBBB=BBBoBBB/BBBwBBB。其中，BBBoBBB為平衡后油相中藥物的質(zhì)量濃度，BBBwBBB為平衡后水相中藥物的質(zhì)量濃度。本實(shí)驗(yàn)中，水相與油相的體積比為1∶7，故在藥物分配達(dá)到平衡時(shí)BBBoBBB=（–BBBwBBB）×1/7。37 ℃時(shí)鹽酸普拉克索在不同pH值的緩沖液中的表觀油水分配系數(shù)見表3和圖3。

Table 3 Apparent oil/water partition coefficient of pramipexole dihydrochloride in n-octanol/buffer solution with various pH at 37 ℃(n=3)

Fig. 3 Apparent Oil/Water partition coefficient of pramipexole dihydrochloride in n-octanol-buffer with various pH

結(jié)果表明，鹽酸普拉克索的表觀油水分配系數(shù)隨著pH值的升高而增大。

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)方法的選擇

常用的測(cè)定表觀油水分配系數(shù)的方法有搖瓶法、液相色譜法、薄層色譜法和產(chǎn)生柱法等PPP[8]PPP。產(chǎn)生柱法過(guò)程復(fù)雜，所需時(shí)間長(zhǎng)，色譜法需要用一系列已知lg的同系物來(lái)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，價(jià)格昂貴，故作者采用簡(jiǎn)單經(jīng)典的搖瓶法來(lái)測(cè)定鹽酸普拉克素的表觀油水分配系數(shù)，同時(shí)借助HPLC法對(duì)鹽酸普拉克索的含量進(jìn)行測(cè)定。該方法在準(zhǔn)確度、精密度方面均符合方法學(xué)驗(yàn)證的要求，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確、可行。

3.2 鹽酸普拉克索的腸吸收預(yù)測(cè)

油水分配系數(shù)是指當(dāng)藥物在水相和油相達(dá)平衡時(shí)，藥物在油相中的量與在水相中的量之比。油水分配系數(shù)會(huì)影響藥物在體內(nèi)的溶解、吸收、分布和轉(zhuǎn)運(yùn)。由于正辛醇理化性質(zhì)接近于生物膜, 目前文獻(xiàn)也多以正辛醇PPP[9-10]PPP作為有機(jī)相，因此作者采用正辛醇-水作為模擬系統(tǒng)。由于體內(nèi)胃腸道pH值在1.0 ~ 8.0內(nèi)，因此作者設(shè)計(jì)了pH值為1.2、3.0、5.0、5.74、6.50、7.01和7.45的介質(zhì)來(lái)模擬體內(nèi)環(huán)境。由于鹽酸普拉克索在水相中的溶解度較大，用搖瓶法測(cè)定時(shí)，大部分的藥物都溶解在水相中，因此將水相和油相的體積比增大到1∶7，以利于水相中的藥物能夠更多的分配到油相中。

4 結(jié)論

作者成功的建立了搖瓶-HPLC法測(cè)定鹽酸普拉克索在不同介質(zhì)中的平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)。37 ℃時(shí)鹽酸普拉克索易溶于水，且溶解度隨pH值的增大有變小趨勢(shì)，但變化不大，表觀油水分配系數(shù)隨pH值增大而增大。本實(shí)驗(yàn)為鹽酸普拉克索的處方前研究提供了必要的基礎(chǔ)，為設(shè)計(jì)鹽酸普拉克索新劑型提供了必要的依據(jù)。

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(本篇責(zé)任編輯：趙桂芝)

Determination of equilibrium solubility and apparent oil/water partition coefficient of pramipexole dihydrochloride by HPLC

YANG Bin1, MA Panqin2, SUN Jin1*, XIA Xin1, WU Mingrui1

(1,,110016,; 2.,,750000,)

Objective To determine the equilibrium solubility of pramipexole dihydrochloride in various medium and its apparent oil/water partition coefficient partition coefficient in the-octanol-water/buffer solution systems, which will provid a basis for design new formulations. MethodA shake flask- high performance liquid chromatography (HPLC) method was established to determine the equilibrium solubility and apparent oil/water partition coefficientof pramipexole dihydrochloride in water and different pH buffer solutions. Result The equilibrium solubility of pramipexole dihydrochloride was 570 mg·LPPP-1PPPin water at 37 ℃ and the pH of the buffer solution had no influence on its equilibrium solubility. With the increase of solution pH, apparent oil/water partition coefficient of pramipexole dihydrochloride was also rising. ConclusionThe method established in this paper can successfully used todetermine the equilibrium solubility and the apparent oil/water partition coefficient of pramipexole dihydrochloride.

pharmaceutics；equilibrium solubility；apparent oil/water partition coefficient；HPLC； pramipexole dihydrochloride

（2016）01–0026–07

10.14146/j.cnki.cjp.2016.01.004

R94

A

2015-04-13

楊濱 (1988-), 男(漢族), 山東濱州人, 碩士研究生, E-mail yangbin119@126.com;

孫進(jìn) (1975-), 男(漢族), 安徽金寨人, 教授, 博士, 博士生導(dǎo)師, 主要從事藥物新劑型與新技術(shù)研究, Tel. 024-23986325, E-mail sunjin0529@aliyun.com。