耿思聰，龔昊宇，許 航，劉小林，程志博，袁 悅

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微柱離心法測(cè)定克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體注射液的包封率

耿思聰1,2，龔昊宇1，許 航1，劉小林1，程志博1，袁 悅1*

（1. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110016 2. 上海恒瑞醫(yī)藥有限公司制劑研究所，上海 200245）

目的 考察微柱離心法測(cè)定克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體包封率的可行性。方法選用葡聚糖凝膠G-50 （Sephadex G-50）微柱離心法將克拉霉素脂質(zhì)體和外水相中游離克拉霉素分離，測(cè)定脂質(zhì)體中克拉霉素的含量，計(jì)算克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體的包封率。結(jié)果克拉霉素含量測(cè)定的線(xiàn)性范圍為50~600 mg?LP-1P，空白脂質(zhì)體在葡聚糖凝膠G-50中無(wú)吸附作用，游離克拉霉素能夠?qū)崿F(xiàn)與克拉霉素脂質(zhì)體的分離， 3批樣品的平均包封率為94.2%。結(jié)論微柱離心法可作為克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體注射液包封率測(cè)定的有效測(cè)定方法。

藥劑學(xué)；脂質(zhì)體；微柱離心法；克拉霉素；包封率

克拉霉素（clarithromycin，CLA, 化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1）為大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素。CLA屬于廣譜抗生素，臨床可用于敏感菌引起的扁桃體炎、急性咽炎、社區(qū)獲得性肺炎、中耳炎、口腔感染、鼻竇炎、百日咳、白喉、軍團(tuán)菌肺炎和非典型病原體肺炎等P[1]P。為提高克拉霉素的溶解度，降低它的靜脈刺激性及相關(guān)不良反應(yīng)，通常將克拉霉素制備成脂質(zhì)體或脂肪乳劑P[2-4]P。包封率是衡量克拉霉素脂質(zhì)體質(zhì)量和制備工藝的重要指標(biāo)之一，由于克拉霉素屬于油水均難溶性藥物P[5]P，故采用超濾離心法無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定克拉霉素脂質(zhì)體的包封率。同時(shí)，超高速離心法具有設(shè)備上的限制，不能廣泛使用。因此，作者首先制備了克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體，并利用微柱離心法測(cè)定了克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體的包封率。

Fig. 1 The chemical structure of clarithromycin

圖1克拉霉素化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 儀器與材料

HITACHI紫外分光光度計(jì)、HITACHI 高效液相色譜儀(包括chromaster-5110泵、chromaster-5210自動(dòng)進(jìn)樣器、chromaster-5310柱溫箱和chromaster-5410紫外檢測(cè)器)（日本日立公司)，PF-101T 集熱式恒溫磁力攪拌器、SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵（河南鞏義予華儀器有限公司），電熱恒溫水浴鍋(北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司)，F(xiàn)A1104N電子分析天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司），80-2 離心機(jī)（上海手術(shù)器械廠(chǎng)），N-1001EYELAP?P旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)郎儀器有限公司），ATS高壓均質(zhì)機(jī)、ATS脂質(zhì)體膜擠出器（上海ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司），NicompTM 380 動(dòng)態(tài)光散射粒度測(cè)定儀（Santa Barbara，USA PSS），Diamond CB18B色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)（迪馬公司），JEM-2100透射電子顯微鏡（日本電子，JEOL）。

克拉霉素（浙江華宜制藥廠(chǎng)），注射用蛋黃卵磷脂PC-98T(上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司)，膽固醇琥珀酸單酯（北京百靈威科技有限公司），葡聚糖凝膠 G-50（Sigma-Aldrich中國(guó)公司），磷酸二氫鉀、三乙胺、乙腈（康科德試劑公司），其余試劑（分析純，市售）。

2 方法與結(jié)果

2.1 克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體的制備

采用薄膜分散-高壓均質(zhì)法制備克拉霉素脂質(zhì)體。稱(chēng)取處方量的卵磷脂PC-98T、克拉霉素和膽固醇琥珀酸單酯，用適量無(wú)水乙醇充分溶解，轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去無(wú)水乙醇后，可見(jiàn)脂質(zhì)薄膜均勻分布于圓底燒瓶底部。用事先預(yù)熱好的pH值7.4 的磷酸鹽緩沖液為水化介質(zhì)。在60 ℃條件下水化30 min，得脂質(zhì)體粗分散體系。將脂質(zhì)體粗分散體系轉(zhuǎn)移至高壓均質(zhì)機(jī)中進(jìn)行均質(zhì)，以冰水浴控制均質(zhì)溫度在40 ℃以下，5 800 psi均質(zhì)8次。將所得脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移至脂質(zhì)體膜擠出器進(jìn)行過(guò)膜除菌，裝瓶，氮?dú)夤喾?，即得克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體注射液，規(guī)格為1 mL，其中含藥5 mg。

2.2 克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體的初步表征

取克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體樣品適量，用重蒸餾水稀釋5 000倍后，用NICOMP 380 粒度測(cè)定儀對(duì)其進(jìn)行粒度和電位的測(cè)定。結(jié)果平均粒徑為（70.1 ± 2.3） nm (=3)，電位為-42.05 mV。

用pH計(jì)對(duì)所得制劑進(jìn)行測(cè)量，得pH值為7.95 ± 0.02 (=3)。

取克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體樣品適量置于銅網(wǎng)中，利用磷鎢酸對(duì)樣品進(jìn)行負(fù)染色，將干燥后的銅網(wǎng)置于透射電鏡觀(guān)察?？死顾仉x子對(duì)脂質(zhì)體的透射電鏡圖見(jiàn)圖2。

Fig. 2 TEM photograph of CIP-Lip（accelerating voltage 200 kV，×80 000）

圖2克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體透射電鏡圖（加速電壓200 kV，×80 000）

2.3 分析方法的建立

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Diamond CB18B柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鉀4.55 g，加水溶解并稀釋至500 mL，加三乙胺1 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至5.5）-乙睛（體積比3∶2），0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾；流速：1.0 mL·minP-1P；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：45 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。理論塔板數(shù)以克拉霉素計(jì)不低于3 000P[6]P。

2.3.2 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取空白脂質(zhì)體（blank liposome，BL）溶液、克拉霉素溶液。用乙醇破壞脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，適當(dāng)稀釋后進(jìn)樣分析。圖3表明，在“2.3.1”條色譜條件下，克拉霉素與脂質(zhì)體輔料能達(dá)到基線(xiàn)分離，保留時(shí)間為11.2 min。

1—Clarithromycin

2.3.3 線(xiàn)性關(guān)系考察

精密稱(chēng)取克拉霉素對(duì)照品100 mg，置于50 mL量瓶中，加無(wú)水甲醇溶解，并稀釋至刻度，分別移取0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mL置于10 mL量瓶中，加無(wú)水甲醇稀釋至刻度，搖勻。取20 μL進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積（）為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度(，mg?LP-1P)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，通過(guò)計(jì)算得回歸方程= 1. 202 9×10P3P－7×10P-10P，= 0.995 5。

結(jié)果表明，在本色譜條件下，克拉霉素質(zhì)量濃度在50～600 mg?LP-1P內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好，=0.995 5。

2.3.4 精密度試驗(yàn)

分別配制質(zhì)量濃度為100、300和500 mg?LP-1P的高中低3種質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液各6份，按“2.3.1”條色譜條件連續(xù)進(jìn)樣分析6次，RSD分別為1.2%、0.85%和0.92%，均小于2%，表明日內(nèi)精密度良好。

2.3.5 回收率試驗(yàn)

在1 mL空白脂質(zhì)體溶液中分別加入克拉霉素對(duì)照儲(chǔ)備液適量，配制成相當(dāng)于克拉霉素脂質(zhì)體質(zhì)量濃度5 g?LP-1P的80%、100%和120%的低中高3種質(zhì)量濃度的物理混合制劑。用無(wú)水甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為160、200和240 mg?LP-1P的溶液各3份，取20 μL進(jìn)樣分析。結(jié)果回收率分別為100.19%、100.05%和100.54%，RSD分別為0.53%、0.46%和0.65%。

2.4 微柱離心法方法學(xué)研究

2.4.1 葡聚糖凝膠柱的制備

微柱離心組件（mini-column centrifugation system，MCCS），包括：1 mL注射器、脫脂棉、葡聚糖凝膠和塑料試管。

Sephadex G-50在蒸餾水中浸泡過(guò)夜，充分溶脹，載入1.0 mL注射器中（注射器底部填充脫脂棉以防葡聚糖凝膠泄漏）。將裝有Sephadex G-50的注射器裝入塑料試管中，組成微柱離心組件。將MCCS轉(zhuǎn)移至離心機(jī)中，于2 000 r?minP-1P離心4 min，使凝膠柱失水緊縮，備用。

2.4.2 微型離心柱對(duì)空白脂質(zhì)體的吸附作用

取空白脂質(zhì)體溶液100 μL置于10 mL量瓶中，用重蒸水稀釋并定容至刻度。將略帶乳光的樣品置于分光光度計(jì)中，于波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定吸光度（B前B）；另取空白脂質(zhì)體溶液100 μL，加至微型凝膠柱的頂端，于2 000 r?minP-1P離心4 min，并繼續(xù)在凝膠柱頂端加入重蒸水200 μL，于2 000 r?minP-1P離心4 min，連續(xù)操作3次。將塑料試管中的洗脫液轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，用重蒸水稀釋并定容至刻度。將略帶乳光的樣品置于分光光度計(jì)中，于波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定吸光度（B后B）。重復(fù)操作3次，結(jié)果見(jiàn)表1。

Table 1 The absorption of blank liposome on Sephadex G-50 column

Sephadex G-50對(duì)空白脂質(zhì)體的回收率經(jīng)3次離心洗脫后可達(dá)到98%以上，且RSD小于2%，重現(xiàn)性良好。因此將包封率測(cè)定方法中的洗脫次數(shù)定為3次。

2.4.3 微型離心柱對(duì)水溶液中克拉霉素的吸附作用

克拉霉素溶液的配制：將克拉霉素溶解在磷酸溶液中，然后用1 mol·LP-1P氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值到6.5、質(zhì)量濃度約5 g?LP-1P，得克拉霉素水溶液。取上述溶液100 μL置于凝膠柱頂端，按“2.4.2”條離心處理，洗脫。所得洗脫液按“2.3.1”條色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算洗脫液中藥物濃度。重復(fù)操作6次。結(jié)果顯示，只有質(zhì)量分?jǐn)?shù)不足1%的克拉霉素被洗脫下來(lái)，RSD小于2%。因此可以利用Sephadex G-50微型柱完成脂質(zhì)體與游離克拉霉素的分離。

2.4.4 微型離心柱對(duì)空白脂質(zhì)體和克拉霉素水溶液的分離

考慮到空白脂質(zhì)體對(duì)游離藥物可能會(huì)有物理吸附，進(jìn)而影響包封率的測(cè)定。故作者考察了微型離心柱對(duì)空白脂質(zhì)體與克拉霉素溶液的物理混合物的吸附情況。

物理混合物的制備：將空白脂質(zhì)體用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.0，將克拉霉素溶解于其中，然后用1 mol·LP-1P氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值到6.5、質(zhì)量濃度約5 g?LP-1P，得物理混合物。取物理混合物100 μL置于凝膠柱頂端，按“2.4.2”條離心處理，洗脫。將過(guò)柱前后的物理混合物分別用無(wú)水乙醇適當(dāng)稀釋?zhuān)茐闹|(zhì)體的結(jié)構(gòu)，得到均一的溶液。將此溶液按“2.3.1”條色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算洗脫液中藥物質(zhì)量濃度。重復(fù)操作6次，結(jié)果見(jiàn)表2P[7]P。

Table 2 Separation of the mixture of blank liposome and clarithromycin using minicolumn of Sephadex G-50

Notes:BbeforeB—The concentration of clarithromycin before the column elution;BafterB—The concentration of clarithromycin after the column elution

2.5 包封率的測(cè)定

2.5.1 微柱離心法

取克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體注射液100 μL，用乙醇破壞脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，定容于10 mL量瓶中，進(jìn)樣分析，計(jì)算過(guò)柱前的藥物質(zhì)量濃度（B前B）。另取克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體注射液100 μL，加至葡聚糖凝膠柱頂端，于2 000 r?minP-1P離心4 min，連續(xù)洗脫3次；將洗脫液合并至10 mL量瓶中，用乙醇破壞脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)并定容，進(jìn)樣分析，計(jì)算過(guò)柱后的藥物質(zhì)量濃度（B后B）。包封率（EE）=B后B/B前B×100%。3批樣品中克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體的平均包封率為94.2%，RSD為1.64%（=3）P[8]P。

2.5.2 超濾法

取克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體注射液1 mL，用乙醇破壞脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，定容于10 mL量瓶中，進(jìn)樣分析，計(jì)算超濾前的藥物質(zhì)量濃度（B總B）。另取克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體注射液約500 μL，加至超濾管中的超濾膜上，3 000 r?minP-1P離心20 min。將離心得到的水相進(jìn)樣分析，計(jì)算得到B水B。包封率（EE）=(1-B水B/B總B)×100%。3批樣品中克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體的平均包封率為98.5%，RSD為5.15%（=3）。

2.5.3 超高速離心法

取克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體注射液1 mL，用乙醇破壞脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，定容于10 mL量瓶中，進(jìn)樣分析，計(jì)算超濾前的藥物質(zhì)量濃度（B總B）。另取一定量克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體注射液置于超速離心管中，使用天平配平。將超速離心管置于超高速離心機(jī)中，于5×10P4Pr?minP-1P離心2 h。將離心得到的水相進(jìn)樣分析，計(jì)算得到B水B。包封率（EE）=(1-B水B/B總B) ×100%。3批樣品中克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體的平均包封率為99.3%，RSD為2.3%（=3）。

3 討論

3.1 克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體的初步表征

為保證供試品的質(zhì)量，將克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行了初步的表征。通過(guò)測(cè)定粒徑、電位可知，克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體具有顯著的納米制劑特性。通過(guò)透射電鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，具有明顯的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，且粒徑分布均一。結(jié)果表明供試品的質(zhì)量沒(méi)有問(wèn)題，可以對(duì)其進(jìn)行包封率測(cè)定和方法學(xué)研究。

3.2 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

為保證克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體注射液含量測(cè)定的準(zhǔn)確性，采用無(wú)水乙醇對(duì)脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞。無(wú)水乙醇可以溶解脂質(zhì)體中的脂質(zhì)類(lèi)輔料，使溶液澄清，且不干擾克拉霉素的含量測(cè)定。因此，包封率測(cè)定方法中采用無(wú)水乙醇作為破壞脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的有機(jī)溶劑。

3.3 空白脂質(zhì)體對(duì)克拉霉素的吸附作用

將克拉霉素溶液上樣于葡聚糖凝膠柱，并按“2.4.2”條方法進(jìn)行洗脫后，克拉霉素溶液的回收率小于1%。而空白脂質(zhì)體和克拉霉素的物理混合物的回收率結(jié)果顯示，約有2.5%的克拉霉素被洗脫下來(lái)，這雖然對(duì)克拉霉素包封率的測(cè)定結(jié)果影響不大，但物理混合物與純?nèi)芤涸诨厥章噬系牟町愔档醚芯俊?/p>

克拉霉素的KBaB值為8.8P[9]P，結(jié)構(gòu)上的二甲氨基容易獲得質(zhì)子而帶正電。而空白脂質(zhì)體的電位為-42.05 mV。這樣一來(lái)，由于正負(fù)電荷之間存在庫(kù)倫引力的作用，空白脂質(zhì)體將會(huì)吸附一部分帶正電的克拉霉素，與葡聚糖凝膠微型柱之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。在空白脂質(zhì)體的洗脫過(guò)程中，會(huì)將一部分帶正電的克拉霉素帶出凝膠柱。載藥克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體的電位為-41.25 mV，同樣地，載藥脂質(zhì)體也會(huì)吸附一部分外水相中帶正電的克拉霉素，使包封率的最終結(jié)果偏大。

3.4 包封率測(cè)定方法的選擇

包封率的測(cè)定方法有很多，可以查閱到的就包括超濾法P[10]P、微滲析法P[2-3]P、超高速離心法及葡聚糖凝膠微柱離心法。在前期的試驗(yàn)中考察了超濾法、微滲析法和超高速離心法?？死顾氐乃苄圆睿谒械娜芙舛炔蛔?0 mg?LP-1P（實(shí)測(cè)值）。超濾管上的超濾膜會(huì)對(duì)難溶性藥物產(chǎn)生吸附，造成測(cè)量結(jié)果不夠準(zhǔn)確。且吸附值是一個(gè)變化值，并不穩(wěn)定地吸附一定量的難溶性藥物，這給克拉霉素脂質(zhì)體注射液的質(zhì)量控制帶來(lái)了一定的麻煩。在“2.5.2”條中，作者發(fā)現(xiàn)通過(guò)超濾法得到的脂質(zhì)體包封率要大于微柱離心法，這證明了克拉霉素會(huì)在超濾膜上產(chǎn)生吸附作用，使包封率測(cè)量結(jié)果偏大，而RSD>2%也證明了這一方法結(jié)果的不穩(wěn)定性。微滲析法的設(shè)備需要自行組裝，重現(xiàn)性極差，不能做到在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室推廣使用。而超高速離心機(jī)的設(shè)備昂貴，也不能做到推廣使用。在“2.5.3”條中，作者發(fā)現(xiàn)超高速離心法得到的包封率大于微柱離心法和超濾法，這可能是因?yàn)樵谥|(zhì)體制備之后，會(huì)有一少部分未包封的藥物在水中以微晶的形式存在，在超高速離心的過(guò)程中，這些微晶被離心到離心管的下層。而作者采用的方法是測(cè)定水相中藥物的濃度。因此，這一方法得到的包封率結(jié)果往往偏大，不夠準(zhǔn)確。

因此，作者采用葡聚糖凝膠微柱離心法，對(duì)該方法進(jìn)行方法學(xué)研究，考察方法的可行性。在誤差分析過(guò)程中，作者發(fā)現(xiàn)微柱離心法會(huì)使包封率的最終測(cè)定結(jié)果偏大，誤差在3%左右。但這一誤差值并不會(huì)顯著影響克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體注射液的質(zhì)量控制，故最終選擇了微柱離心法測(cè)定克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體的包封率。

4 結(jié)論

葡聚糖凝膠柱對(duì)空白脂質(zhì)體溶液無(wú)吸附作用，離心條件為2 000 r?minP-1P離心4 min。含量測(cè)定的線(xiàn)性范圍是50~600 mg?LP-1P，精密度和回收率均滿(mǎn)足含量測(cè)定要求。3批克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體的平均包封率為94.2%。微柱離心法的方法學(xué)科學(xué)可靠，可作為克拉霉素離子對(duì)脂質(zhì)體包封率測(cè)定的有效方法。

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(本篇責(zé)任編輯：趙桂芝)

Determination of entrapment efficiency of clarithromycin ion-pair liposome by a mini-column centrifugation method

GENG Sicong1,2, GONG Haoyu1, XU Hang1, LIU Xiaolin1, CHENG Zhibo1, YUAN Yue1*

(,,110016,; 2.,.,.,200245,)

Objective To build a mini-column centrifugation method for measuring of entrapment efficiency of clarithromycin ion-pair liposomes. Methods The entrapment efficiency of clarithromycin ion-pair liposome was measured by a mini-column centrifugation method using a Sephadex G-50 column. The content of clarithromycin ion-pair liposome was assessed by HPLC and the entrapment efficiency was determined by comparing the CLA concentration of the eluted sample with that of the sample prior to column separation. Results The blank liposomes were not absorbed by the Sephadex G-50 minicolumn. The condition of centrifugation was 2 000 r?minP-1Pfor 4 min. The calibration curve was linear in the range of 50-600 mg?LP-1Pfor clarithromycin. The average entrapment efficiencyof3 batches clarithromycin liposome was 94.2%. Conclusion The method can be used in the determination of entrapment efficiency of clarithromycin liposomal formulation.

pharmaceutics; liposome; mini-column centrifugation method; clarithromycin; entrapment efficiency

（2016）01–0018–08

10.14146/j.cnki.cjp.2016.01.003

R 94

A

2015-04-01

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81202481）

耿思聰(1989-), 男(漢族), 遼寧沈陽(yáng)人, 碩士研究生, E-mail gsc1989@163.com;

袁悅(1972-), 女(漢族), 遼寧沈陽(yáng)人, 副教授, 博士, 主要從事膠體納米給藥系統(tǒng)和功能性藥物載體等研究, Tel. 024-23986293, E-mail lnsyyy@sohu.com。