響應(yīng)面法優(yōu)化冰醋酸提取五味子果仁抗菌肽工藝研究

武威，焦陽，陳曉平*

（1.吉林省標(biāo)準(zhǔn)研究院，吉林長春130022；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130118）

響應(yīng)面法優(yōu)化冰醋酸提取五味子果仁抗菌肽工藝研究

武威1，焦陽2，陳曉平2*

（1.吉林省標(biāo)準(zhǔn)研究院，吉林長春130022；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130118）

該研究利用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法，以五味子果仁冰醋酸抗菌肽對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為響應(yīng)值，對(duì)冰醋酸提取法提取五味子果仁中抗菌肽的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，冰醋酸提取五味子果仁抗菌肽最佳工藝條件為：冰醋酸濃度10%、料液比1∶28（g∶mL）、離心速率8 200 r/min。在此工藝條件下，所提取的抗菌肽對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為2.13 cm，與理論值（2.10 cm）的相對(duì)誤差僅為1.09%，表明擬合方程與實(shí)際相符合，所得結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

響應(yīng)面法；冰醋酸提??；五味子果仁；抗菌肽

五味子（Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.）是長白山重要的具有明顯保健功能的特色植物資源之一［1-2］。木脂素類物質(zhì)、多糖類化合物和肽類是五味子主要的功效成分。五味子具有極高的藥用和食用價(jià)值，具有滋補(bǔ)、抗腫瘤、抗氧化等多種功效，因此，具有較高的研究和開發(fā)利用價(jià)值［3-5］。

抗菌肽是具有抗菌活性肽類的總稱。作為多種生物機(jī)體內(nèi)重要的防御物質(zhì)之一，抗菌肽具有廣譜性、熱穩(wěn)定性好、水溶性佳等眾多優(yōu)點(diǎn)，廣泛存在于植物、動(dòng)物等機(jī)體內(nèi)［6-8］。植物抗菌肽的作用機(jī)制相對(duì)來說比較靈活，它可以破壞有害細(xì)菌的細(xì)胞壁或者溶解其細(xì)胞膜以及使其細(xì)胞的某些細(xì)胞器失去相應(yīng)的功能來殺死有害細(xì)胞［9-11］。常用抗菌肽分離純化的方法主要有：化學(xué)萃取法、超濾法、凍融法、酶解法、沉淀法、離心法、色譜分離法、層析法、電泳法等［12］。

本研究提取抗菌肽的方法主要是依照王雅麗等［13-14］采用的冰醋酸法及乙醇法提取鰻鱺、林蛙中抗菌肽的工藝方法。近年來對(duì)五味子活性成分的研究很多，但多集中于五味子的果肉部分，而對(duì)其果仁部分的研究鮮見報(bào)道［15-16］。本研究利用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法，以五味子果仁冰醋酸提取物對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）的抑菌圈直徑為響應(yīng)值，對(duì)冰醋酸浸提法的主要工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得最佳提取工藝。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

五味子：長白山藍(lán)景坊科技股份有限公司。

大腸桿菌（Escherichia coli）：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品工程教研室保菌中心。

冰醋酸、乙醇（分析純）：北京化工廠；瓊脂粉：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨、酵母浸粉：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉（分析純）、氨芐青霉素（優(yōu)級(jí)純）：北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0g/L，酵母抽提物5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，以2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4，121℃高壓滅菌20 min。

LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂粉。121℃高壓滅菌20 min。

1.2儀器與設(shè)備

XA-10固體樣品粉碎機(jī)：金壇市科析儀器有限公司；SPA-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；HD-1360潔凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：、SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵：上海亞榮生化儀器廠；FA1004A電子天平：上海精天電子儀器有限公司；LG10-2.4A高速離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；FD-1C-50冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1材料預(yù)處理

將五味子浸泡去果肉，所得果仁用蒸餾水洗凈，放入60℃的烘箱內(nèi)烘干至恒質(zhì)量，破殼并入粉碎機(jī)內(nèi)粉碎，過60目篩，制得五味子果仁干粉，備用。

1.3.2冰醋酸法提取五味子果仁抗菌肽［13-14］

稱取5份5.000 g五味子果仁粉，按照一定的料液比分別加入100 mL一定濃度的冰醋酸，勻速攪拌20 min，于4℃條件下浸提1d后，置于4℃離心機(jī)中在一定轉(zhuǎn)速條件下離心20 min，取上清液，70℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將冰醋酸蒸干，冷凍干燥，滅菌水定容至10 mL，待進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.3.3單因素試驗(yàn)

分別考察冰醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（4%、6%、8%、10%和12%）、料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g∶mL））、離心速率（6 000 r/min、7 000 r/min、8 000 r/min、9 000 r/min和10 000 r/min）對(duì)冰醋酸法提取五味子果仁中抗菌肽對(duì)大腸桿菌抑菌效果的影響。

1.3.4響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

表1　響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以抑菌圈直徑（Y）為響應(yīng)值，利用Design-expert 8.0.6分析軟件的Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)法對(duì)冰醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、離心速率（C）進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化分析［17-19］。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

1.3.5抑菌活性測定

菌種活化：將大腸桿菌分別接種至LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)基使菌種分散均勻，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，活化2～3次。

抑菌活性測定：抑菌活性采用瓊脂孔穴擴(kuò)散法測定［20-21］。吸取濃度為120 CFU/mL活化的菌種120 μL加入LB固體培養(yǎng)基中，涂布均勻，在培養(yǎng)基上打直徑為5～6 mm的圓孔，用移液槍吸取50 μL抗菌肽粗提液加入孔洞。陰性對(duì)照組加50μL無菌蒸餾水，陽性對(duì)照組加50 μL 100 μg/mL的氨芐青霉素溶液。將培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)24 h。觀察抑菌效果，并測量抑菌圈直徑（平行測定3次，取平均值）。

1.3.6試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用軟件Design-Expert 8.0.6獲得回歸方程進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1冰醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)五味子果仁抗菌肽抑菌效果的影響

圖1　冰醋酸濃度對(duì)五味子果仁抗菌肽抑菌效果的影響Fig.1 Effect of glacial acetic acid concentration on antibacterial efficacy of antimicrobial peptide from fructus schisandrae nuts

由圖1可知，在冰醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%～10%范圍內(nèi)，隨著冰醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，抑菌圈直徑呈現(xiàn)增長的趨勢；當(dāng)冰醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大，為2.11 cm；當(dāng)冰醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞10%時(shí)，抑菌圈直徑開始降低。因此，選擇冰醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%較適宜。

2.1.2料液比對(duì)五味子果仁抗菌肽抑菌效果的影響

由圖2可知，隨著料液比的增加，抑菌圈直徑呈先增長后減小的趨勢，當(dāng)料液比為1∶30（g∶mL）時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到峰值，為2.03 cm；當(dāng)料液比＞1∶30（g∶mL），溶出的抗菌肽含量開始出現(xiàn)了降低趨勢，抑菌圈直徑隨之降低，因此，選擇料液比為1∶30（g∶mL）較適宜。

圖2　料液比對(duì)五味子果仁抗菌肽抑菌效果的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on antibacterial efficacy of antimicrobial peptide from fructus schisandrae nuts

2.1.3離心速率對(duì)五味子果仁抗菌肽抑菌效果的作用

圖3　離心速率對(duì)五味子果仁抗菌肽抑菌效果的影響Fig.3 Effect of centrifugal speed rate on antibacterial efficacy of antimicrobial peptide from fructus schisandrae nuts

由圖3可知，抑菌圈直徑隨離心速率的提高先增加后降低。當(dāng)離心速率為8 000 r/min時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到峰值，為2.06 cm；當(dāng)離心速率的持續(xù)增加（＞8 000 r/min）會(huì)使提取出的五味子果仁抗菌肽在離心過程中有所損失，最終導(dǎo)致抑菌圈直徑開始降低，因此，選擇離心速率為8 000 r/min較適宜。

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

利用Design-Expert 8.0.6分析軟件，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法，探討冰醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、離心速率（C）及其交互作用對(duì)抑菌效果的影響，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析如表2所示，響應(yīng)面數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果見表3。

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析Table3 Results and analysis of response surface experiments

續(xù)表

根據(jù)表2試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用軟件Design-expert 8.0.6對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行多元回歸擬合應(yīng)進(jìn)行方差分析，得到五味子果仁抗菌肽提取工藝參數(shù)回歸方程為：

表3　回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，該二次方程模型具有顯著差異性（P＜0.05），R2=0.968 1，說明該模型擬合情況良好、可靠性較高。失擬項(xiàng)P值為0.060 0＞0.05，不顯著，表明試驗(yàn)誤差較小，未知因素對(duì)試驗(yàn)干擾少。因素A、A2、C2對(duì)抑菌效果有極顯著的影響（P＜0.00 1）；因素B、C、B2、物料比和離心速率的交互項(xiàng)（BC）對(duì)抑菌效果有顯著性的影響（P＜0.05）；冰醋酸濃度和料液比的交互項(xiàng)（AB）、冰醋酸濃度和離心轉(zhuǎn)速的交互項(xiàng)（AC）對(duì)抑菌效果影響不顯著（P＞0.05）。模型的信噪比為13.964＞4，表明選用響應(yīng)面模型合理的。

2.2.2響應(yīng)面交互作用結(jié)果分析

采用軟件Design-expert 8.0.6做兩兩因素交互作用的響應(yīng)曲面及等高線，確定冰醋酸質(zhì)量濃度、料液比和離心轉(zhuǎn)速對(duì)五味子果仁抗菌肽抑菌圈直徑的影響，結(jié)果見圖4。

圖4　冰醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比和離心速率交互作用對(duì)五味子果仁抗菌肽抑菌圈直徑影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between glacial acetic acid concentration，solid-liquid ratio and centrifugal speed rate on inhibitory zone diameter of antimicrobial peptide from fructus schisandrae nuts

由圖4可知，當(dāng)轉(zhuǎn)速為8 000 r/min時(shí)，冰醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和料液比所形成的曲面向下傾斜的幅度較大，表明冰醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和料液比對(duì)所提取的SFA的抑菌作用影響極為顯著，當(dāng)冰醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為接近10%左右，料液比接近1∶30（g∶mL）時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大值。同時(shí)，等高線近乎于圓形時(shí)表明冰醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和離心速率的交互項(xiàng)對(duì)抑菌效果不顯著。當(dāng)料液比為1∶30（g∶mL）時(shí)，冰醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和離心速率所形成的曲面出現(xiàn)陡坡，表明冰醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和離心速率對(duì)五味子果仁抗菌肽的抑菌作用極為顯著。冰醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不斷增加，抑菌圈大小先增加后減小。離心速率也表現(xiàn)出相同的規(guī)律。同時(shí)，圖中等高線近乎于圓形，表明冰醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和離心速率的交互項(xiàng)對(duì)抑菌效果影響不顯著。當(dāng)冰醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，料液比和離心速率對(duì)SFA的抑菌效果影響顯著。不斷提升離心速率，抑菌效果先上升后下降。料液比與離心速率變化規(guī)律相似。

2.3冰醋酸法提取五味子果仁抗菌肽的最佳提取條件驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化，確定冰醋酸提取五味子果仁抗菌肽最佳工藝條件為冰醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、料液比1∶28（g∶mL）、離心速率8 200 r/min，在此條件下，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，所得五味子果仁抗菌肽對(duì)大腸桿菌抑菌圈直徑為2.13 cm，與理論值（2.10 cm）之間的相對(duì)誤差僅為1.09%，表明擬合方程符合實(shí)際，試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的最佳條件是準(zhǔn)確可靠的。

3　結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法，確定冰醋酸提取五味子果仁抗菌肽最佳工藝條件為冰醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、料液比1∶28（g∶mL）、離心速率8 200 r/min。在此最佳條件下，所得五味子果仁抗菌肽對(duì)大腸桿菌抑菌圈直徑為2.13 cm，與理論計(jì)算值（2.10 cm）之間的相對(duì)誤差僅為1.09%，表明該模型能夠很好地預(yù)測實(shí)際的提取情況。對(duì)五味子綜合利用和新型抗菌肽的研究與開發(fā)具有重要意義。

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WU Wei1，JIAO Yang2，CHEN Xiaoping2*
（1.Jilin Provincial Institute of Standards，Changchun 130022，China；2.College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

Using the antibacterial circle diameter of antimicrobial peptide onEscherichia colias response value，the glacial acetic acid extraction technology parameters of antimicrobial peptide from fructus schisandrae nuts were optimized by the Box-Behnken central combination design and response surface methodology.The results showed that the optimum extraction conditions of antimicrobial peptide were glacial acetic acid concentration 10%，solid-liquid ratio 1∶28（g∶ml）and centrifugal speed rate 8 200 r/min.Under the conditions，the antibacterial circle diameter of antimicrobial peptide extracted onEscherichia coliwas 2.13 cm，compared with the theoretical value（2.10 cm），the relative error was only 1.09%.Results indicated that fitted equation was in accord with the actual，and the results was accurate and reliable.

response surface methodology；glacial acetic acid extraction；fructus schisandrae nuts；antibacterial peptide

TS201.3

0254-5071（2016）06-0109-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.023

2016-036-21

吉林省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（20050212-6）

武威（1974-），女，高級(jí)工程師，本科，研究方向?yàn)槭称钒踩c標(biāo)準(zhǔn)。

陳曉平（1963-）男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锘瘜W(xué)與功能食品。