加壓毛細管電色譜法同時測定飲料中檸檬黃和苯甲酸鈉

趙彥勇，李利軍，程 昊，黃文藝， 尤 磊，肖曉茹，劉伯洋

(1.廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西柳州 545006；2.廣西糖資源綠色加工重點實驗室(廣西科技大學)，廣西柳州 545006；3.廣西高校糖資源加工重點實驗室(廣西科技大學)，廣西柳州 545006)

食品添加劑是現(xiàn)代食品工業(yè)的重要組成部分，目前我國允許使用的食品添加劑種類達到 2 500 余種。但是近些年來食品安全事件屢有發(fā)生，存在一些超范圍、超限量使用食品添加劑甚至使用非法添加物的問題[1,2]。除了完善法律、加強監(jiān)管外，食品添加劑分析檢測方法的相關研究也成為熱點[3]。

檸檬黃(Tartrazine)又稱酒石黃，化學名稱為1-(4-磺酸苯基)-4-(4-磺酸苯基偶氮)-5-吡唑啉酮-3-羧酸三鈉[4]，它是一種水溶性偶氮型色素，廣泛用作食品藥品的著色劑[5]，但是長期或者過量攝入對身體有害，甚至致癌[6]。苯甲酸鈉(Sodium Benzoate)也稱安息香酸鈉，是常用的食品酸性防腐劑。然而長期或者過量攝入苯甲酸鈉也會對人體產(chǎn)生危害并引起癌變[7 - 9]。因此，我國對檸檬黃和苯甲酸鈉的使用都有嚴格的國家標準。

目前，檸檬黃和苯甲酸鈉的檢測方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層色譜法、分光光度法、毛細管電泳法[10,11]。加壓毛細管電色譜(Pressurized Capillary Electrochromaography,pCEC)是一種新型分離分析技術，它是液相色譜與毛細管電泳的結(jié)合，兼具兩者的優(yōu)點，具有柱效高、選擇性高、分離度大、快速檢測等特點[12,13]。目前，pCEC逐漸廣泛用于食品藥品分離檢測的研究[14]。本實驗旨在建立利用pCEC同時分離檢測飲料中檸檬黃和苯甲酸鈉的新方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

TriSepTM-2100型加壓毛細管電色譜(Unimicro Technologies)；UV-2102PC型紫外-可見分光光度計(UNICO)；AR124CN型電子天平(OHAUS)；SZ-93型自動雙重水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)；pHS-25型pH計(上海利達儀器廠)；GM-0.33型隔膜真空泵(天津市津騰實驗設備有限公司)；DL-60D型超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)；2009-1型臺式電動離心機(常州國華電器有限公司)；0.22 μm孔徑尼龍66針式過濾器(天津市津騰實驗設備有限公司)。

檸檬黃、苯甲酸鈉標準品(純度≥98%，北京北化恒信生物技術有限公司)；乙酸銨(西隴化工股份有限公司)，NaH2PO4(廣東臺山市粵僑試劑塑料有限公司)，以上試劑均為分析純；甲醇、乙腈為色譜純(安徽時聯(lián)特種溶劑股份有限公司)。實驗用水均為二次蒸餾水。

1.2 標準品與供試品溶液的制備

精密稱取一定量的檸檬黃、苯甲酸鈉標準品，分別用二次蒸餾水溶解定容至25 mL，分別配制得540、468 μg/mL的標準品儲備液。避光4 ℃保存，備用。

準確移取市售飲料試樣5 mL，超聲處理30 min(功率：300 W，40 kHz)，除去碳酸飲料中的CO2。4 000 r/min 離心10 min。靜置10 min，用津騰0.22 μm孔徑針式過濾器過濾，作為供試品溶液。

1.3 電色譜條件

色譜柱：EP-100-20/45-3-C18毛細管填充柱(內(nèi)徑100 μm，總長度45 cm，有效長度20 cm，內(nèi)徑3 μm，ODS填料)。定量環(huán)體積為1 μL，首次進樣量不小于40 μL，之后相同樣品的重復進樣量5 μL即可。流動相：20 mmol/L NaH2PO4-乙腈(60∶40，V/V)，泵流速為0.05 mL/min。分離電壓為+2 kV，檢測波長為245 nm，柱溫定為25 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離條件的優(yōu)化

2.1.1有機流動相種類和比例的優(yōu)化實驗考察了乙腈和甲醇兩種溶劑作為有機流動相對分離效果的影響。結(jié)果如圖1所示，當乙腈作為有機流動相時，被測物質(zhì)在6 min內(nèi)實現(xiàn)分離。這是由于與甲醇相比，乙腈的粘度低，洗脫能力大，分析時間短，分析靈敏度高，故本實驗采用乙腈作為有機流動相。此外還考察了乙腈體積分數(shù)為50%、40%和30%時的分離情況。實驗結(jié)果顯示，隨著乙腈比例的降低，被測物質(zhì)的保留時間延長，靈敏度降低，然而分離度增大。綜合考慮，選擇乙腈體積分數(shù)為40%作為分離條件。

2.1.2分離電壓的選擇電壓是影響帶電物質(zhì)保留時間長短和靈敏度大小的重要因素，也是pCEC分離的主要動力之一，是形成電滲流的重要條件。實驗考察了-2 kV、+1 kV、+2 kV和+4 kV電壓下檸檬黃和苯甲酸鈉的分離情況。當電壓為-2 kV時，被測物質(zhì)的峰形很差。從+1 kV到+4 kV，隨著正電壓不斷增大，被測物質(zhì)的保留時間不斷減小，靈敏度不斷增大，然而分離度不斷減小，理論塔板數(shù)減小，柱效降低。綜合以上因素，本文采用+2 kV作為分離電壓。

2.1.3緩沖鹽種類及濃度的選擇流動相中的緩沖鹽具有形成和穩(wěn)定電滲流的作用，可以提高實驗結(jié)果的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，對分離效果也有一定影響。實驗考察了NaH2PO4和NH4Ac對樣品的分離效果的影響。如圖2所示，當NaH2PO4作為緩沖鹽時，苯甲酸鈉的峰形很差。而NH4Ac作為緩沖鹽時，檸檬黃和苯甲酸鈉都有良好的峰形和分離效果。本實驗采用NH4Ac作為緩沖鹽?？疾炝?0、20、30 mmol/L NH4Ac對分離效果的影響，實驗結(jié)果表明，隨著NH4Ac濃度的不斷增大，被測物質(zhì)的靈敏度有增大的趨勢。這是由于緩沖鹽的濃度越大，流動相的離子強度越大，離子化的被測物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)橹行噪x子對復合物越多，相互之間的靜電排斥效應越小，從而使得柱效增大。然而緩沖鹽溶液的濃度越大，焦耳熱也越大，容易造成鹽析或者產(chǎn)生氣泡。綜合考慮，采用20 mmol/L的NH4Ac作為緩沖鹽溶液。

2.1.4流動相流速的選擇實驗考察了流速為0.030、0.040和0.050 mL/min時檸檬黃和苯甲酸鈉的分離情況。結(jié)果顯示，流動相流速越大，物質(zhì)的保留時間越短，而靈敏度減小，并且儀器損耗增大。綜合考慮，流動相流速設為0.05 mL/min。

2.2 方法學的考察

2.2.1線性關系及其相關系數(shù)、檢出限配制檸檬黃、苯甲酸鈉的系列標準溶液。首先分別配制得到403.68 μg/mL檸檬黃、36.2 μg/mL苯甲酸鈉的標準溶液，然后再分別稀釋0.8、0.4、0.2、0.1倍，得到檸檬黃、苯甲酸鈉的系列標準溶液。在優(yōu)化條件下每個濃度平行測定3次。以平均峰面積y對樣品濃度x(μg/mL)進行線性回歸，繪制標準曲線。回歸方程、線性范圍、相關系數(shù)及檢出限(S/N=3)見表1。

表1 檸檬黃、苯甲酸鈉的線性關系及檢出限

2.2.2重復性實驗按照1.2節(jié)中樣品供試品溶液的制備方法，分別制成不同飲料樣品5份，進行平行試驗測定。實驗測得檸檬黃峰面積的相對標準偏差(RSD)為4.8%，苯甲酸鈉峰面積的RSD為3.3%，重復性實驗結(jié)果良好。

2.2.3樣品測定和加標回收率實驗取1.2節(jié)制備的供試品溶液3份，分別加入系列標準溶液進行加標回收，每份平行測定3次?；厥章蕦嶒灲Y(jié)果見表2。檸檬黃的回收率為103.4%～104.9%，苯甲酸鈉的回收率為95.3%～97.2%，RSD均低于4.9%。

表2 檸檬黃和苯甲酸鈉的加標回收率(n=3)

2.3 實際樣品的檢測

取1.2節(jié)制備的供試品溶液，利用加壓毛細管電色譜法對供試樣品進行分離檢測，平行測定3次，實際樣品的pCEC圖譜如圖3所示。飲料樣品中檸檬黃和苯甲酸鈉在8 min內(nèi)實現(xiàn)了分離檢測，測得其中檸檬黃的含量為80.80 μg/ mL，苯甲酸鈉的含量為9.93 μg/ mL，符合食品添加劑國家標準[15]。

3 結(jié)論

本文建立了加壓毛細管電色譜檢測飲料樣品中檸檬黃和苯甲酸鈉的新方法。實驗結(jié)果顯示檸檬黃的回收率為103.4%～104.9%，苯甲酸鈉的回收率為95.3%～97.2%，相對標準偏差(RSD)均低于4.9%。該方法簡便可靠，有助于相關部門對市售飲料中檸檬黃和苯甲酸鈉進行質(zhì)量控制。