申志國， 黃碧霞， 陳鵬瑀， 王 靜， 修 榮， 劉 靜*

(1.河北醫(yī)科大學藥學院，河北石家莊 050017;(2.河北省邯鄲市峰峰牛兒莊礦社區(qū)管理處醫(yī)院，河北邯鄲 056201)

鹽酸林可霉素為常用抗生素，適用于由革蘭氏陽性菌引起的疾病治療[1,2]。臨床上可用來治療葡萄球菌屬、化膿性鏈球菌、肺炎鏈球菌及厭氧菌所致的呼吸道感染、皮膚軟組織感染、女性生殖道和盆腔感染及腹腔感染等疾病，其含量檢測方法主要有微生物效價法[3]和高效液相色譜法[4]。但這兩種方法都存在著操作繁瑣、成本較高、檢驗周期長等不足。目前，采用高效毛細管電泳(HPCE)法測定鹽酸林可霉素的含量也有文獻報道[5]。

本文利用分子印跡技術(shù)，制備了鹽酸林可霉素印跡膜傳感器，建立了測定鹽酸林可霉素含量的電化學分析新方法。該方法的顯著特點是傳感器制備簡單、成本低廉、測定準確、抗干擾能力強，且對藥物的高度識別性優(yōu)于其他測量方法?？蓱?yīng)用于臨床、制藥、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域鹽酸林可霉素含量的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660C型電化學工作站(上海辰華儀器有限公司)，采用三電極體系：玻碳電極(GCE,Φ=4 mm)或修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對電極。超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

鹽酸林可霉素原料藥(純度99%，華北制藥集團)，鄰苯二胺(o-PD)，過硫酸銨，N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA, 阿拉丁試劑)，其余試劑均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

鹽酸林可霉素注射液(批號：1311037，山東方明藥業(yè)集團股份有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1玻碳電極的預處理在鹿皮上將GCE依次用1.0、0.3、0.05 μm的Al2O3粉末拋光后，依次用HNO3-丙酮(體積比為1∶1)溶液和二次蒸餾水各超聲清洗5 min，將電極放入5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](含0.2 mol/L KCl )溶液中，在-0.3～0.7 V電位范圍內(nèi)，進行循環(huán)伏安(CV)法掃描至曲線穩(wěn)定，將電極取出，用二次蒸餾水洗凈，備用。

1.2.2印跡與非印跡修飾電極的制備以鹽酸林可霉素(0.01 mol/L)為模板分子，o-PD(0.03 mol/L)為功能單體，MBA(0.02 mol/L)為交聯(lián)劑，過硫酸銨(0.08 mol/L)為引發(fā)劑，進行電聚合反應(yīng)。采用三電極體系，在-0.3～0.7 V電位范圍內(nèi)進行CV掃描，掃描速率為50 mV/s，電聚合20圈。將電極取出置于正十二硫醇溶液中浸泡10 h后，用甲醇溶液洗脫15 min，即得鹽酸林可霉素印跡膜(MIP)電極[6]。將電極保存在pH=6.98磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中備用。非印跡(NMIP)電極的制備除不加模板分子外，其余步驟同上。

1.2.3檢測方法在反應(yīng)池中，以5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](含0.2 mol/L KCl )溶液為底液，加入鹽酸林可霉素溶液，插入三電極體系，進行差分脈沖伏安(DPV)法測定。測完一個濃度的樣品后，將電極在甲醇溶液中洗脫，除去鹽酸林可霉素分子，再進行下次測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同電極的循環(huán)伏安表征

圖1 不同電極的的循環(huán)伏安圖Fig.1 Cyclic voltammograms of different electrodes a:bare GCE;b:electrode after removal of lincomycin;c:imprinted polymer membrane electrode.

圖1為裸GCE、洗脫后和未洗脫印跡膜的三種電極在5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](含0.2 mol/L KCl )溶液中的CV圖。由圖1可見，未洗脫的印跡膜電極(圖1曲線c)氧化還原峰消失為一直線，這說明在電極表面聚合了一層致密均勻的絕緣膜,阻礙了電極表面的電子傳遞，導致電極幾乎無響應(yīng)信號。洗脫模板分子后的電極(圖1曲線b)，由于形成了印跡膜的空穴，有利于其在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，可以作為K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] 溶液的擴散通道，因此有明顯的峰電流。但由于模板分子不可能完全除去，故峰電流比裸GCE(圖1曲線a)低。

圖2 不同的電極在5 mmol/L的K4[Fe(CN)4]/K3[Fe(CN)6]溶液(pH=8.0)中的交流阻抗圖Fig.2 Electrochemical impedance spectra of different electrodes in 5 mmol/L K4[Fe(CN)4]/K3[Fe(CN)6] solution (pH=8.0) a.bare glassy carbon electrode;b.after removal of the lincomycin;c.after interaction with 1.892×10-7 mol/L lincomycin;d.after interaction with 3.628×10-7 mol/L lincomycin;e.NMIP-electrode.

2.2 不同修飾電極的交流阻抗

不同電極在5 mmol/L K4[Fe(CN)4]/K3[Fe(CN)6] (含0.2 mol/L KCl)溶液中的交流阻抗(EIS)圖見圖2。EIS圖上半圓直徑的大小，反映了印跡膜的阻抗大小。裸GCE(圖2曲線a)的EIS半圓直徑非常小，表明對K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]在電極上的氧化還原反應(yīng)有較小的阻抗。非印跡電極(圖2曲線e)的表面由于形成了致密的聚合物膜，導致鐵離子很難擴散到電極表面，氧化還原反應(yīng)很難進行，電流阻抗值很大，EIS半圓直徑最大。洗脫模板分子后的電極(圖2曲線b)，由于聚合膜內(nèi)留下多個“空穴”，鐵離子可以通過“空穴”在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，故其半圓直徑遠小于非印跡電極(圖2曲線e)。將去除模板后的電極置于林可霉素濃度分別為1.892×10-7mol/L和3.628×10-7mol/L的PBS中，林可霉素重新占據(jù)膜空穴。隨著濃度的增加，印跡膜的“空穴”數(shù)減少，交流阻抗增加，半圓直徑增大(圖2曲線c和d)。EIS圖表明分子印跡膜表面狀態(tài)的變化結(jié)果與CV圖一致。

2.3 洗脫液及洗脫時間的選擇

分別考察了甲醇、甲醇-乙酸(體積比為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4)溶液對模板分子的去除效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用甲醇-乙酸溶液洗脫，電極聚合物膜極易損壞。而用甲醇洗脫時，取得了較好的洗脫效果，CV曲線峰形規(guī)整，洗脫15 min后CV曲線不再發(fā)生變化，表明模板分子基本除去。因此實驗選擇甲醇為洗脫劑，洗脫時間為15 min。

2.4 交聯(lián)劑比例的選擇

本實驗固定林可霉素、o-PD物質(zhì)的摩爾比為1∶3，交聯(lián)劑MBA分別為1、2、3摩爾時，采用CV法考察了三種比例的分子印跡膜的性能。結(jié)果表明，交聯(lián)劑用量為3摩爾時，模板分子難以洗脫。當交聯(lián)劑用量為1摩爾時，聚合物在電極上成膜穩(wěn)定性較差。當林可霉素、o-PD及MBA摩爾比為1∶3∶2時聚合膜骨架穩(wěn)定，且膜板分子易于洗脫。故選此比例溶液為電極聚合液。

2.5 緩沖溶液pH值的選擇

固定林可霉素的濃度為0.01 mol/L，配制pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的PBS，考察酸度對電極聚合膜性能的影響。實驗表明溶液酸、堿性過強時，膜結(jié)構(gòu)易遭到破壞，導致膜的穩(wěn)定性和選擇性下降。且酸性過強時導致模板分子與o-PD所形成的氫鍵不穩(wěn)定。而當pH值為7.0時，氧化還原峰形較好，且響應(yīng)電流最大，因此選擇pH=7.0的PBS為檢測溶液。

2.6 孵化時間確定

將洗脫好的印跡膜電極置于1.0×10-8mol/L 林可霉素溶液中，分別浸泡7、8、9、10、11 min，通過DPV法考察峰電流與孵化時間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，孵化時間由7 min增加到到10 min時，峰電流不斷上升，但11 min時峰電流下降。表明電極表面空穴在10 min時基本被模板分子占據(jù)，達到結(jié)合平衡。故測定時的孵化時間選擇為10 min。

2.7 線性方程、標準曲線與檢出限

圖3 不同濃度林可霉素的差分脈沖伏安圖Fig.3 Differential pulse voltammograms of different lincomycin concentrations a-u:lincomycin concentrations(μmol/L)：0.066，0.100，0.189，0.277，0.363，0.447，0.530，0.612，0.692，0.771，1.00，1.20.

圖3為電極在不同濃度林可霉素溶液中的DPV圖。結(jié)果表明，在6.604×10-8～1.204×10-6mol/L濃度范圍內(nèi)，峰電流與林可霉素濃度呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為：Ip(μA)=-15.103c+0.00004，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9959，檢出限為5.0×10-9mol/L。

2.8 印跡膜電極的干擾試驗

采用DPV法，以峰電流的變化值小于±5%作為判定是否干擾電極測定的標準[7],考察了干擾物(大于林可霉素溶液濃度1 000倍的AlCl3、MgCl2、CaCl2、Na2SO4、KNO3、(NH4)2SO4、ZnCl2、環(huán)糊精)對測定的影響。結(jié)果表明，上述物質(zhì)對測定影響很小。但濃度大于林可霉素 100倍的氯霉素、氨基比林和阿奇霉素對測定有一定影響。

2.9 重現(xiàn)性與穩(wěn)定性

電極在林可霉素濃度為5.0×10-7mol/L 的溶液中平行測定5次，其DPV峰電流的相對標準偏差(RSD)為3.2%，表明電極具有良好的重現(xiàn)性。電極放置10 d后，印跡電極的峰電流降至90%，表明該印跡電極具有良好的穩(wěn)定性。

3 樣品分析及回收率

3.1 樣品分析

準確吸取鹽酸林可霉素注射液(標示量每支0.6 g/2mL),用5 mmol/L K4[Fe(CN)4]/K3[Fe(CN)6]的PBS稀釋成濃度為2.170×10-7mol/L的溶液。將上述溶液進行DPV法測定，平行測定5次，計算鹽酸林可霉素濃度，平均值為2.083×10-7mol/L，占注射劑標示量96.0%,RSD為0.097%。

3.2 回收率測定

在最佳測定條件下，加入一定濃度的鹽酸林可霉素標準溶液進行回收實驗，平行測定5次，取其平均值，回收率在95.9%～103.6%之間，結(jié)果見表1。

4 結(jié)論

以林可霉素為模板分子，鄰苯二胺為功能單體，N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑，采用電聚合法成功制備了林可霉素分子印跡膜電極。該電極具有制作簡便，靈敏度高，穩(wěn)定性強，選擇性好等特點，可用于臨床、制藥、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域林可霉素含量的測定。

表1 回收率測定結(jié)果