陳海玲， 謝維平

(1.泉州醫(yī)學高等?？茖W校，福建泉州 362100；2.泉州市疾病預防控制中心，福建泉州 362018)

萊克多巴胺(Ractopamine)作為主要的β2-受體激動劑，它能夠改善動物養(yǎng)分的代謝途徑，提高胴體瘦肉率[1]。由于其易在動物肝臟中積聚殘留，并可通過食物鏈進入人體，人食用后可能出現心跳加快、震顫、心悸等癥狀，嚴重危害人類健康。因此，研究苯克多巴胺的分析方法十分重要。目前，動物源性食品中瘦肉精檢測方法很多，主要有國家標準方法[2]、行業(yè)標準方法[3]和文獻報道方法[4]等。這些方法均采用高效液相色譜-串聯質譜技術，能準確測定目標物，但樣品的前處理步驟過于復雜，使得檢驗效率低，不能實現對動物源性食品的快速監(jiān)測。

β2-受體激動劑易在動物肝臟中積聚殘留，所以本方法主要對豬肝樣品中萊克多巴胺殘留檢驗的前處理步驟進行簡化，以提高檢測效率，建立的方法可達到國家標準的要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

液相色譜-串聯質譜儀(美國，Agilent公司)，配有電噴霧離子源，AB SciEX API 4000+；DC-12氮吹儀(上海安譜)；GL-20G -Ⅱ高速冷凍離心機(上海安亭)；A-1000S固相萃取裝置(日本，EYELA)；MCX固相萃取柱(60 mg/3mL，德國CNW)。

鹽酸萊克多巴胺標準溶液：準確移取1.00 mL的鹽酸萊克多巴胺標準品(農業(yè)部環(huán)境保護科研環(huán)境監(jiān)測所)，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，制成10 μg/mL的標準儲備液。氨化甲醇溶液：移取10.0 mL氨水于250 mL容量瓶中，用甲醇定容，混合均勻。甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。實驗用水為超純水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 儀器工作條件

液相色譜條件：色譜柱為Waters ATLANTICS C18柱(150×2.1 mm i.d.，5 μm)；流動相A為0.1%甲酸/水，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～1.0 min 95%A;1.0～5.0 min,95%～55%A;5.0～5.2 min,55%～95%A;5.2～10.0 min,95%A。流動相流速為0.3 mL/min；柱溫為35 ℃，進樣量為10 μL。

質譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描，多反應監(jiān)測(MRM)模式。噴霧電壓(IS)5 500 V，輔助氣溫度(TEM)600 ℃，進樣錐孔盤加熱器(ihe)設置為on，霧化氣(GS)壓力為50 kPa，輔助氣(GS)壓力為50 kPa，氣簾氣(CUR)壓力為35 kPa，碰撞室(CAD)氣體壓力為6 kPa。Ract的MRM離子對及質譜條件見表1。

表1 多反應監(jiān)測離子對及質譜條件

1.3 樣品提取及凈化

將洗凈、除去表面水分并剔除組織等雜質的豬肝樣品切小塊，準確稱取100.00 g于料理杯中，或加入100 μL 10 μg/mL萊克多巴胺溶液充分攪碎，制得豬肝樣品或萊克多巴胺含量為10 μg/kg的加標樣品。準確稱取2.00 g已制備好的豬肝樣品或加標樣品于50 mL離心管中，加入20 mL 0.1 mol/L HCl，漩渦5 min，充分混勻，超聲提取10 min后，加入200 μL HClO4(70%～72%)，漩渦混合均勻，4 ℃、8 000 r/min離心10 min。將上清液倒入另一50 mL離心管中，加入10 mL正己烷，在振蕩器上振蕩10 min，4 ℃、8 000 r/min離心10 min。棄去正己烷和乳化層，取下層液體10.00 mL于活化好的MCX交換柱上[1]，控制流速約1 d/10s。然后依次用水3.0 mL和甲醇-水(1+1)溶液3.0 mL淋洗柱子。淋洗完全后，抽真空3 min。以3.0 mL氨化甲醇溶液洗脫，溫度40 ℃水浴下用氮氣吹至近干，殘渣用甲醇定容至1.00 mL，經0.22 μm濾膜過濾后，在儀器工作條件下測定。

2 結果與討論

2.1 高氯酸的作用

肉制品的主要成分是蛋白質和脂肪，在樣品提取和純化過程中除去主要干擾成分蛋白質和脂肪至關重要[5]。而采用陽離子交換固相萃取柱檢測β2-受體激動劑時，必須調節(jié)樣品的pH值以達到被測物在水相或有機相分配的目的，但存在被測物被吸附等缺點[6]。本實驗在酸解的同時加入少量HClO4，一方面可以沉淀蛋白質，另外可以水解一部分脂肪，同時使測定的目標物在酸性條件下離子化，增大溶出率和提取效率，而不需要特意調節(jié)pH值，簡化了操作步驟。

2.2 酸解與酶解的對比

β2-受體激動劑在動物體內代謝過程中會在葡萄糖醛苷、硫酸酯蛋白等作用下發(fā)生各種軛合反應，生成的軛合物將長期存在[7,8]，必須破壞這種結構使之游離出來才能進行測定。國家標準方法[2]及文獻報道的方法[7 - 9]中動物源性食品常用酶解法，即用β-鹽酸葡萄糖醛甙酶-芳基硫酯酶，本文采用HCl酸解，實驗將兩種方法進行比較，結果表明，兩種方法回收率相差不大，均能符合分析方法的要求。但酶解法成本昂貴且前處理步驟過于復雜，檢驗效率低，增加了大量肉制品檢驗和風險監(jiān)控的難度。不能及時反映豬肉質量或市場情況。

2.3 豬肝樣品對萊克多巴胺吸附時間對吸附率的影響

實驗考察陰性豬肝樣品對萊克多巴胺吸附時間對提取效率的影響。按上述方法制備加標樣品后，實驗考察了吸附時間為0、1、2、12、24、36 h后，酸的提取效率，結果表明，不同吸附時間下，平均回收率在75%～80%。這說明吸附時間對回收率的影響并不大，HCl均能夠有效提取豬肝樣品中的萊克多巴胺。所以，后續(xù)實驗選擇吸附時間為0 h，即豬肝樣品加標后馬上用酸提取。

2.4 酸的種類對提取效果的影響

按上述方法，實驗考察了濃度均為0.1 mol/L的HCl、H2SO4、HNO3、H3PO4、HClO4和三氯乙酸對提取效果的影響。實驗發(fā)現，對于萊克多巴胺含量為10 μg/kg的豬肝樣品，H3PO4和三氯乙酸提取的回收率相對較低，分別是56.7%和53.5%，且用三氯乙酸提取后樣品雜質峰相對較多。用HCl、H2SO4、HNO3、HClO4提取效果相近，回收率分別為77.6%、75.4%、74.6%和76.0%。用HCl和HNO3提取時，加入200 μL HClO4溶液(70%～72%)后，可沉淀豬肝樣品中的蛋白質，使樣品初步凈化。實驗選擇HCl用來提取豬肝中的萊克多巴胺。

2.5 酸的濃度、提取時間等因素對提取效果的影響

對萊克多巴胺含量為10 μg/kg的加標樣品，實驗采用正交試驗L16(45)對酸的濃度、提取時間、提取溫度和HClO4用量進行考察，每個樣品號平行測定3次。正交試驗表見表2。

表2 L16(45)正交設計試驗表

實驗發(fā)現，當HCl濃度≥0.2 mol/L，HClO4體積≥100 μL時，方法的回收率在80%～110%之間，符合食品分析方法的要求。為了使提取方法簡便易行，提取溶液澄清易過柱，盡可能使方法回收率高，選擇HCl濃度為0.2 mol/L、提取時間為40 min、提取溫度為25 ℃、高氯酸用量為200 μL為最佳提取方法。

2.6 精密度實驗

取未檢出目標物的豬肝空白樣品，加標制備萊克多巴胺濃度為10.0 μg/kg的加標樣品。按正交試驗所篩選的最佳條件進行處理，平行處理6份進行測定，測得日內精密度為3.13%。連續(xù)處理3 d，每天平行處理6份，日間精密度為3.86%。

2.7 加標實驗

在未檢出目標物的豬肝空白樣品中，分別添加一定體積的萊克多巴胺標準儲備液，使添加濃度分別為0.50、5.00和10.0 μg/kg。按正交試驗所篩選的最佳條件進行處理，平行測定6次，計算回收率，結果分別為82.0%、88.0%和102.0%，本方法可以滿足不同濃度水平萊克多巴胺的檢測要求。

3 結論

研究了HCl結合HClO4直接提取豬肝樣品中的萊克多巴胺，方法操作簡單，靈敏度高，回收率高，分析成本低，滿足國家及行業(yè)對動物源性食品的萊克多巴胺進行快速提取，有望推廣至動物源性食品中多種β2-受體激動劑的提取。