趙錦慧，王智巧，霍少杰

(周口師范學(xué)院 生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南 周口 466001)

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重金屬對(duì)蠶豆種子萌發(fā)及體細(xì)胞分裂的影響

趙錦慧，王智巧，霍少杰

(周口師范學(xué)院 生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南 周口 466001)

采用醋酸鉛脅迫處理蠶豆種子及其側(cè)根，研究其不同濃度對(duì)蠶豆種子側(cè)根萌發(fā)情況、側(cè)根根系活力、側(cè)根根尖細(xì)胞微核率、側(cè)根形態(tài)和顏色及蠶豆幼苗葉片中葉綠素含量等的影響．結(jié)果顯示，同一處理濃度下，隨著醋酸鉛脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，蠶豆側(cè)根根系活力減弱，根尖細(xì)胞微核率上升，側(cè)根根長(zhǎng)增加幅度和側(cè)根發(fā)生率升高幅度減小，幼苗葉片內(nèi)葉綠素含量下降，而側(cè)根彎曲度未發(fā)生變化；同一處理時(shí)間下，醋酸鉛處理濃度與側(cè)根根系活力、幼苗葉片內(nèi)葉綠素含量成反比，與側(cè)根根尖細(xì)胞微核率成正比．另外，隨著醋酸鉛脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)和處理濃度的增大，蠶豆幼苗側(cè)根的顏色發(fā)生明顯變化甚至出現(xiàn)爛根現(xiàn)象．與對(duì)照相比，不同濃度的醋酸鉛脅迫對(duì)蠶豆種子側(cè)根萌發(fā)、側(cè)根根尖細(xì)胞微核率、側(cè)根根系活力、側(cè)根形態(tài)和顏色及蠶豆幼苗葉片內(nèi)葉綠素含量均有不同程度的影響．

蠶豆；鉛脅迫；微核率；形態(tài)變化；生理指標(biāo)

近年來(lái)，各種來(lái)源的重金屬不斷引起環(huán)境污染，重金屬污染是不可逆的，它在作物的可食部位過(guò)量積累，可以經(jīng)食物鏈傳遞，并最終對(duì)人類的健康帶來(lái)危害，因此重金屬污染已引起人類廣泛關(guān)注．植物對(duì)重金屬的吸收、積累及重金屬對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、生理生化和形態(tài)結(jié)構(gòu)等的影響已有較多報(bào)道[1-8]．蠶豆是很好的細(xì)胞遺傳學(xué)研究材料，其體細(xì)胞染色體是六對(duì)較大的染色體，并且其根尖含有較多的分裂相細(xì)胞，有利于顯微觀察．蠶豆根尖微核實(shí)驗(yàn)是國(guó)際上常用的遺傳毒理學(xué)檢測(cè)技術(shù)，在國(guó)內(nèi)外環(huán)境毒性檢測(cè)中被廣泛運(yùn)用[9-12]，因此可利用蠶豆根尖分裂細(xì)胞的微核率測(cè)知污染物的環(huán)境毒理效應(yīng)．隨著鉛污染日趨嚴(yán)重，鉛的毒理效應(yīng)研究也不斷深入[l3]．本實(shí)驗(yàn)以蠶豆為材料，在蠶豆萌發(fā)和生長(zhǎng)過(guò)程中采用不同濃度的醋酸鉛脅迫，旨在探明不同濃度的醋酸鉛溶液對(duì)蠶豆根系生長(zhǎng)、葉片生理生化指標(biāo)及根尖體細(xì)胞有絲分裂的影響，為開展重金屬污染蠶豆的生物監(jiān)測(cè)提供依據(jù)．

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

周口市售普通蠶豆．

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)試劑制備

鉛脅迫液的制備：精密稱取10 mg醋酸鉛(優(yōu)級(jí)純)放入燒杯中，加20 mL水，全部溶解后移入1 000 mL容量瓶中，加水定容至刻度，配成鉛溶液濃度為10 mg/L．同法配制濃度分別為25，50，100，200，400，800 mg/L的醋酸鉛溶液．

解離液制備：量取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36%的鹽酸43 mL，倒入燒杯中，玻璃棒引流至500 mL容量瓶中，加入蒸餾水定容，此溶液即為1 mol/L的鹽酸．

染色液制備：制備改良的苯酚品紅染色液[14]．

1.2.2蠶豆種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)

選擇飽滿、大小均勻、無(wú)損傷的蠶豆種子，自來(lái)水洗凈后用70%的乙醇消毒30 s，蒸餾水沖洗數(shù)次后，再用0.1%的HgCl2消毒10 min，蒸餾水沖洗3～4次后，在裝有蒸餾水的燒杯中浸種1 d，放入托盤中進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度(25±1) ℃，培養(yǎng)期間每天換水1次[15]．待多數(shù)胚根長(zhǎng)至1～2 cm時(shí)，切去主根，將蠶豆轉(zhuǎn)移至大培養(yǎng)皿中，按以下2種方式進(jìn)行培養(yǎng)．第1種培養(yǎng)方式為：分別用濃度為0，10，25，50，100，200，400，800 mg/L的醋酸鉛溶液脅迫培養(yǎng)，每種濃度培養(yǎng)1皿，每皿25顆，每天換培養(yǎng)液．第2種培養(yǎng)方式為：用蒸餾水培養(yǎng)，共8皿，每皿25顆，每天換蒸餾水一次，至側(cè)根長(zhǎng)出．2種培養(yǎng)方式用于測(cè)定不同指標(biāo)．

1.2.3實(shí)驗(yàn)處理設(shè)計(jì)

第1種培養(yǎng)方式下共設(shè)置8個(gè)組，1個(gè)組為對(duì)照組(蒸餾水培養(yǎng))，另外7個(gè)組為醋酸鉛脅迫組，側(cè)根發(fā)生率、側(cè)根彎曲度、側(cè)根根長(zhǎng)、葉綠素含量等指標(biāo)的測(cè)定按照此處理設(shè)計(jì)進(jìn)行．

第2種培養(yǎng)方式下也設(shè)置8個(gè)組，待側(cè)根長(zhǎng)至1～2 cm時(shí)，分別用濃度為0，10，25，50，100，200，400，800 mg/L的醋酸鉛溶液染毒處理24 h，蒸餾水沖洗2～3次，再用蒸餾水恢復(fù)培養(yǎng)24 h．側(cè)根根系活力、微核率等指標(biāo)的測(cè)定按照此處理設(shè)計(jì)進(jìn)行．

取材時(shí)間設(shè)定：測(cè)定微核率時(shí)，需要在蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂最旺盛時(shí)取材．蠶豆根尖生長(zhǎng)點(diǎn)細(xì)胞在19 ℃時(shí)，一個(gè)細(xì)胞周期約為19.3 h，分裂期只持續(xù)不到0.5 h，而且分裂細(xì)胞并不同步，因此任何時(shí)刻只有一小部分細(xì)胞處于分裂期．一天中，細(xì)胞分裂有一定規(guī)律，實(shí)驗(yàn)表明，蠶豆一般上午8～10時(shí)、下午2～5時(shí)處于分裂高峰期．只有在分裂高峰期取材固定，才能保證觀察到較多處于分裂期的細(xì)胞[16]．因此本實(shí)驗(yàn)取材時(shí)間設(shè)定為上午9時(shí)左右，以期可以觀察到更多分裂期的細(xì)胞，并減小根系活力測(cè)定誤差．

1.2.4指標(biāo)測(cè)定

側(cè)根發(fā)生率的測(cè)定：在第1種培養(yǎng)方式下，每天觀察1次側(cè)根情況，統(tǒng)計(jì)各組1、2、3、4、5 d后的側(cè)根發(fā)生率．側(cè)根發(fā)生率%=(側(cè)根長(zhǎng)出的蠶豆種子數(shù)/總蠶豆種子數(shù))× 100．

側(cè)根根長(zhǎng)的測(cè)定：待側(cè)根長(zhǎng)出后，用毫米刻度尺測(cè)量側(cè)根生長(zhǎng)量．彎曲的側(cè)根先用細(xì)線測(cè)量，再將細(xì)線拉直測(cè)定其長(zhǎng)度．

側(cè)根彎曲度的測(cè)定：待側(cè)根長(zhǎng)出后，量角器量取側(cè)根彎曲度．

微核率的測(cè)定：微核率‰=(觀察到的微核數(shù)目/觀察到的細(xì)胞數(shù)目)×1 000．

根系活力測(cè)定[17]：經(jīng)染毒24 h，恢復(fù)培養(yǎng)24 h后，采用TTC法進(jìn)行根系活力的測(cè)定．

葉綠素含量的測(cè)定：采用蘇正淑[18]等的方法進(jìn)行測(cè)定．

2　結(jié)果與分析

2.1不同濃度醋酸鉛脅迫對(duì)蠶豆種子側(cè)根發(fā)生率的影響

不同濃度醋酸鉛脅迫對(duì)蠶豆種子側(cè)根發(fā)生率的影響結(jié)果見表1．由表1可知，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組與醋酸鉛脅迫組側(cè)根發(fā)生率均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，在同樣處理時(shí)間下，隨著醋酸鉛濃度的升高，側(cè)根發(fā)生率大致呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì). 這說(shuō)明處理時(shí)間越長(zhǎng)，側(cè)根發(fā)出的越多，而且低濃度的醋酸鉛有利于側(cè)根的發(fā)生；高濃度(≥400 mg/L)醋酸鉛脅迫處理3 d時(shí)，蠶豆種子側(cè)根發(fā)生率明顯降低，說(shuō)明高濃度可以抑制側(cè)根的發(fā)生．

表1　不同濃度醋酸鉛脅迫下蠶豆種子側(cè)根發(fā)生率(%)

2.2不同濃度醋酸鉛脅迫對(duì)蠶豆種子側(cè)根根長(zhǎng)的影響

不同濃度醋酸鉛脅迫對(duì)蠶豆種子側(cè)根根長(zhǎng)的影響結(jié)果見表2．由表2可知，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組與醋酸鉛脅迫組側(cè)根根長(zhǎng)均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，但對(duì)照組側(cè)根根長(zhǎng)增加幅度最大，與醋酸鉛脅迫組差異明顯，醋酸鉛脅迫組側(cè)根根長(zhǎng)增加幅度大致與醋酸鉛濃度成反比．從表2中還可以看出，低濃度醋酸鉛處理1 d時(shí)側(cè)根生長(zhǎng)速度反而比對(duì)照快，處理2 d和3 d時(shí)側(cè)根生長(zhǎng)速度明顯比對(duì)照慢，處理4 d與5 d時(shí)測(cè)得的根長(zhǎng)未發(fā)生變化. 這說(shuō)明低濃度醋酸鉛短時(shí)間作用反而有利于蠶豆側(cè)根的生長(zhǎng)，但長(zhǎng)時(shí)間作用會(huì)降低蠶豆側(cè)根生長(zhǎng)速度，甚至阻止蠶豆側(cè)根的生長(zhǎng)．

2.3不同濃度醋酸鉛脅迫對(duì)蠶豆種子側(cè)根彎曲度的影響

不同濃度的醋酸鉛脅迫對(duì)蠶豆種子側(cè)根彎曲度的影響結(jié)果見表3．表3顯示，對(duì)照組與醋酸鉛脅迫組側(cè)根彎曲度差別明顯，但自側(cè)根長(zhǎng)出后，隨著醋酸鉛處理時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組與醋酸鉛處理組側(cè)根彎曲度未發(fā)生變化. 這說(shuō)明醋酸鉛處理濃度對(duì)蠶豆側(cè)根彎曲度有影響，但醋酸鉛處理時(shí)間對(duì)蠶豆側(cè)根彎曲度無(wú)影響．

2.4不同濃度醋酸鉛脅迫對(duì)蠶豆種子側(cè)根根尖細(xì)胞微核率的影響

表2　不同濃度醋酸鉛脅迫下蠶豆種子側(cè)根根長(zhǎng)(cm)

表3　不同濃度醋酸鉛脅迫下蠶豆種子側(cè)根彎曲度(°)

表4　不同濃度醋酸鉛脅迫下蠶豆種子側(cè)根根尖細(xì)胞微核率(‰)

不同濃度醋酸鉛脅迫對(duì)蠶豆種子側(cè)根根尖細(xì)胞微核率的影響結(jié)果見表4．由表4可知，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組側(cè)根根尖細(xì)胞微核率均為0，醋酸鉛脅迫組側(cè)根根尖細(xì)胞微核率呈上升趨勢(shì)，高濃度(≥400 mg/L)醋酸鉛脅迫處理5 d時(shí)，蠶豆種子側(cè)根根尖細(xì)胞微核率達(dá)到100‰．表4還顯示，同樣處理時(shí)間下，醋酸鉛濃度越大，根尖細(xì)胞微核率越高．上述分析結(jié)果說(shuō)明蠶豆側(cè)根根尖細(xì)胞微核率受醋酸鉛處理時(shí)間與處理濃度的雙重影響．

2.5不同濃度醋酸鉛脅迫對(duì)蠶豆種子側(cè)根根系活力的影響

不同濃度醋酸鉛脅迫對(duì)蠶豆種子側(cè)根根系活力的影響結(jié)果見表5．由表5可知，醋酸鉛脅迫組根系活力明顯低于對(duì)照組根系活力．隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組與醋酸鉛脅迫組根系活力均減弱，但對(duì)照組根系活力減弱不明顯，醋酸鉛脅迫組根系活力減弱明顯，尤其是高濃度(≥400 mg/L)醋酸鉛脅迫處理5 d時(shí)，蠶豆種子側(cè)根根系活力降為0．同樣處理時(shí)間下，蠶豆種子側(cè)根根系活力與醋酸鉛濃度大致呈反比．這說(shuō)明不同濃度的醋酸鉛溶液對(duì)蠶豆種子側(cè)根根系活力的影響程度不同，根系活力大小是由醋酸鉛處理時(shí)間與處理濃度共同決定的．

表5　不同濃度醋酸鉛脅迫下蠶豆種子側(cè)根根系活力(mg·g -1·h -1)

2.6不同濃度醋酸鉛脅迫對(duì)蠶豆幼苗葉綠素含量的影響

不同濃度醋酸鉛脅迫對(duì)蠶豆幼苗葉綠素含量的影響結(jié)果見表6．由表6可知，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組葉綠素含量變化不明顯，醋酸鉛脅迫組葉綠素含量呈下降趨勢(shì)；同樣處理時(shí)間下，醋酸鉛脅迫組葉綠素含量隨醋酸鉛濃度增大而減少，這說(shuō)明醋酸鉛處理時(shí)間與處理濃度對(duì)蠶豆幼苗葉片中葉綠素含量均有影響．

表6　不同濃度醋酸鉛脅迫下蠶豆幼苗葉綠素含量(mg·g -1 )

3　結(jié)論與討論

3.1結(jié)論

本研究結(jié)果表明，與對(duì)照相比，不同濃度的醋酸鉛脅迫對(duì)蠶豆種子側(cè)根發(fā)生率、側(cè)根根長(zhǎng)、側(cè)根根尖細(xì)胞微核率、側(cè)根根系活力及蠶豆幼苗葉片內(nèi)葉綠素含量均有不同程度的影響．隨著醋酸鉛脅迫天數(shù)的延長(zhǎng)，蠶豆種子的側(cè)根根系活力減弱，幼苗葉片內(nèi)葉綠素含量下降，根尖細(xì)胞微核率上升，側(cè)根根長(zhǎng)增加幅度及側(cè)根發(fā)生率升高幅度減小，而側(cè)根彎曲度未發(fā)生變化；醋酸鉛處理濃度與側(cè)根根系活力、幼苗葉片內(nèi)葉綠素含量成反比，與側(cè)根根尖細(xì)胞微核率成正比．總之，除側(cè)根彎曲度只受醋酸鉛處理濃度影響外，其余各項(xiàng)指標(biāo)均受醋酸鉛處理時(shí)間與處理濃度的雙重影響．

3.2討論

植物對(duì)鉛的吸收是由根系完成的，根系受到毒害后會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)速度減慢、胚根數(shù)量減少、根系活力降低等現(xiàn)象. 根部發(fā)育受到影響后，地上部幼苗的生長(zhǎng)也會(huì)受到抑制，幼苗會(huì)表現(xiàn)出植株矮小、葉片色澤變化、葉片內(nèi)各種生理活性物質(zhì)發(fā)生變化等癥狀[19-21]．本試驗(yàn)中，在醋酸鉛脅迫下，蠶豆根系及葉片性狀均發(fā)生類似的變化．

于拴倉(cāng)[22]等用鉛處理黃瓜、番茄、大白菜幼苗后發(fā)現(xiàn)，鉛對(duì)3種蔬菜幼苗胚根的伸長(zhǎng)均表現(xiàn)明顯的抑制作用，并且隨著處理濃度的增加，胚根伸長(zhǎng)抑制百分率明顯增加，側(cè)根發(fā)生受到嚴(yán)重抑制，甚至胚根畸形、褐化壞死．本試驗(yàn)研究結(jié)果與其相似，蠶豆側(cè)根受到毒害后，隨著醋酸鉛處理濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，側(cè)根顏色變化過(guò)程為黃色—灰色―褐色―黑色，從變?yōu)楹稚_始出現(xiàn)爛根現(xiàn)象，黑色出現(xiàn)燒苗現(xiàn)象，而變?yōu)榛疑忘S色的根在恢復(fù)培養(yǎng)24 h后顏色有所緩解，表現(xiàn)出生長(zhǎng)現(xiàn)象．蠶豆側(cè)根彎曲度不受處理時(shí)間的影響，可能與側(cè)根有絲分裂指數(shù)降低有關(guān)，側(cè)根生長(zhǎng)速度隨醋酸鉛濃度增加明顯減慢，造成根長(zhǎng)變化不明顯，因此短時(shí)間內(nèi)，側(cè)根彎曲度未發(fā)生變化．

微核(micronucleus，簡(jiǎn)稱MCN)是一種在細(xì)胞核以外，游離于細(xì)胞漿中的小塊染色質(zhì)，是真核生物細(xì)胞中的一種異常結(jié)構(gòu)，是染色體畸變的一種表現(xiàn)形式[23]．微核可作為反映外源因素對(duì)細(xì)胞染色體損傷程度的指標(biāo)，因此，微核率在一定程度上可以反映植物受毒害的深淺．若植物細(xì)胞在分裂期間受到外源因素的污染，便會(huì)導(dǎo)致染色體斷裂或DNA的損傷，染色體發(fā)生斷裂時(shí)，若重接過(guò)程中，具有著絲粒的2條斷裂染色體重新結(jié)合在一起，發(fā)生了錯(cuò)誤重接，則在細(xì)胞分裂時(shí)，就會(huì)觀察到染色體橋；如若未能重接，在初期細(xì)胞中，則看到染色體斷片，具有雙著絲粒的染色體橋和染色體斷片經(jīng)細(xì)胞分裂，會(huì)造成遺傳物質(zhì)的丟失，從而使生物體發(fā)生遺傳性的畸變．或者在外源物刺激作用下，不引起染色體或DNA的損傷，而是影響有絲分裂周期，使DNA滯后或丟失，在細(xì)胞質(zhì)中形成微核[12]．蠶豆側(cè)根是研究微核的理想材料．蠶豆側(cè)根分裂相細(xì)胞所占比例高，一般在1個(gè)視野里可見數(shù)個(gè)不同期的分裂相細(xì)胞，有的壓片部位在1個(gè)視野里可看到有絲分裂各期細(xì)胞[24]．該試驗(yàn)中，可以明顯看到隨醋酸鉛處理濃度、處理時(shí)間的增加，微核率呈升高趨勢(shì)，說(shuō)明蠶豆側(cè)根根尖細(xì)胞受到的毒害隨著醋酸鉛處理濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)而加深．本試驗(yàn)中觀察的微核現(xiàn)象見圖1．

圖1　50 mg/L的醋酸鉛威迫處理下蠶豆側(cè)根根尖細(xì)胞微核現(xiàn)象

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Effects of heavy metals on seed germination and somatic cell division of broad bean

ZHAO Jinhui, WANG Zhiqiao, HUO Shaojie

(College of Life Science and Agronomy, Zhoukou Normal University, Zhoukou 466001, China)

Seeds and lateral roots of broad bean were treated with lead acetate stress to study the influence of different concentrations of lead acetate on lateral root germination, lateral root vigor, root tip cell micronucleus rate, lateral root morphology and color of broad bean seed and the chlorophyll content of broad bean seedling leaves and so on. The results showed that under the same concentration of lead acetate, with the extension of treatment time, the lateral root vigor of broad bean was reduced, the root tip cell micronucleus rate was increased, length increased range and incidence rate ascending range of lateral root were decreased, chlorophyll content in leaves was decreased, however the lateral root curvature was unchanged; Under the same treatment time, concentration of lead acetate was inversely proportional to lateral root vigor and chlorophyll content in leaves, conversely, treatment concentration of lead acetate in direct proportion to root tip cell micronucleus rate of lateral root. In addition, with extension of treatment time and increase of treatment concentration of lead acetate, the color of lateral root of broad bean seedling altered obviously and even appeared root rot. The above showed that different concentrations of lead acetate had varying effects on lateral root germination of broad bean seeds, root tip cell micronucleus rate, lateral root vigor, lateral root morphology and color and chlorophyll content of broad bean seedling leaves compared with the control.

broad bean；lead acetate stress；micronucleus rate；morphologic change；physiological indexes

2016-05-20;

2016-06-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.41271280)；周口師范學(xué)院2016年度大學(xué)生科研創(chuàng)新基金項(xiàng)目(No.zknuD201685)

趙錦慧(1979- )，女，河南周口人，碩士，講師，主要從事生物技術(shù)及植物逆境生理研究工作．

X503.231；Q945.79

A

1671-9476(2016)05-0106-05

10.13450/j.cnki.jzknu.2016.05.028