響應面優(yōu)化彈性蛋白酶酶解羅非魚下腳料的工藝研究

瞿葉輝， 丁利君， 彭文媛， 劉珊珊， 黃金， 成曉玲

(廣東工業(yè)大學 1.輕工化工學院；2.材料與能源學院，廣東 廣州 510006)

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響應面優(yōu)化彈性蛋白酶酶解羅非魚下腳料的工藝研究

瞿葉輝1， 丁利君1， 彭文媛1， 劉珊珊1， 黃金2， 成曉玲1

(廣東工業(yè)大學 1.輕工化工學院；2.材料與能源學院，廣東 廣州 510006)

以羅非魚加工魚片的下腳料魚頭、魚骨、魚尾等為原料，選用彈性蛋白酶對其水解，通過響應面進行分析并優(yōu)化酶解條件.以水解度與多肽含量為指標，分別對酶濃度、溫度、pH值、料液比、酶解時間等因素對彈性蛋白酶酶解羅非魚下腳料水解效果的影響進行分析.結果表明,彈性蛋白酶水解羅非魚加工下腳料的最佳條件為：酶濃度0.553mg/g，料液比1∶5、自然pH、溫度41.94 ℃、酶解3.31h，在此條件下得到的水解度為18.09%，多肽含量為0.9mg/mL.

羅非魚下腳料； 響應面分析； 彈性蛋白酶； 水解度； 多肽含量

羅非魚屬鱸形目(Perciformes)麗鯛科(Cichlidae)羅非魚屬(Tilapia), 在熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛養(yǎng)殖, 營養(yǎng)價值高，素有“白肉三文魚”、“21世紀的魚”之稱[1].中國羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)量世界第一,2010年的產(chǎn)量達120萬t，而全球羅非魚產(chǎn)量接近300萬t. 廣東省是國內(nèi)羅非魚養(yǎng)殖范圍最廣、產(chǎn)量及出口量最高的省份[2].近年來隨著我國羅非魚魚片的出口數(shù)量迅速上升,大量的羅非魚下腳料隨之產(chǎn)生，幾乎占整條羅非魚的54%,其中魚頭、內(nèi)臟、魚鱗、魚骨和魚皮分別占26.5%、6.8%、2.2%、16.5%和4.0%，而這些原料富含氨基酸、蛋白質(zhì)和各種活性礦物質(zhì)，可作為人類可利用的蛋白源和營養(yǎng)源[3-4].近幾年來，國內(nèi)外有不少對魚類加工下腳料的綜合利用的研究探討，主要為通過酶法提取蛋白水解產(chǎn)物，積累了大量的技術經(jīng)驗，為綜合利用開辟了新的途徑[5-6].用酶水解的水產(chǎn)動物蛋白多肽用途廣泛，需求量較大，市場前景廣闊，因此對多肽的研究具有十分重要的意義，而魚的下腳料及低值魚為理想的優(yōu)質(zhì)蛋白來源，可用來做為水解蛋白多肽的原料[7-8].利用蛋白酶對羅非魚下腳料進行水解的研究較多，主要是魚鱗、魚骨、魚皮等，丁利君等人[9]用枯草桿菌蛋白酶酶解羅非魚魚糜，取得了很好的效果，曾世祥等人[10]篩選不同酶酶解羅非魚下腳料，得到木瓜蛋白酶的酶解效果最好.本研究以羅非魚下腳料為原料，選用彈性蛋白酶對其進行酶解，并利用響應面設計優(yōu)化酶解工藝，為羅非魚下腳料的綜合利用提供了理論依據(jù).

1　材料與方法

1.1材料與儀器

羅非魚下腳料(魚頭、魚骨、魚尾等)，深圳聯(lián)合水產(chǎn)發(fā)展有限公司提供；彈性蛋白酶(30U/mg)，南京奧多福尼生物科技有限公司；還原型谷胱甘肽標準品，sigma公司；濃硫酸，硼酸，鹽酸，磷酸二氫鈉，三氯乙酸，磷酸氫二鈉，甲醛，百里酚酞，乙酸鎂，氫氧化鈉，中性紅，無水乙醚等，均為分析純.UV-1200型分光光度計，上海美譜達儀器有限公司.

1.2羅非魚下腳料基本成分分析

(1) 水分含量測定：恒溫干燥法(GB5009.3-2010).

(2) 脂肪含量測定：索士提取法(GB5009.6-2003).

(3) 蛋白質(zhì)含量測定：凱氏定氮法(GB5009.5-2010).

(4) 灰分的測定：灰化法(GB5009.4-2010).

1.3水解度及多肽含量的測定

1.3.1水解度的測定

水解度的測定采用甲醛滴定法[11-12].

式中,V1為空白消耗NaOH溶液的體積(mL)；V2為滴定樣品時消耗的NaOH溶液的體積(mL)；C為NaOH溶液的濃度(mol/L)；M為所取水解液的體積(mL).

1.3.2多肽含量的測定

參考魯偉[13]、ChalamaiahM[14]等人的方法繪制標準曲線，測定多肽含量.由標準曲線得回歸方程：Y=0.114X+0.003 216， R2=0.994.

1.4羅非魚下腳料的酶解工藝

羅非魚下腳料→清洗預處理→粉碎→高壓蒸煮→彈性蛋白酶酶解→滅酶→離心→上清液.

1.5酶解條件的確定

選取酶濃度、酶解時間、酶解溫度、pH、料液比5個單因素，以水解度與多肽含量為考察指標，確定對酶解效果較顯著的因素及水平.在單因素試驗的基礎上，根據(jù)Box-Behnken-Design響應面優(yōu)化設計，以水解度及多肽含量為響應值[15].

2　結果與分析

2.1羅非魚下腳料基本成分分析

由表1可知，新鮮羅非魚加工下腳料含有大量水分，達50.89%，蛋白質(zhì)的質(zhì)量百分比含量高達23.10%，說明羅非魚下腳料是一種不可忽視的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源，可應用于多肽產(chǎn)品的開發(fā)及利用.

表1　羅非魚下腳料成分分析

2.2酶解羅非魚下腳料的單因素試驗

2.2.1酶濃度對酶解效果的影響

稱取羅非魚下腳料樣品2g，100 ℃滅酶后冷卻，然后分別配制0、10、20、30、50、70、100U/g7個梯度的酶溶液，在pH值7.8、溫度25 ℃、料液比1∶5的條件下酶解2h，以水解度(DH)和多肽含量(PC)為指標，探討不同酶濃度對酶解效果的影響.圖1表明，當酶濃度從0到20U/g時，水解度與多肽濃度上升速度非?？欤S著酶濃度的增加，水解度變化不大，多肽含量呈現(xiàn)下降的趨勢.

圖1　酶濃度對酶解效果的影響

2.2.2酶解時間對酶解效果的影響

稱取樣品2g，100 ℃滅酶后冷卻，在酶濃度20U/g、pH值7.8、溫度25 ℃、料液比1∶5的條件下，分別酶解0、1、2、3、5、7、10h，分析不同酶解時間對酶解效果的影響.從圖2可看出，隨著酶解時間的增加，在0～2h范圍內(nèi)，水解度和多肽含量均有所上升，當酶解時間超過2h后，多肽含量呈現(xiàn)稍微下降的趨勢，而水解度在2h時達到最大值并趨于平衡.

圖2　酶解時間對酶解效果的影響

2.2.3酶解溫度對酶解效果的影響

稱取樣品2g，100 ℃滅酶后冷卻，以酶濃度20U/g、pH值7.8、料液比1∶5為固定條件，分別在室溫(22 ℃)、5、15、25、35、45、55 ℃的條件下酶解2h分析不同酶解溫度對酶解效果的影響.從圖3可知，在5～35 ℃范圍內(nèi)，水解度與多肽含量隨著溫度的升高而逐漸升高，當溫度為45 ℃時，水解度達到最大，溫度在35～55 ℃時，多肽含量較高且穩(wěn)定.

圖3　酶解溫度對酶解效果的影響

2.2.4pH對酶解效果的影響

稱取樣品2g，100 ℃滅酶后冷卻，以酶濃度20U/g、溫度25 ℃、料液比1∶5為固定條件，分別在pH為自然(7.3)、4、5、6、7、8、9的條件下酶解2h，研究不同pH環(huán)境對酶解效果的影響.由圖4可以看出，隨著初始pH值的增加，水解度和多肽含量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在自然pH時達到最大.

圖4　pH對酶解效果的影響

2.2.5料液比對酶解效果的影響

稱取樣品2g，100 ℃滅酶后冷卻，以酶濃度20U/g、溫度25 ℃、自然pH為固定條件，分別在料液比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7、1∶10的條件下酶解2h，探討不同料液比對酶解效果的影響.圖5表明，隨著料液比的增大，對酶解效果影響不大，慮到能源以及經(jīng)濟等因素，選擇1∶5的料液比作為酶解條件的最優(yōu)料液比.

圖5　料液比對酶解效果的影響

2.3響應面試驗結果與分析

綜合單因素試驗結果，選擇酶濃度、溫度、時間對酶解效果有顯著影響的因素，進行Box-Behnken-Design響應面優(yōu)化設計，如表2，并獲得試驗結果如表3.采用Design-Expert對試驗結果進行方差分析(ANOVA)，利用Design-Expert8.0.6軟件對表3的結果進行多元回歸擬合分析，得到響應的回歸方程為：

水解度=-6.456 15+0.867 48A+4.359 39B+0.237 72C+ 0.004 926 81AB-0.004 347 9AC+0.148 99BC-0.017 562A2-1.550 66B2-0.005 880 44C2，R2=0.978 1.

多肽含量=-4.155 73+0.071 886A+0.938 93B+0.152 36C +0.006 761AB -0.001 375AC-0.005 998 7BC-0.001 302A2-0.124 28B2-0.001 418 5C2，R2=0.9915.

方差分析結果(見表4)表明，以水解度為指標，模型P值小于0.000 1，表明該模型高度顯著，而模型的失擬性P值為0.4178>0.05，而以多肽含量為指標，模型P值小于0.000 1，表明該模型高度顯著，而模型的失擬性P值為0.1163>0.05，說明模型與實際情況擬合情況良好，可以使用該模型對實際試驗進行預測和分析.影響酶解液中水解度的因素順序為：溫度C>時間B>酶濃度A；酶濃度、時間、溫度對酶解液中多肽濃度的都較大，其中A、C的交互作用最為明顯.

表2　響應面因素水平表

表3　響應面分析方案及試驗結果

表4　方差分析1)

1) 當P<0.01時高度顯著，標記為**，當0.010.05時不顯著，標記為-

由圖6可看出酶濃度、酶解時間、酶解溫度三者之間的交互關系.其中時間與酶濃度、酶濃度與溫度之間的交互關系不是特別顯著，表現(xiàn)為曲面較平緩，時間與溫度的交互關系比較顯著，表現(xiàn)為曲面較陡.當酶濃度小于16.87U/g，水解度隨著酶濃度的升高而增大，隨著酶濃度繼續(xù)增加，水解度幾乎不發(fā)生變化.當溫度固定時，時間對水解度的影響比較顯著，呈先升后降的趨勢，當溫度固定在41.9 ℃時，3.3h時水解度達到最大值.

圖6　各因素對酶解羅非魚下腳料水解度的影響

Fig.6InfluenceofdifferentfactorsonthedegreeofhydrolysisofTilapiawaste

圖7可看出酶濃度、溫度、時間三者之間的交互關系.其中時間與酶濃度、酶濃度與溫度、時間與溫度的交互關系都比較顯著，表現(xiàn)為曲面較陡，其中酶濃度與溫度的交互關系最為顯著，這與表4中各因素交互的P值相對應(PAB=0.001 3，PAC<0.000 1，PBC=0.002 6).在AB的交互作用中，多肽濃度隨著酶濃度的升高而增大，隨著酶濃度繼續(xù)增加，多肽濃度幾乎不發(fā)生變化.在AC的交互作用中，當酶濃度固定時，溫度對水解度的影響比較顯著，呈先升后降的趨勢.在BC的交互作用中，酶濃度固定時，在一定的溫度范圍內(nèi)，溫度和時間的變化對多肽濃度的影響不是特別顯著.

3　結論

由回歸方程預測因素水平內(nèi)的最佳酶解工藝為：酶濃度16.87U/g(即0.553mg/g)，料液比1∶5、自然pH、溫度41.94 ℃、酶解3.31h.在此酶解條件下進行驗證實驗，水解度為18.09%，多肽含量為0.9mg/mL，證明此模型是可靠有效的.

圖7　各因素對酶解羅非魚下腳料多肽含量的影響

Fig.7InfluenceofdifferentfactorsonthepeptidecontentofTilapiawaste

采用彈性蛋白酶對羅非魚加工下腳料進行酶解，可以制備富含多肽的酶解液.研究結果對羅非魚加工下腳料的開發(fā)利用有一定的參考價值.

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Optimization of Enzymolysis of Tilapia Waste with Response Surface Methodology by Elastase

Qu Ye-hui1, Ding Li-jun1, Peng Wen-yuan1, Liu Shan-shan1, Huang Jin2, Cheng Xiao-ling1

(1.School of Chemical Engineering and Light Industry; 2. School of Materials and Energy,GuangdongUniversityofTechnology,Guangzhou510006,China)

Thehead,bones,andotherrawwasteofTilapiaarehydrolyzedbyelastase,andresponsesurfaceanalysismethodisusedtooptimizetheenzymaticprocesses.Theenzymeconcentration,temperature,pH,solidtoliquidratio,timeandotherfactorsarediscussedtoanalyzetheeffectofhydrolysisbasedonthedegreeofhydrolysisandpeptidecontent.Theresultsshowthattheoptimumconditionsofelastasehydrolysis:enzymeconcentration0.553mg/g,temperature41.94 ℃,time3.31h,pHnatural,solid-liquidratio1∶5,thedegreeofhydrolysisandthepeptidecontentisseparately18.09%and0.90mg/mlinthiscondition.

Tilapiawaste;responsesurfacemethodology;elastase；hydrolysis;peptide

2015- 10- 20

廣東省教育部產(chǎn)學研合作重大專項(2013A090100009).

瞿葉輝(1990-)，女，碩士研究生，主要研究方向為食品加工.

丁利君(1965-)，女，教授，主要研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與天然產(chǎn)物化學.E-mail:ddddlj@foxmail.com

10.3969/j.issn.1007- 7162.2016.05.014

TS254.9

A

1007-7162(2016)05- 0077- 06