食品中鎘離子膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

王亞楠，王曉斐，牛琳琳，雷　壯，張海棠，王自良，*

（1.河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南科技學(xué)院新科學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

食品中鎘離子膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

王亞楠1，王曉斐2，牛琳琳1，雷壯1，張海棠1，王自良1，*

（1.河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南科技學(xué)院新科學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

目的：建立更加靈敏、特異的食品鎘離子膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法。方法：用1-（4-異硫氰芐基）乙烯基二胺-N，N，N’，N’-四乙酸（1-（4-isothiocyanobenzyl）ethylenediamine-N，N，N’，N’-tetraacetic acid，iEDTA）鰲合鎘離子合成Cd2+-iEDTA半抗原，異硫氰酯法制備免疫原Cd2+-iEDTA-牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）和包被原Cd2+-iEDTA-雞卵清蛋白（ovalbumin，OVA），電感耦合等離子體發(fā)射光譜法和聚丙烯酰胺凝膠法進(jìn)行鑒定；用Cd2+-iEDTA-BSA免疫Balb/C小鼠，細(xì)胞融合技術(shù)篩選Cd2+-EDTA單克隆抗體（mAb）雜交瘤細(xì)胞株，體內(nèi)誘生腹水法制備Cd2+-EDTA mAb；應(yīng)用Cd2+-EDTA mAb建立Cd2+殘留膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法（Cd2+-Strip），并測(cè)定其性能。結(jié)果：免疫原偶聯(lián)成功，Cd2+-iEDTA-BSA中BSA與Cd2+的含量分別為7.1 mg/mL和191.7 μg/mL；篩選出1A3C11、2B7D8、2E10G9、4F3E7共4 株雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)9 次傳代分泌抗體穩(wěn)定，親和力最高的2E10G9株親和常數(shù)（Ka）為7.58×108L/mol，對(duì)Cd2+-iEDTA的半數(shù)抑制濃度為16.3 μg/L，與Hg2+-EDTA的交叉反應(yīng)（cross-reaction，CR）率為18.6%，與其他重金屬離子無(wú)CR；Cd2+-Strip的檢測(cè)時(shí)間為10 min，檢出限為5 μg/L，其檢測(cè)結(jié)果與競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒（Cd2+ELISA-Kit）、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法符合率為100%。結(jié)論：制備出了親和力高、特異性強(qiáng)的Cd2+mAb，建立了靈敏、特異、快速、簡(jiǎn)便的食品鎘離子膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法。

鎘離子；免疫原；單克隆抗體；膠體金免疫層析；快速檢測(cè)

重金屬污染殘留給生態(tài)環(huán)境、食品安全和人類(lèi)健康帶來(lái)了嚴(yán)重危害，2012年發(fā)生在廣西的龍江河鎘污染事件［1］和2013年發(fā)生在湖南的大米鎘超標(biāo)事件［2］，再次引發(fā)政府和社會(huì)對(duì)鎘污染的廣泛關(guān)注。鎘離子（Cd2+）對(duì)人體具有腎臟［3］、肝臟［4］、心血管［5］、神經(jīng)［6］、致癌［7］等多種毒性作用［8］，已成為環(huán)境與食品污染的主要公害之一［9］，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織將Cd2+列為第3位食品安全重點(diǎn)監(jiān)控污染物［10］，GB 2762—2005《食品中污染物限量》規(guī)定Cd2+最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，大米不大于200 μg/kg，面粉、雜糧及肉類(lèi)不大于100 μg/kg，水果、鮮蛋不大于50 μg/kg。隨著檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，目前已建立的檢測(cè)方法主要有火焰原子吸收法［11］、石墨爐原子吸收法［12］、電感耦合等離子體發(fā)射光譜（inductively coupled plasma-atomic emission spectroscopy，ICP-AES）法［13］、電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICPMS）法［14］等，但由于設(shè)備、技術(shù)、場(chǎng)地、成本等方面的制約，其應(yīng)用受到了限制。膠體金免疫層析（gold immunochromatography assay，GICA）技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展成熟的一項(xiàng)新興檢測(cè)技術(shù)，在食品安全快速檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用，適用于大量樣品篩檢及進(jìn)出口通關(guān)的快速檢測(cè)。國(guó)外Darwish［15］、Kazuhiro［16］等研制出了相關(guān)產(chǎn)品，國(guó)內(nèi)劉艷梅等［17］和本課題組成員張海棠等［18］研究報(bào)道了酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)方法，向軍儉等［19］報(bào)道了GICA檢測(cè)方法，檢出限較高為100 μg/kg，且與Hg2+有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)（cross-reaction，CR）。本研究旨以篩選制備親和力高、特異性強(qiáng)的Cd2+mAb為切入點(diǎn)，建立更加靈敏、特異的食品Cd2+污染殘留GICA檢測(cè)方法。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

Balb/C小鼠 鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院；鼠源NS0骨髓瘤細(xì)胞 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；CdCl2（純度99.9%） 美國(guó)Alfa Aesar公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、雞卵清蛋白（ovalbumin，OVA） 美國(guó)Pierce公司；1-（4-異硫氰芐基）乙烯基二胺-N，N，N’，N’-四乙酸（1-（4-isothiocyanobenzyl）ethylenediamine-N，N，N’，N’-tetraacetic acid，iEDTA）上海同仁化學(xué)研究所；免疫原Cd2+-iEDTA-BSA、包被原Cd2+-iEDTA-OVA、兔抗鼠二抗（rabit anti mouse immunoglobulin G，RaMIgG）、Cd2+檢測(cè)競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒（Cd2+ELISA-Kit） 本課題組制備；弗氏完全佐劑（complete freund’s adjuvant，CFA）、弗氏不完全佐劑（incomplete freund’s adjuvant，IFA） 美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640、HAT、HT、PEG-2000美國(guó)Gibco公司；氯金酸（HAuCl4·3H2O）、檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7·2H2O） 美國(guó)Pierce公司；硝酸纖維素膜（nitrocellulose filter membrane，NC）、玻璃纖維棉、樣品墊 美國(guó)Millipore公司；其他試劑為分析級(jí)；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2儀器與設(shè)備

DU800型紫外掃描儀 德國(guó)Beckman公司；Optima 2100DV型ICP-AES儀 美國(guó)PE公司；Multiskan MK3酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司；H-600透射電鏡 日本Hitachi公司；JY-3000型電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；X-only單向噴點(diǎn)儀、CM4000切槽儀 美國(guó)Biodot公司。

1.3方法

1.3.1免疫原合成

圖1　免疫原合成路線Fig.1　Synthesis scheme of immunogen Cd2+-iEDTA-BSA

參照Kuang等［20］所述的異硫氰酯法加以改進(jìn)合成免疫抗原Cd2+-iEDTA-BSA，如圖1所示。

1.3.2免疫原鑒定

載體蛋白與Cd2+含量測(cè)定：紫外掃描儀在波長(zhǎng)278 nm處測(cè)定免疫原中BSA的濃度；ICP-AES測(cè)定Cd2+含量。

聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法鑒定：選擇5%濃縮膠，10%分離膠，濃縮膠電壓60 V，分離膠電壓90 V，考馬斯亮藍(lán)染色，水煮快速脫色。

1.3.3Cd2+-EDTA mAb制備與特性分析

1.3.3.1Cd2+-EDTA mAb制備

選擇細(xì)胞融合小鼠：用Cd2+-iEDTA-BSA按正常程序免疫5 周齡雌性Balb/C小鼠5 只，免疫5 次，時(shí)間間隔4 周，最后1 次免疫后第21天斷尾采血分離血清，間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定其效價(jià)與靈敏性，選擇效價(jià)高且靈敏性好的小鼠用于細(xì)胞融合。

細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞株的篩選：按常規(guī)方法將免疫脾細(xì)胞與NS0瘤細(xì)胞以1∶10比例混合，在500 mL/L PEG-1500作用下進(jìn)行融合、篩選和克隆化，待確定雜交瘤細(xì)胞已單克隆化，用間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA進(jìn)行陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞篩選，建立細(xì)胞株，凍存于液氮備用。

Cd2+-EDTA mAb制備：體內(nèi)誘生腹水法制備Cd2+-EDTA mAb，選擇經(jīng)產(chǎn)雌性Balb/C小鼠5 只，腹腔注射IFA 1 mL，12 d后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞1×106個(gè)/只，10 d后待小鼠腹部明顯膨大即可收集腹水，飽和硫酸鹽法進(jìn)行純化。

1.3.3.2Cd2+mAb特性分析

穩(wěn)定性分析：將篩選出的3 株雜交瘤細(xì)胞分別于1、10、20、30、40、50、60、90、120 d和150 d復(fù)蘇、傳代、制備腹水Cd2+-EDTA mAb，間接ELISA測(cè)定腹水抗體效價(jià)以確定雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的穩(wěn)定性。

親和性分析：按照Nam等［21］所述Batty飽和法測(cè)定親和常數(shù)（Ka），按公式（1）計(jì)算：

式中：Ka為親和常數(shù)/（L/mol）；n為每組中2 個(gè)包被抗原濃度的稀釋倍數(shù)；［Ab’］ t和［Ab］t分別為每組中2 個(gè)50% Amax所對(duì)應(yīng)的抗體濃度，其中Ab’和Ab為抗體濃度/（mol/L）；t為反應(yīng)溫度/℃。

靈敏性分析：間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定Cd2+-EDTA mAb對(duì)Cd2+-EDTA的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50），確定其靈敏性。

特異性分析：間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定Cd2+-EDTA mAb對(duì)Pb2+、Hg2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+、Ni2+、Fe3+、Cr3+、Al3+等金屬離子與EDTA的螯合物及EDTA的CR，按照公式（2）計(jì)算CR率。

1.3.4Cd2+-Strip方法建立及性能測(cè)定

1.3.4.1Cd2+-Strip方法建立

膠體金的制備與鑒定：參照Daesub等［22］所述的檸檬酸鈉還原法制備膠體金，用紫外掃描及透射電鏡掃描，通過(guò)觀察其顏色及粒徑大小進(jìn)行鑒定。

金標(biāo)抗體的制備及單抗最佳用量的確定：采用Mey氏系列穩(wěn)定法［23］制備金標(biāo)抗體，取酶標(biāo)板9 孔，每孔100 μL雙蒸水鋪底；第1孔加入質(zhì)量濃度為1 mg/mL的Cd2+-EDTA mAb 100 μL，之后進(jìn)行倍比至第8、9孔為空白對(duì)照（BC）；每孔加入25 μL pH 8.5的膠體金溶液，室溫反應(yīng)10 min，加入100 g/L NaCl溶液100 μL，室溫反應(yīng)10 min，觀察顯色情況。對(duì)照孔與Cd2+-EDTA mAb量不足以穩(wěn)定金溶膠的各孔呈現(xiàn)由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象，而Cd2+-EDTA mAb量達(dá)到或超過(guò)最低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變，選擇其中含Cd2+-EDTA mAb量最低的紅色孔即為1 mL膠體金所需的Cd2+-EDTA mAb的量，在此基礎(chǔ)上增加10%即為待標(biāo)Cd2+-EDTA mAb的最佳用量。

金標(biāo)抗體玻璃纖維棉的制備：用1%的BSA含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）浸泡玻璃纖維棉，晾干，將金標(biāo)抗體用X-only單向噴點(diǎn)儀均勻噴灑于玻璃纖維棉上。

NC膜的制備：X-only單向噴點(diǎn)儀將質(zhì)量濃度為1 mg/mL的免疫原Cd2+-iEDTA-BSA和質(zhì)量濃度為1 mg/mL的RaMIgG點(diǎn)射于NC膜中央，形成間距0.5 cm的檢測(cè)線（T線）和質(zhì)控線（C線），自然干燥，密封，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

免疫層析條件的優(yōu)化：檢測(cè)線（T線）Cd2+-iEDTABSA最佳工作質(zhì)量濃度的確定，分別將Cd2+-iEDTA-BSA稀釋為0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mg/mL系列質(zhì)量濃度，在NC膜上劃線，與同質(zhì)量濃度金標(biāo)抗體組裝成試紙條，添加100 μL雙蒸水進(jìn)行檢測(cè)，比較T線隨質(zhì)量濃度變化試紙條的顯色情況和穩(wěn)定性；質(zhì)控線（C線）RaMIgG最佳工作質(zhì)量濃度的確定，同樣按上述方法進(jìn)行。

試紙的組裝：在支持板上首先黏貼上NC膜和吸水紙，此后依次黏貼上金標(biāo)墊和樣品墊，之后用切條機(jī)裁割，最后干燥、封閉，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

Cd2+-EDTA標(biāo)準(zhǔn)品制備與待測(cè)樣品預(yù)處理：由于所制備的Cd2+-EDTA mAb是針對(duì)鎘離子螯合物（Cd2+-EDTA）的，取等體積的Cd2+標(biāo)準(zhǔn)品溶液（1 000 μg/L）與EDTA（1 mol/L）混合，靜置10 min，使Cd2+螯合充分，之后用PBS稀釋成所需質(zhì)量濃度；液體樣品如水樣、尿樣、血液樣、牛奶樣等，在液體樣品中加入體積分?jǐn)?shù)10%物質(zhì)的量濃度為0.1 mol/L的EDTA鰲合劑，混合反應(yīng)30 min，使Cd2+與EDTA充分鰲合，5 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行檢測(cè)；固體樣品如土壤樣、飼料樣、組織樣等，稱(chēng)取固體樣品1.0 g于50 mL容量瓶?jī)?nèi)，加入1 mL水浸潤(rùn)后加入混酸溶液6 mL（3 mL濃磷酸和3 mL濃硫酸），加熱至冒白煙，冷卻后加入0.5 mL濃硝酸，繼續(xù)加熱至固體樣品變白色、消解液呈黃綠色，用水沖洗，全部轉(zhuǎn)移入50 mL離心管內(nèi)，5 000 r/min離心10 min，將上清液移入50 mL容量瓶中，加入10 mL濃度為0.1 mol/L的EDTA鰲合劑溶液，混合反應(yīng)30 min，定容至50 mL，5 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4.2Cd2+-Strip性能測(cè)定

靈敏性：用PBS配制1 000 μg/L的Cd2+溶液與1 mol/L的EDTA等體積混合，得到質(zhì)量濃度為500 μg/L的Cd2+-EDTA溶液，用PBS稀釋?zhuān)渲平K質(zhì)量濃度分別為160.0、80.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.0 μg/L和0 μg/L的Cd2+-EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于Cd2+-Strip測(cè)定，根據(jù)測(cè)定結(jié)果判斷其靈敏性。實(shí)際檢測(cè)時(shí)，將樣品加到Cd2+-Strip樣本墊上，室溫反應(yīng)10 min，觀察顯色結(jié)果。結(jié)果判定方法：T、C線均顯示紅色，樣品呈陰性；T線不顯示紅色、C線顯示紅色，則呈陽(yáng)性；T、C線均不顯示紅色，則表面檢測(cè)卡失效。

穩(wěn)定性：取不同批次的6 批Cd2+-Strip，分別在6 d對(duì)Cd2+-EDTA質(zhì)量濃度為1.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的水樣、面粉樣、豬肉樣進(jìn)行檢測(cè)，檢驗(yàn)其穩(wěn)定性。

特異性：用PBS分別配制質(zhì)量濃度為1 000 μg/L的Pb2+、Hg2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+、Ni2+、Fe3+、Cr3+、Al3+標(biāo)準(zhǔn)品溶液，與1 mol/L的EDTA等體積混合，用PBS分別稀釋至0、100、200、400、800、1 600 μg/L，用Cd2+-Strip進(jìn)行測(cè)試，10 min后觀察顯色情況。

實(shí)際應(yīng)用與復(fù)核實(shí)驗(yàn)：課題組分別從河南省新鄉(xiāng)市、焦作市、安陽(yáng)市采集水樣98 份、面粉樣36 份、豬肉樣16 份，用Cd2+-Strip、Cd2+ELISA-Kit和ICP-AES進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定其準(zhǔn)確率。

2　結(jié)果與分析

2.1免疫原鑒定

2.1.1BSA與Cd2+含量測(cè)定

紫外掃描儀于波長(zhǎng)278 nm處測(cè)定Cd2+-iEDTA-BSA中BSA的質(zhì)量濃度為7.1 mg/mL；ICP-AES測(cè)定其Cd2+含量為191.7 μg/mL，結(jié)果說(shuō)明成功制備了免疫原。

2.1.2SDS-PAGE鑒定

圖2　Cd2+-iEDTA-BSA的SDS-PAGE凝膠電泳圖Fig.2　SDS-PAGE electrophoresis of Cd2+-iEDTA-BSA

如圖2所示，Marker、BSA與Cd2+-iEDTA-BSA的電泳條帶清晰，且BSA遷移距離明顯大于免疫原Cd2+-iEDTA-BSA，說(shuō)明Cd2+-iEDTA-BSA的分子質(zhì)量大于BSA，證明成功制備了免疫原。

2.2Cd2+mAb制備

2.2.1細(xì)胞融合小鼠選擇

圖3　抗Cd的靈敏性測(cè)定（B）Fig.3　Titer （A） and sensitivity measurement （B） of anti-Cd2+pAb against Cd2+in serum2+多抗血清效價(jià)測(cè)定（A）、對(duì)Cd2+

如圖3所示，5只免疫小鼠血清多克隆抗體（pAb）效價(jià)均達(dá)到了1∶（1×104），且4號(hào)小鼠效價(jià)最高達(dá)到了1∶（5.12×104），靈敏性也最好，IC50為26.7 μg/L，選用4號(hào)小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。

2.2.2雜交瘤細(xì)胞株的建立

融合細(xì)胞經(jīng)3 次克隆化后陽(yáng)性率達(dá)100%，間接ELISA分別測(cè)定其IC50，篩選出4 株雜交瘤，分別命名為1A3C11、2B7D8、2E10G9、4F3E7。

2.3Cd2+mAb特性分析

2.3.1穩(wěn)定性分析

圖4　細(xì)胞傳代腹水抗體效價(jià)變化Fig.4　The indirect ELISA titer of mAb secreted by hybridomas continually in ascites

如圖4所示，經(jīng)10 次凍存及復(fù)蘇，9 次傳代，雜交瘤分泌抗體穩(wěn)定，腹水抗體效價(jià)均達(dá)到了105以上。

2.3.2親和性分析

圖5　親和力測(cè)定Fig.5　Affinity measurement of anti-Cd2+-EDTA mAb

如圖5所示，1A3C11、2B7D8、2E10G9、4F3E7的Ka分別為1.01×108、1.29×107、7.58×108、1.87×108L/mol，均為高親和力抗體［24］，其中2E10G9的親和力最高。

2.3.3靈敏性分析

圖6　靈敏性測(cè)定Fig.6　Sensitivity measurement of anti-Cd2+-EDTA mAb

如圖6所示，抑制曲線的回歸方程為y=-39.991x+ 98.476，由此可計(jì)算出親和力最高的2E10G9株所產(chǎn)生的Cd2+-EDTA mAb對(duì)Cd2+-EDTA的IC50為16.6 μg/L，為高靈敏性抗體。

2.3.4特異性分析

表1　Cd2+-EDTA mAb CR率測(cè)定Table1　Cross-reactivity measurement of anti-Cd2+-EDTA mAb

如表1所示，Cd2+-EDTA mAb對(duì)Cd2+-EDTA的IC50為16.3 μg/L，對(duì)Hg2+-EDTA的IC50為87.63 μg/L，CR率為18.6%，對(duì)EDTA與其他類(lèi)似化合物CR率均小于0.9%，對(duì)Cd2+-EDTA的檢測(cè)基本不存在干擾現(xiàn)象。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)制備的Cd2+-EDTA mAb可特異性識(shí)別結(jié)合Cd2+-EDTA。

2.4膠體金質(zhì)量鑒定

2.4.1紫外掃描鑒定

圖7　膠體金紫外掃描圖Fig.7　Absorption spectrum of colloidal gold

如圖7所示，膠體金的最大吸收峰（λmax）位于523.8 nm，最大吸光度（Amax）為0.984，根據(jù)Zhou等［25］的研究結(jié)果，膠體金粒徑為25 nm。

2.4.2透射電鏡掃描鑒定

圖8　膠體金電鏡掃描結(jié)果Fig.8　Scanning electron microscopic observation of colloidal gold

如圖8所示，所制備的膠體金在透射電鏡下分布均勻，形狀規(guī)則，隨機(jī)測(cè)量100 個(gè)顆粒，粒徑在（25±1.0）nm，與紫外掃描結(jié)果基本一致。

2.5金標(biāo)抗體單抗最佳用量的確定

如表2所示，Cd2+-EDTA mAb與膠體金標(biāo)記的適宜質(zhì)量濃度為6.25 μg/mL，在此基礎(chǔ)上增加10%，Cd2+-EDTA mAb最佳標(biāo)記質(zhì)量濃度為7.0 μg/mL膠體金。

2.6Cd2+-Strip性能測(cè)定

2.6.1靈敏性測(cè)定

表3　Cd2+-Strip靈敏度測(cè)定（n=6）Table3　Sensitivity of Cd2+-Strip （n= 6）

由表3可知，Cd2+-Strip的檢出限為5 μg/L。

2.6.2穩(wěn)定性測(cè)定

表4　Cd-Strip穩(wěn)定性測(cè)定（n=6）Table4　Stability measurement of Cd2+-Strip （n= 6）

如表4所示，不同批次的6 批Cd2+-Strip對(duì)水樣、面粉樣、豬肉樣進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果完全一致，說(shuō)明Cd2+-Strip的穩(wěn)定性和重復(fù)性好。

2.6.3特異性測(cè)定

用Cd2+-Strip測(cè)定不同金屬離子與EDTA螯合物反應(yīng)情況，結(jié)果表明，除與Hg2+在質(zhì)量濃度達(dá)到400 μg/L時(shí)有輕微CR外，與其他化合物無(wú)CR。

2.6.4符合性測(cè)定

如表5所示，發(fā)現(xiàn)98 份水樣中陽(yáng)性1 份，36 份面粉樣中陽(yáng)性3 份，16 份豬肉樣中陽(yáng)性1 份，3 種檢測(cè)方法結(jié)果完全一致；6 份陽(yáng)性樣品用Cd2+-Strip半定量測(cè)定，用Cd2+ELISA-Kit和ICP-AES定量測(cè)定，Cd2+-Strip與Cd2+ELISA-Kit、ICP-AES的靈敏性相當(dāng)，符合率為100%。

表5　Cd2+-Strip與Cd2+ELISA-Kit和ICP-AES檢出實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較Table5　Results of parallel test of Cd2+-Strip and ELISA-kit

3　討 論

3.1關(guān)于Cd2+mAb的質(zhì)量性能

靈敏性是由抗體與其對(duì)應(yīng)抗原反應(yīng)的親和力大小所決定的，實(shí)驗(yàn)所用2E10G9株雜交瘤細(xì)胞所分泌Cd2+-EDTA mAb的Ka為7.58×108L/mol，為高親和力抗體。特異性是由抗體分子超變區(qū)空間結(jié)構(gòu)與抗原決定簇之間的互補(bǔ)性決定的，本研究用iEDTA螯合Cd2+制備免疫原Cd2+-iEDTA-BSA，通過(guò)改變離子半徑、空間構(gòu)象來(lái)提高抗體特異性，用CR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定，Cd2+直徑為0.203 nm，與Hg2+的直徑僅相差0.035 nm，Cd2+-EDTA與Hg2+-EDTA的空間結(jié)構(gòu)相差小于0.02 nm，因此Cd2+-EDTA與Hg2+-EDTA三維結(jié)構(gòu)相似，因而兩者具有輕微的CR，此結(jié)果與Sreepriya［24］、Jones［26］等研究結(jié)果一致。

3.2關(guān)于Cd2+-Strip的質(zhì)量性能

本研究采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金，并采用紫外掃描、透射電鏡掃描進(jìn)行鑒定，粒徑為25 nm，形狀規(guī)則，分布均勻，物理吸附抗體能力強(qiáng)，減少了非特異性反應(yīng)。采用Mey氏系列穩(wěn)定法標(biāo)記抗體，篩選確定了最適標(biāo)記濃度，提高了抗體反應(yīng)的穩(wěn)定性。NC膜上的T線和C線是抗原抗體反應(yīng)的所在部位，其孔徑規(guī)格、黏附抗原抗體蛋白質(zhì)能力及檢測(cè)樣品在NC膜上的遷移速率影響試紙質(zhì)量，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)，本研究選擇帶有背襯的AE180NC膜用于黏附Cd2+-iEDTA-BSA和RaMIgG，提高了反應(yīng)的特異性，顯色結(jié)果明顯。

4　結(jié) 論

本研究采用分子交聯(lián)技術(shù)成功合成Cd2+免疫原CdiEDTA-BSA，應(yīng)用細(xì)胞融合技術(shù)研制出高效價(jià)、高親和力、特異性強(qiáng)的Cd2+mAb，采用膠體金標(biāo)記抗體模式，成功建立了食品Cd2+污染殘留膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法，Cd2+-Strip具有快速（10 min）、靈敏（5 μg/L）、特異（除與Hg2+的CR率為18.6%，與其他重金屬離子無(wú)CR）、簡(jiǎn)便（不需要任何儀器與附加試劑）的優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的市場(chǎng)前景和應(yīng)用價(jià)值。

［1］ 曾文偉， 石柱. “鎘米”認(rèn)知與區(qū)域優(yōu)質(zhì)稻產(chǎn)業(yè)發(fā)展對(duì)策［J］. 作物研究， 2015， 29（2）: 185-187. DOI:10.3969/j.issn.1001-5280.2015.02.18.

［2］ 董璟琦， 張紅振， 王金南， 等. 龍江河突發(fā)環(huán)境事件河流鎘污染化學(xué)形態(tài)模擬［J］. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)， 2015， 35（10）: 3046-3052. DOI:10.3969/ j.issn.1000-6923.2015.10.023.

［3］ MARIA W， GERD S， THOMAS L， et al. Low-level cadmium exposure and effects on kidney function［J］. Journal of Occupational and Environmental Medicine， 2014， 71（12）: 848-854. DOI:10.1136/ oemed-2014-102279.

［4］ OMAR H， MICHAEL C， DAVID C， et al. Cadmium exposure and liver disease among US adults［J］. Journal of Gastrointestinal Surgery，2013， 17（7）: 1265-1273. DOI:10.1007/s11605-013-2210-9.

［5］ JUNENETTE L P， TODD S P， MELISSA J P， et al. Cadmium exposure in association with history of stroke and heart failure［J］. Environmental Research， 2010， 110（2）: 199-206. DOI:10.1016/ j.envres.2009.12.004.

［6］ LINDSEY A C， ANDREW H M， DANIEL J T， et al. Functional rehabilitation of cadmium-induced neurotoxicity despite persistent peripheral pathophysiology in the olfactory system［J］. Toxicological Science， 2012， 126（2）: 534-544. DOI:10.1093/toxsci/kfs030.

［7］ ANTHONY S， JENHIFER N S， CLEMENT G Y， et al. Cadmium chloride induces DNA damage and apoptosis of human liver carcinoma cells via oxidative stress［J］. International Journal of Environmental Research and Public Health， 2016， 13（1）: 88. DOI:10.3390/ ijerph13010088.

［8］ MONISHA J， TENZIN T， NARESH A， et al. Toxicity， mechanism and health effects of some heavy metals［J］. Interdisciplinary Toxicology，2014， 7（2）: 60-72. DOI:10.2478/intox-2014-0009.

［9］ LIU Y Z， XIAO T F， PHILIPPE C B， et al. Potential health risk in areas with high naturally-occurring cadmium background in southwestern China［J］. Ecotoxicology and Environmental Safety， 2015， 112（2）: 122-131. DOI:10.1016/j.ecoenv.2014.10.022.

［10］ ANATOLY N V， BORIS A K， VLADIMIR G P， et al. Some considerations concerning the theory of combined toxicity: a case study of subchronic experimental intoxication with cadmium and lead［J］. Food and Chemical Toxicology， 2014， 64（2）: 144-156. DOI:10.1016/j.fct.2013.11.024.

［11］ 晉海軍， 徐銘鍵， 陳惠， 等. 火焰原子吸收法檢測(cè)籽粒莧根中鎘含量影響因素的響應(yīng)面優(yōu)化［J］. 分子植物育種， 2015， 24（9）: 2100-2108. DOI:10.13271/j.mpb.013.002100.

［12］ 傅亞平， 吳衛(wèi)國(guó). 濕法消解-石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定大米中的鎘［J］. 糧食與油脂， 2015， 28（10）: 59-62. DOI:10.3969/ j.issn.1008-9578.2015.10.016.

［13］ 劉璐， 楊祎， 曹慶芹， 等. 用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法檢測(cè)北方主栽板栗品種（系）礦質(zhì)元素含量［J］. 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2015， 30（1）: 4-9. DOI:10.13473/j.cnki.issn.1002-3186.2014.111.

［14］ 高振杰， 高紅霞， 劉英莉， 等. ICP-MS法測(cè)定5 種中藥材粉劑中5 種重金屬的含量［J］. 中國(guó)藥房， 2015， 26（27）: 3847-3849. DOI:10.6039/ j.issn.1001-0408.2015.27.37.

［15］ DARWISH I A， BLAKE D A. Development and validation of a onestep immunoassay for determination of cadmium in human serum［J］. Analytical Chemistry， 2002， 74（1）: 52-58. DOI:10.1021/ac010510r.

［16］ KAZUHIRO S， NUNNARPAS Y. Cadmium purification and quantification using immunochromatography［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2009， 57（11）: 4514-4519. DOI:10.1021/jf900155t.

［17］ 劉艷梅， 鐘輝， 黃建芳， 等. 直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)大米樣品中的重金屬鎘［J］. 免疫學(xué)雜志， 2015， 31（6）: 528-532. DOI:10.13431/j.cnki. immunol.j.20150112.

［18］ 張海棠， 王申峰， 姜金慶， 等. 鎘離子單克隆抗體的制備及其阻斷ELISA檢測(cè)方法的建立［J］. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志， 2011， 24（2）: 208-212. DOI:10.13200/j.cjb.2011.02.90.zhanght.016.

［19］ 向軍儉， 陳耀強(qiáng)， 唐勇， 等. 膠體金免疫層析法快速檢測(cè)水樣品中的鎘離子［J］. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志， 2010， 23（5）: 529-532. DOI:10.13200/j.cjb.2010.05.87.xiangjj.011.

［20］ KUANG H， XING C R， HAO C L， et al. Rapid and highly sensitive detection of lead ions in drinking water based on a strip immunosensor［J］. Sensors， 2013， 13（4）: 4214-4224. DOI:10.3390/ s130404214.

［21］ NAM G K， MYEONG A K， YOUNG I P， et al. Magnetic nanoparticle based purification and enzyme-linked immunosorbent assay using monoclonal antibody against enrofloxacin［J］. Journal of Veterinary Science， 2015， 16（4）: 431-437. DOI:10.4142/jvs.2015.16.4.431.

［22］ DAESUB S， GUNWOO H， WISSAM S， et al. Development and validation of a rapid immunochromatographic assay for detection of middle east respiratory syndrome coronavirus antigen in dromedary camels［J］. Journal of Clinical Microbiology， 2015， 53（4）: 1178-1182. DOI:10.1128/JCM.03096-14.

［23］ LIU X， XIANG J J， TANG Y， et al. Colloidal gold nanoparticle probe-based immunochromatographic assay for the rapid detection of chromium ions in water and serum samples［J］. Analytica Chimica Acta， 2012， 745: 99-105. DOI:10.1016/j.aca.2012.06.029.

［24］ SREEPRIYA V， SHANTELL K， THOMAS T， et al. Detection of Cd （Ⅱ） using antibody-modified microcantilever sensors［J］. Ultramicroscopy， 2007， 107（12）: 1123-1128. DOI:10.1016/ j.ultramic.2007.01.011.

［25］ ZHOU C N， ZHANG X Y， HUANG X X， et al. Rapid detection of chloramphenicol residues in aquatic products using colloidal gold immunochromatographic assay［J］. Sensors， 2014， 14（11）: 21872-21888. DOI:10.3390/s141121872.

［26］ JONES R M， YU H， DELEHANTY J B， et al. Monoclonal antibodies that recognize minimal differences in the three-dimensional structures of metal-chelate complexes［J］. Bioconjugate Chemistry， 2002， 13（3）: 408-415. DOI:10.1021/bc0155418.

Establishment and Preliminary Application of Colloidal Gold Immunochromatography for Detecting Heavy Metal Cadmium Ion in Foods

WANG Yanan1， WANG Xiaofei2， NIU Linlin1， LEI Zhuang1， ZHANG Haitang1， WANG Ziliang1，*
（1. College of Animal Science and Veterinary Medicine， Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003， China；2. Xinke College， Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003， China）

Objective: To establish a colloidal gold immunochromatographic assay （Cd2+-Strip） for detecting Cd2+residues in foods. Methods: Artificial hapten Cd2+-iEDTA was synthesized by using isotrhiocyanobenzyl-EDTA （iEDTA） to chelate Cd2+. The isothiocyanate method was used to conjugate Cd2+-iEDTA to BSA to obtain the artificial immunogen Cd2+-iEDTA-BSA. The coating antigen Cd2+-iEDTA-OVA was obtained in the same way. Both ICP-AES and SDS-PAGE were used to identify Cd2+-iEDTA-BSA. Balb/C mice were immunized with Cd2+-iEDTA-BSA and hybridoma lines that secreted anti-Cd2+-EDTA monoclonal antibody （mAb） were generated by cell fusion. A Cd2+test strip was established with Cd2+-EDTA mAb and its traits were tested. Results: Cd2+-iEDTA-BSA was synthesized successfully and its concentration of BSA and Cd2+was 7.1 mg/mL and 191.7 μg/mL respectively. Four hybridoma lines， namely 1A3C11， 2B7D8， 2E10G9，4F3E7， were screened out and 2E10G9 was found to be the best one. The dissociation constant （Ka） of 2E10G9 was 7.58 × 108L/mol and its sensitivity （IC50） was 16.3 μg/L， and it had little or no cross-reactivity with other metal ions， except for Hg2+-EDTA with 18.6%. The qualitative detection of Cd2+with the Cd2+test strip could be achieved in 10 minutes， with a limit of detection （LOD） of 5 μg/L. Its sensitivity was the same as that of competitive ELISA-Kit （Cd2+ELISA-Kit） and inductively coupled plasma atomic emission spectrometry （ICP-AES）， and its coincidence rate was 100% as compared with Cd2+ELISA-Kit and ICP-AES. Conclusion: The high affinity and specificity Cd2+-EDTA mAb has successfully beengenerated and used to establish a Cd2+test strip with high sensitivity， specificity， rapidity and briefness. The test strip can be used for the rapid detection of Cd2+residues in foods.

cadmium ion； immunogen； monoclonal antibody； colloidal gold immunochromatographic assay； rapid detection

10.7506/spkx1002-6630-201618025

R392.33

A

1002-6630（2016）18-0152-07

王亞楠， 王曉斐， 牛琳琳， 等. 食品中鎘離子膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（18）: 152-158. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618025. http://www.spkx.net.cn

WANG Yanan， WANG Xiaofei， NIU Linlin， et al. Establishment and preliminary application of colloidal gold immunochromatography for detecting heavy metal cadmium ion in foods［J］. Food Science， 2016， 37（18）: 152-158. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618025. http://www.spkx.net.cn

2016-03-13

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAK10B01；2014BAD13B05）

王亞楠（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩庖邫z測(cè)。E-mail：792176339@qq.com

王自良（1966—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槊庖邔W(xué)與抗體工程。E-mail：wangziliang66@126.com