高效液相色譜法測(cè)定雞蛋中5-乙烯基-1，3-噁唑烷-2-硫酮?dú)埩袅?/h1>
2016-10-18 06:03:29朱麗萍王建萍丁雪梅曾秋鳳白世平宿卓薇張克英
食品科學(xué) 2016年18期
朱麗萍，王建萍，丁雪梅，曾秋鳳，白世平，玄 玥，宿卓薇，張克英*
（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130）
高效液相色譜法測(cè)定雞蛋中5-乙烯基-1，3-噁唑烷-2-硫酮?dú)埩袅?/p>
朱麗萍，王建萍，丁雪梅，曾秋鳳，白世平，玄玥，宿卓薇，張克英*
（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130）
建立一種用于測(cè)定雞蛋粉中5-乙烯基-1，3-噁唑烷-2-硫酮（5-vinyl-1，3-oxazolidine-2-thione，5-VOT）殘留量的高效液相色譜法，并探討5-VOT在雞蛋中的殘留消除情況。選用450 只30 周齡的羅曼粉殼蛋雞，隨機(jī)分為3 組，分別飼喂含0%（對(duì)照組，處理1）、17.64%（處理2）、29.4%（處理3）菜粕的飼糧，飼喂12 周后各組均換飼對(duì)照組的飼糧4 周，實(shí)驗(yàn)期共16 周。實(shí)驗(yàn)采用乙腈提取雞蛋粉中5-VOT，樣品經(jīng)超聲、離心、旋轉(zhuǎn)蒸干處理，用pH 7.0的磷酸鈉緩沖溶液復(fù)溶，下層溶液離心后經(jīng)0.45 μm無機(jī)濾膜過濾上機(jī)。結(jié)果表明，方法平均加標(biāo)回收率在81.28%～103.28%之間，平均回收率、重復(fù)性及精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.75%～5.17%、2.19%、0.82%，可滿足雞蛋中5-VOT殘留量的測(cè)定；雞蛋中5-VOT殘留量隨著蛋雞飼糧中菜粕含量以及蛋雞飼喂菜粕飼糧時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，處理組3菜粨飼喂12 周后5-VOT殘留量高達(dá)1 837.45 ng/g；換飼對(duì)照組飼糧4 周后，雞蛋中未檢出5-VOT。
高效液相色譜法；雞蛋；5-乙烯基-1，3-噁唑烷-2-硫酮
菜粕是十字花科植物油菜籽榨油后的副產(chǎn)物，是重要的蛋白質(zhì)飼料來源之一［1］，菜粕因其含有豐富的蛋白質(zhì)和平衡的氨基酸組成［2］，同時(shí)含有比豆粕更豐富的礦物元素如鈣、磷、鐵、錳、鋅、銅等［3］，被應(yīng)用于畜禽飼糧中［4-6］。然而菜粕中含有大量的抗?fàn)I養(yǎng)因子，主要包括硫葡萄糖苷及其代謝產(chǎn)物，硫葡萄糖苷本身對(duì)動(dòng)物沒有毒性［7］，但其代謝產(chǎn)物如噁唑烷硫酮、硫氰酸鹽、異硫氰酸酯等會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物體肝臟、腎臟、甲狀腺等受損傷、抑制動(dòng)物的生長(zhǎng)［8］，限制了其在畜禽飼料中的應(yīng)用［9］。菜籽中的硫葡萄糖苷種類較多，但最主要有兩種，包括3-丁烯基硫葡萄糖苷和2-羥基-3-丁烯基硫葡萄糖苷，前者水解主要產(chǎn)生3-丁烯基異硫氰酸酯，后者水解主要產(chǎn)生5-乙烯基-1，3-噁唑烷-2-硫酮（5-vinyl-1，3-oxazolidine-2-thione，5-VOT）［10］。5-VOT和硫氰酸鹽是造成甲狀腺腫大及功能減退的最主要的物質(zhì)［11］，其中5-VOT造成甲狀腺功能減退的活力相當(dāng)于丙硫氧嘧啶的133%［12］。研究表明，給大鼠腹腔注射1 μg 5-VOT會(huì)抑制甲狀腺激素的合成，而注射5 μg即會(huì)引起甲狀腺腫大［13］；長(zhǎng)期給大鼠飼喂含50～100 ng/mL 5-VOT的牛奶，同樣會(huì)引起甲狀腺的腫大［14］。當(dāng)長(zhǎng)期給畜禽飼喂含菜粕的飼料時(shí)，這些毒素也會(huì)蓄積到動(dòng)物體組織和產(chǎn)品中，如牛奶、肌肉和雞蛋，對(duì)人體健康造成一定的威脅［15］。
歐盟等國(guó)家及我國(guó)僅對(duì)畜禽飼料中噁唑烷硫酮及異硫氰酸酯的含量進(jìn)行了限量規(guī)定，同時(shí)也建立了相應(yīng)的檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織建立的標(biāo)準(zhǔn)方法ISO 5504—1992《油料種子殘?jiān)喝慨惲蚯杷猁}和乙烯基硫代惡唑烷酮含量的測(cè)量》是許多國(guó)家的官方檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，噁唑烷硫酮的測(cè)定采用紫外分光光度法，但已于1998年9月17日廢除［16］，目前尚未有新標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)GB/T 13089—1991《飼料中噁唑烷硫酮的測(cè)定方法》［17］和NY/T 1799—2009《菜籽餅粕及其飼料中噁唑烷硫酮的測(cè)定：紫外分光光度法》［18］采用紫外分光光度法測(cè)定飼料中噁唑烷硫酮，紫外分光光度法相比于高效液相色譜法靈敏度低、檢出限高。
有關(guān)食品中5-VOT殘留量的測(cè)定尚無相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，僅有極少的研究報(bào)道用氣相色譜法測(cè)定血清、尿液、牛奶中5-VOT含量［19］，用高效液相色譜法測(cè)定羊體組織中5-VOT含量［20］，以及分光光度法測(cè)定魚肉中噁唑烷硫酮［21］，而雞蛋中5-VOT殘留量測(cè)定方法的研究鮮見報(bào)道。
因此，本實(shí)驗(yàn)選用高效液相色譜儀，擬建立一種快速、精準(zhǔn)、可靠的測(cè)定雞蛋中5-VOT殘留量的方法；同時(shí)用本方法測(cè)定大量雞蛋樣品中5-VOT殘留量，探討5-VOT在雞蛋中的殘留和消除變化情況，為評(píng)定雞蛋的安全食用提供數(shù)據(jù)支持。
1 材料與方法
1.1材料與試劑
菜粕（菜籽預(yù)壓浸提榨油后的副產(chǎn)物） 四川新興糧油廠；450 只30 周齡的羅曼粉殼蛋雞 市購(gòu)。
超純水（Mini-Q超純水）、Na3PO4（分析純）、H3PO4（分析純） 成都市科龍化工試劑廠；5-VOT標(biāo)準(zhǔn)品（98%，色譜純） 阿法埃莎（中國(guó)）化學(xué)有限公司；乙腈、正己烷（均為色譜純） 美國(guó)Sigma公司。
1.2儀器與設(shè)備
1200高效液相色譜儀（配備G1314F 1260VWD紫外檢測(cè)器） 美國(guó)Agilent Technologies公司；Heto PowerDry PL6000凍干機(jī) 美國(guó)Thermo Scientific公司；離心機(jī) 美國(guó)Eppendorf公司；MX-F漩渦混勻儀漩渦儀美國(guó)Scilogex公司。
1.3方法
1.3.1實(shí)驗(yàn)分組及雞蛋樣品采集
實(shí)驗(yàn)采用單因子完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，設(shè)3 個(gè)處理，對(duì)照組（不添加菜粕）、60%和100%菜粕組（等氮替代豆粕），即飼糧菜粕水平分別為0%、17.64%、29.4%。參考Leoni等［22］測(cè)定飼糧中5-VOT的含量，分別為0、73.99、84.82 μg/g。
選取450 只30 周齡的羅曼粉殼蛋雞，每個(gè)處理10 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15 只雞。實(shí)驗(yàn)全期為16 周，前12 周分別飼喂各處理飼糧，13 周起各組均飼喂基礎(chǔ)組飼糧，飼喂4 周。在實(shí)驗(yàn)第4、9、12、16 周結(jié)束時(shí)，各重復(fù)采集2 枚雞蛋，將蛋黃和蛋清混勻后放于樣品袋中，存于-20 ℃條件。雞蛋冷凍干燥至絕干，粉碎過40 目篩，-20 ℃保存，備用。
1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
用分析天平（精度0.01 mg）精確稱取3.19 mg 5-VOT至50 mL容量瓶中，加入乙腈定容至50 mL，超聲波超30 min（100 W）至標(biāo)準(zhǔn)品溶解，配制成63.8 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，儲(chǔ)存至4 ℃，以備稀釋用。
分別取63.8 μg/mL的5-VOT標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 000、1 000、100、10、1 μL于10 mL的容量瓶中，加入色譜純乙腈定容至10 mL，配制成6.3、63.8、638、6 380、12 760 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，240 nm波長(zhǎng)色譜條件下檢測(cè)，記錄結(jié)果并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.3.3加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)
準(zhǔn)確稱取5-VOT含量為269.06、447.33、602.56、1 487.51 ng/g的雞蛋粉各3 份，共4 組，在各組雞蛋樣中分別添加0.15、0.20、0.27、0.50 mL質(zhì)量濃度為6 380 ng/mL的5-VOT標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測(cè)定5-VOT含量，計(jì)算加標(biāo)回收率。
1.3.4雞蛋樣前處理
用分析天平準(zhǔn)確稱取19.0 g磷酸鈉于1 000 mL容量瓶中，用超純水定容至1 000 mL，搖勻，后倒出至燒杯中，用膠頭滴管吸取少量磷酸溶液，將磷酸鹽溶液的pH值調(diào)至7.00，即0.05 mol/L、pH 7.00磷酸鈉緩沖溶液。
準(zhǔn)確稱取雞蛋粉3.0～5.0 g粉樣于50 mL離心管中（精確到0.000 1 g），參考Leoni等［22］的方法，加入15 mL乙腈萃取目標(biāo)化合物，蓋上蓋子，漩渦混勻，超聲波超聲處理15 min，10 000 r/min離心5 min，將上清液倒入雞心瓶中，重復(fù)此操作2 次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，后加入2 mL的pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液、2 mL正己烷，超聲儀超聲1～2 min，保證目標(biāo)物充分溶解，取下層水溶液至2 mL的離心管中，12 000 r/min離心5 min，下層清液經(jīng)0.45 μm無機(jī)濾膜過濾至2 mL的進(jìn)樣瓶中，儲(chǔ)存于4 ℃中備測(cè)。
1.3.5色譜條件［13］
色譜柱為安捷倫1200系列C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相A相與B相分別為純水、乙腈（體積比為85∶15，等度洗脫），洗脫溶液為10%異丙醇溶液，柱溫30 ℃，波長(zhǎng)240 nm，流速1.0 mL/min，時(shí)間12 min，進(jìn)樣體積10 μL。
1.4統(tǒng)計(jì)分析
數(shù)據(jù)采用SAS 9.0進(jìn)行ANOVA分析，以P＜0.05作為差異顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)，差異顯著者采用LSD法進(jìn)行多重比較，同時(shí)采用GLM程序進(jìn)行線性回歸分析。
2 結(jié)果與分析
2.1流動(dòng)相及洗脫方式的選擇
圖1 5-VOT標(biāo)準(zhǔn)品（A）和雞蛋樣品（B）色譜圖Fig.1 Chromatograms of 5-VOT standard and sample
流動(dòng)相的選擇參照Mabon等［20］的研究在比例上稍作調(diào)整，A相為超純水、B相為乙腈，A相與B相體積以85∶15的比例對(duì)樣品進(jìn)行等度洗脫，洗脫時(shí)間12 min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5-VOT的保留時(shí)間為9.141 min，樣品經(jīng)前處理操作后雜質(zhì)少、對(duì)儀器的影響小，目標(biāo)化合物與其他物質(zhì)的分離度好，柱效高。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖如圖1所示。
2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限
按1.3.2節(jié)步驟，得出5-VOT的標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)質(zhì)量濃度y與峰面積x進(jìn)行線性回歸，得到方程式y(tǒng)=12.183x-39.383（R2=1.000 0），在質(zhì)量濃度范圍6.3～63 800 ng/mL之間線性關(guān)系好；以RSN為3計(jì)算儀器檢出限為0.224 0 ng/mL，以RSN為10計(jì)算儀器定量限為0.746 6 ng/mL。
2.3方法回收率
表1 5-VOT加標(biāo)回收率（n=3）Table1 Recovery rates of 5-VOT in spiked sample （n= 3）
由表1可知，5-VOT檢測(cè)方法的回收率在81.28%～103.28%之間，回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.75%～5.17%之間，可見方法的準(zhǔn)確度高。
2.4方法重復(fù)性
選擇實(shí)驗(yàn)第4周處理3的同一個(gè)重復(fù)雞蛋樣品，準(zhǔn)確稱取6 份進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表2，5-VOT含量均值為1 014.73 ng/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.19%，可見方法的可重復(fù)性高。
表2 5-VOT檢測(cè)方法重復(fù)性（n=6）Table2 Repeatability of the method （n = 6）
2.5儀器精密度
選擇質(zhì)量濃度為63.8 mg/L的5-VOT標(biāo)準(zhǔn)品上機(jī)連續(xù)檢測(cè)6 次，記錄峰面積，結(jié)果見表3，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.82%，可見儀器的精密度高。
表2 5-VOT檢測(cè)方法重復(fù)性（n=6）Table2 Repeatability of the method （n = 6）
2.6樣品檢測(cè)結(jié)果
如表4所示，未添加菜粕組雞蛋中不含有5-VOT。在實(shí)驗(yàn)第4、9、12周，隨著飼糧中5-VOT含量的增加，雞蛋中5-VOT殘留量極顯著增加（P＜0.01），呈一次線性關(guān)系（P＜0.000 1）；而隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，處理組2雞蛋中5-VOT殘留量顯著增加（P＜0.05），呈一次線性關(guān)系（P＜0.05）；處理組3有顯著增加的趨勢(shì)（P＜0.1），各組在12 周后換飼對(duì)照組飼糧4 周后未檢出5-VOT。
表4 雞蛋樣檢測(cè)結(jié)果Table4 Results for the determination of 5-VOT in eggs
3 討 論
菜粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子硫葡萄糖苷，在葡糖硫苷酶、微生物的水解作用下降解產(chǎn)生很多有毒物質(zhì)，主要包括5-VOT和硫氰酸鹽，對(duì)動(dòng)物的甲狀腺組織有很大的毒性，會(huì)造成甲狀腺的腫大及功能減退。動(dòng)物采食含菜粕的飼糧后，在腸道微生物的作用下產(chǎn)生5-VOT，其經(jīng)腸道吸收進(jìn)入血液后轉(zhuǎn)移至體組織中，對(duì)人體健康造成一定的威脅。前人的研究?jī)H是對(duì)體液包括牛奶、血漿、尿液［19］以及牛羊肌肉、血漿、肝臟、腎臟、甲狀腺［23］中的5-VOT進(jìn)行了測(cè)定，而對(duì)雞蛋中5-VOT含量的測(cè)定鮮見報(bào)道?？梢?，測(cè)定雞蛋中5-VOT殘留量對(duì)雞蛋的安全食用評(píng)定具有很大的意義。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用高效液相色譜法，應(yīng)用紫外檢測(cè)器能夠滿足雞蛋中5-VOT的測(cè)定需求，用乙腈萃取雞蛋中5-VOT，樣品中雜質(zhì)少，對(duì)儀器的影響小，且在12 min內(nèi)可以將5-VOT與其他化合物完全分離開。標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度在6.3～63 800 ng/mL范圍之間線性關(guān)系好（R2=1.000 0），以RSN=3計(jì)算儀器檢出限為0.224 ng/mL，平均回收率在81.28%～103.28%之間，平均回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.75%～5.17%之間，重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.19%，精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.82%?？梢姡迷摲y(cè)定雞蛋中5-VOT殘留量結(jié)果可靠、準(zhǔn)確，能滿足雞蛋中5-VOT殘留量的測(cè)定需求。
Mabon［23］對(duì)牛羊體組織中5-VOT的測(cè)定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)不添加菜粕的牛羊體組織中不含有5-VOT，隨著日糧中菜粕含量的增加，體組織中的5-VOT的殘留量也逐漸增加；同時(shí)隨著飼喂菜粕日糧時(shí)間的延長(zhǎng)，各組織中5-VOT的殘留量也逐漸的增加；可見，日糧中5-VOT的含量與體組織中該物質(zhì)的殘留量有時(shí)間和劑量效應(yīng)；母羊停飼菜粕1 周后血清中5-VOT被完全清除，而甲狀腺中的5-VOT在停飼3 周后完全被清除［24］。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果與其相似，不添加菜粕組的雞蛋中不含有5-VOT，同時(shí)雞蛋中5-VOT殘留量隨著蛋雞飼糧中菜粕含量以及蛋雞飼喂菜粕時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，具有時(shí)間和劑量效應(yīng)。蛋雞停飼菜粕4 周后，雞蛋中未檢出有5-VOT殘留。
4 結(jié) 論
實(shí)驗(yàn)采用乙腈提取雞蛋粉中5-VOT，樣品經(jīng)超聲、離心、旋轉(zhuǎn)蒸干處理，用pH 7.0的磷酸鈉緩沖溶液復(fù)溶，下層溶液離心后上機(jī)，方法線性好（R2=1.000 0），回收率在81.28%～103.28%之間，可重復(fù)性和精密度高，是一種測(cè)定雞蛋中5-VOT的可靠方法。
雞蛋5-VOT的含量隨著蛋雞飼糧中菜粕含量以及蛋雞飼喂菜粕飼糧時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，具有時(shí)間和劑量效應(yīng)；蛋雞停飼菜粕4 周后，雞蛋中未檢出有5-VOT殘留。
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Analysis of 5-Vinyl-1，3-oxazolidine-2-thione Residue in Eggs by HPLC
ZHU Liping， WANG Jianping， DING Xuemei， ZENG Qiufeng， BAI Shiping， XUAN Yue， SU Zhuowei， ZHANG Keying*
（Key Laboratory for Animal Disease-Resistance Nutrition of China， Ministry of Education， Institute of Animal Nutrition，Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China）
The study was conducted to establish an analytical method for measuring 5-vinyl-1，3-oxazolidine-2-thione（5-VOT） residue in eggs and to apply it on eggs from laying hens fed different levels of rapeseed meal （RSM）. A total of 450 30-week-old Lohmann pink-shelled hens were randomly assigned to 3 dietary treatments， including 0%， 17.64% and 29.4% RSM supplementation for 16 weeks （which was withdrawn during the last 4 weeks）. 5-VOT was extracted with acetonitrile，and then evaporated to dryness with a rotating evaporator under vacuum at 35 ℃. The 5-VOT was re-dissolved in 2 mL of phosphate buffer （pH 7.0） and purified with 2 mL of n-hexane. Thereafter， the aqueous solution was transferred to a 2 mL tube and centrifuged for 5 min at 12 000 r/min. The aqueous phase was passed through a 0.45 μm filter for HPLC analysis. The average recovery rates of 5-VOT ranged from 81.28% to 103.28% with relative standard deviations （RSDs） between 0.75% and 5.17%. The RSDs of repeatability and precision were 2.19% and 0.82%， respectively. The further investigation showed that 5-VOT concentrations in eggs linearly increased with the increase in either the level of dietary RSM or feeding time. After 4 weeks of RSM withdrawal， 5-VOT residue was not detected in eggs.
high performance liquid chromatography； egg； 5-vinyl-1，3-oxazolidine-2-thione
10.7506/spkx1002-6630-201618026
S859.84
A
1002-6630（2016）18-0159-05
朱麗萍， 王建萍， 丁雪梅， 等. 高效液相色譜法測(cè)定雞蛋中5-乙烯基-1，3-噁唑烷-2-硫酮?dú)埩袅浚跩］. 食品科學(xué)， 2016，37（18）: 159-163. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618026. http://www.spkx.net.cn
ZHU Liping， WANG Jianping， DING Xuemei， et al. Analysis of 5-vinyl-1，3-oxazolidine-2-thione residue in eggs by HPLC［J］. Food Science， 2016， 37（18）: 159-163. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618026. http://www.spkx.net.cn
2015-10-23
“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2014BAD13B04）；四川省科技廳科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2014NZ0043；2014NZ0002）
朱麗萍（1991—），女，博士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)。E-mail：357009299@qq.com
張克英（1961—），女，教授，博士，研究方向?yàn)榧仪轄I(yíng)養(yǎng)。E-mail：zkeying@sicau.edu.cn
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朱麗萍，王建萍，丁雪梅，曾秋鳳，白世平，玄 玥，宿卓薇，張克英*
（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130）
高效液相色譜法測(cè)定雞蛋中5-乙烯基-1，3-噁唑烷-2-硫酮?dú)埩袅?/p>
朱麗萍，王建萍，丁雪梅，曾秋鳳，白世平，玄玥，宿卓薇，張克英*
（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130）
建立一種用于測(cè)定雞蛋粉中5-乙烯基-1，3-噁唑烷-2-硫酮（5-vinyl-1，3-oxazolidine-2-thione，5-VOT）殘留量的高效液相色譜法，并探討5-VOT在雞蛋中的殘留消除情況。選用450 只30 周齡的羅曼粉殼蛋雞，隨機(jī)分為3 組，分別飼喂含0%（對(duì)照組，處理1）、17.64%（處理2）、29.4%（處理3）菜粕的飼糧，飼喂12 周后各組均換飼對(duì)照組的飼糧4 周，實(shí)驗(yàn)期共16 周。實(shí)驗(yàn)采用乙腈提取雞蛋粉中5-VOT，樣品經(jīng)超聲、離心、旋轉(zhuǎn)蒸干處理，用pH 7.0的磷酸鈉緩沖溶液復(fù)溶，下層溶液離心后經(jīng)0.45 μm無機(jī)濾膜過濾上機(jī)。結(jié)果表明，方法平均加標(biāo)回收率在81.28%～103.28%之間，平均回收率、重復(fù)性及精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.75%～5.17%、2.19%、0.82%，可滿足雞蛋中5-VOT殘留量的測(cè)定；雞蛋中5-VOT殘留量隨著蛋雞飼糧中菜粕含量以及蛋雞飼喂菜粕飼糧時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，處理組3菜粨飼喂12 周后5-VOT殘留量高達(dá)1 837.45 ng/g；換飼對(duì)照組飼糧4 周后，雞蛋中未檢出5-VOT。
高效液相色譜法；雞蛋；5-乙烯基-1，3-噁唑烷-2-硫酮
菜粕是十字花科植物油菜籽榨油后的副產(chǎn)物，是重要的蛋白質(zhì)飼料來源之一［1］，菜粕因其含有豐富的蛋白質(zhì)和平衡的氨基酸組成［2］，同時(shí)含有比豆粕更豐富的礦物元素如鈣、磷、鐵、錳、鋅、銅等［3］，被應(yīng)用于畜禽飼糧中［4-6］。然而菜粕中含有大量的抗?fàn)I養(yǎng)因子，主要包括硫葡萄糖苷及其代謝產(chǎn)物，硫葡萄糖苷本身對(duì)動(dòng)物沒有毒性［7］，但其代謝產(chǎn)物如噁唑烷硫酮、硫氰酸鹽、異硫氰酸酯等會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物體肝臟、腎臟、甲狀腺等受損傷、抑制動(dòng)物的生長(zhǎng)［8］，限制了其在畜禽飼料中的應(yīng)用［9］。菜籽中的硫葡萄糖苷種類較多，但最主要有兩種，包括3-丁烯基硫葡萄糖苷和2-羥基-3-丁烯基硫葡萄糖苷，前者水解主要產(chǎn)生3-丁烯基異硫氰酸酯，后者水解主要產(chǎn)生5-乙烯基-1，3-噁唑烷-2-硫酮（5-vinyl-1，3-oxazolidine-2-thione，5-VOT）［10］。5-VOT和硫氰酸鹽是造成甲狀腺腫大及功能減退的最主要的物質(zhì)［11］，其中5-VOT造成甲狀腺功能減退的活力相當(dāng)于丙硫氧嘧啶的133%［12］。研究表明，給大鼠腹腔注射1 μg 5-VOT會(huì)抑制甲狀腺激素的合成，而注射5 μg即會(huì)引起甲狀腺腫大［13］；長(zhǎng)期給大鼠飼喂含50～100 ng/mL 5-VOT的牛奶，同樣會(huì)引起甲狀腺的腫大［14］。當(dāng)長(zhǎng)期給畜禽飼喂含菜粕的飼料時(shí)，這些毒素也會(huì)蓄積到動(dòng)物體組織和產(chǎn)品中，如牛奶、肌肉和雞蛋，對(duì)人體健康造成一定的威脅［15］。
歐盟等國(guó)家及我國(guó)僅對(duì)畜禽飼料中噁唑烷硫酮及異硫氰酸酯的含量進(jìn)行了限量規(guī)定，同時(shí)也建立了相應(yīng)的檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織建立的標(biāo)準(zhǔn)方法ISO 5504—1992《油料種子殘?jiān)喝慨惲蚯杷猁}和乙烯基硫代惡唑烷酮含量的測(cè)量》是許多國(guó)家的官方檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，噁唑烷硫酮的測(cè)定采用紫外分光光度法，但已于1998年9月17日廢除［16］，目前尚未有新標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)GB/T 13089—1991《飼料中噁唑烷硫酮的測(cè)定方法》［17］和NY/T 1799—2009《菜籽餅粕及其飼料中噁唑烷硫酮的測(cè)定：紫外分光光度法》［18］采用紫外分光光度法測(cè)定飼料中噁唑烷硫酮，紫外分光光度法相比于高效液相色譜法靈敏度低、檢出限高。
有關(guān)食品中5-VOT殘留量的測(cè)定尚無相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，僅有極少的研究報(bào)道用氣相色譜法測(cè)定血清、尿液、牛奶中5-VOT含量［19］，用高效液相色譜法測(cè)定羊體組織中5-VOT含量［20］，以及分光光度法測(cè)定魚肉中噁唑烷硫酮［21］，而雞蛋中5-VOT殘留量測(cè)定方法的研究鮮見報(bào)道。
因此，本實(shí)驗(yàn)選用高效液相色譜儀，擬建立一種快速、精準(zhǔn)、可靠的測(cè)定雞蛋中5-VOT殘留量的方法；同時(shí)用本方法測(cè)定大量雞蛋樣品中5-VOT殘留量，探討5-VOT在雞蛋中的殘留和消除變化情況，為評(píng)定雞蛋的安全食用提供數(shù)據(jù)支持。
1 材料與方法
1.1材料與試劑
菜粕（菜籽預(yù)壓浸提榨油后的副產(chǎn)物） 四川新興糧油廠；450 只30 周齡的羅曼粉殼蛋雞 市購(gòu)。
超純水（Mini-Q超純水）、Na3PO4（分析純）、H3PO4（分析純） 成都市科龍化工試劑廠；5-VOT標(biāo)準(zhǔn)品（98%，色譜純） 阿法埃莎（中國(guó)）化學(xué)有限公司；乙腈、正己烷（均為色譜純） 美國(guó)Sigma公司。
1.2儀器與設(shè)備
1200高效液相色譜儀（配備G1314F 1260VWD紫外檢測(cè)器） 美國(guó)Agilent Technologies公司；Heto PowerDry PL6000凍干機(jī) 美國(guó)Thermo Scientific公司；離心機(jī) 美國(guó)Eppendorf公司；MX-F漩渦混勻儀漩渦儀美國(guó)Scilogex公司。
1.3方法
1.3.1實(shí)驗(yàn)分組及雞蛋樣品采集
實(shí)驗(yàn)采用單因子完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，設(shè)3 個(gè)處理，對(duì)照組（不添加菜粕）、60%和100%菜粕組（等氮替代豆粕），即飼糧菜粕水平分別為0%、17.64%、29.4%。參考Leoni等［22］測(cè)定飼糧中5-VOT的含量，分別為0、73.99、84.82 μg/g。
選取450 只30 周齡的羅曼粉殼蛋雞，每個(gè)處理10 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15 只雞。實(shí)驗(yàn)全期為16 周，前12 周分別飼喂各處理飼糧，13 周起各組均飼喂基礎(chǔ)組飼糧，飼喂4 周。在實(shí)驗(yàn)第4、9、12、16 周結(jié)束時(shí)，各重復(fù)采集2 枚雞蛋，將蛋黃和蛋清混勻后放于樣品袋中，存于-20 ℃條件。雞蛋冷凍干燥至絕干，粉碎過40 目篩，-20 ℃保存，備用。
1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
用分析天平（精度0.01 mg）精確稱取3.19 mg 5-VOT至50 mL容量瓶中，加入乙腈定容至50 mL，超聲波超30 min（100 W）至標(biāo)準(zhǔn)品溶解，配制成63.8 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，儲(chǔ)存至4 ℃，以備稀釋用。
分別取63.8 μg/mL的5-VOT標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 000、1 000、100、10、1 μL于10 mL的容量瓶中，加入色譜純乙腈定容至10 mL，配制成6.3、63.8、638、6 380、12 760 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，240 nm波長(zhǎng)色譜條件下檢測(cè)，記錄結(jié)果并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.3.3加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)
準(zhǔn)確稱取5-VOT含量為269.06、447.33、602.56、1 487.51 ng/g的雞蛋粉各3 份，共4 組，在各組雞蛋樣中分別添加0.15、0.20、0.27、0.50 mL質(zhì)量濃度為6 380 ng/mL的5-VOT標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測(cè)定5-VOT含量，計(jì)算加標(biāo)回收率。
1.3.4雞蛋樣前處理
用分析天平準(zhǔn)確稱取19.0 g磷酸鈉于1 000 mL容量瓶中，用超純水定容至1 000 mL，搖勻，后倒出至燒杯中，用膠頭滴管吸取少量磷酸溶液，將磷酸鹽溶液的pH值調(diào)至7.00，即0.05 mol/L、pH 7.00磷酸鈉緩沖溶液。
準(zhǔn)確稱取雞蛋粉3.0～5.0 g粉樣于50 mL離心管中（精確到0.000 1 g），參考Leoni等［22］的方法，加入15 mL乙腈萃取目標(biāo)化合物，蓋上蓋子，漩渦混勻，超聲波超聲處理15 min，10 000 r/min離心5 min，將上清液倒入雞心瓶中，重復(fù)此操作2 次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，后加入2 mL的pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液、2 mL正己烷，超聲儀超聲1～2 min，保證目標(biāo)物充分溶解，取下層水溶液至2 mL的離心管中，12 000 r/min離心5 min，下層清液經(jīng)0.45 μm無機(jī)濾膜過濾至2 mL的進(jìn)樣瓶中，儲(chǔ)存于4 ℃中備測(cè)。
1.3.5色譜條件［13］
色譜柱為安捷倫1200系列C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相A相與B相分別為純水、乙腈（體積比為85∶15，等度洗脫），洗脫溶液為10%異丙醇溶液，柱溫30 ℃，波長(zhǎng)240 nm，流速1.0 mL/min，時(shí)間12 min，進(jìn)樣體積10 μL。
1.4統(tǒng)計(jì)分析
數(shù)據(jù)采用SAS 9.0進(jìn)行ANOVA分析，以P＜0.05作為差異顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)，差異顯著者采用LSD法進(jìn)行多重比較，同時(shí)采用GLM程序進(jìn)行線性回歸分析。
2 結(jié)果與分析
2.1流動(dòng)相及洗脫方式的選擇
圖1 5-VOT標(biāo)準(zhǔn)品（A）和雞蛋樣品（B）色譜圖Fig.1 Chromatograms of 5-VOT standard and sample
流動(dòng)相的選擇參照Mabon等［20］的研究在比例上稍作調(diào)整，A相為超純水、B相為乙腈，A相與B相體積以85∶15的比例對(duì)樣品進(jìn)行等度洗脫，洗脫時(shí)間12 min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5-VOT的保留時(shí)間為9.141 min，樣品經(jīng)前處理操作后雜質(zhì)少、對(duì)儀器的影響小，目標(biāo)化合物與其他物質(zhì)的分離度好，柱效高。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖如圖1所示。
2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限
按1.3.2節(jié)步驟，得出5-VOT的標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)質(zhì)量濃度y與峰面積x進(jìn)行線性回歸，得到方程式y(tǒng)=12.183x-39.383（R2=1.000 0），在質(zhì)量濃度范圍6.3～63 800 ng/mL之間線性關(guān)系好；以RSN為3計(jì)算儀器檢出限為0.224 0 ng/mL，以RSN為10計(jì)算儀器定量限為0.746 6 ng/mL。
2.3方法回收率
表1 5-VOT加標(biāo)回收率（n=3）Table1 Recovery rates of 5-VOT in spiked sample （n= 3）
由表1可知，5-VOT檢測(cè)方法的回收率在81.28%～103.28%之間，回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.75%～5.17%之間，可見方法的準(zhǔn)確度高。
2.4方法重復(fù)性
選擇實(shí)驗(yàn)第4周處理3的同一個(gè)重復(fù)雞蛋樣品，準(zhǔn)確稱取6 份進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表2，5-VOT含量均值為1 014.73 ng/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.19%，可見方法的可重復(fù)性高。
表2 5-VOT檢測(cè)方法重復(fù)性（n=6）Table2 Repeatability of the method （n = 6）
2.5儀器精密度
選擇質(zhì)量濃度為63.8 mg/L的5-VOT標(biāo)準(zhǔn)品上機(jī)連續(xù)檢測(cè)6 次，記錄峰面積，結(jié)果見表3，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.82%，可見儀器的精密度高。
表2 5-VOT檢測(cè)方法重復(fù)性（n=6）Table2 Repeatability of the method （n = 6）
2.6樣品檢測(cè)結(jié)果
如表4所示，未添加菜粕組雞蛋中不含有5-VOT。在實(shí)驗(yàn)第4、9、12周，隨著飼糧中5-VOT含量的增加，雞蛋中5-VOT殘留量極顯著增加（P＜0.01），呈一次線性關(guān)系（P＜0.000 1）；而隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，處理組2雞蛋中5-VOT殘留量顯著增加（P＜0.05），呈一次線性關(guān)系（P＜0.05）；處理組3有顯著增加的趨勢(shì)（P＜0.1），各組在12 周后換飼對(duì)照組飼糧4 周后未檢出5-VOT。
表4 雞蛋樣檢測(cè)結(jié)果Table4 Results for the determination of 5-VOT in eggs
3 討 論
菜粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子硫葡萄糖苷，在葡糖硫苷酶、微生物的水解作用下降解產(chǎn)生很多有毒物質(zhì)，主要包括5-VOT和硫氰酸鹽，對(duì)動(dòng)物的甲狀腺組織有很大的毒性，會(huì)造成甲狀腺的腫大及功能減退。動(dòng)物采食含菜粕的飼糧后，在腸道微生物的作用下產(chǎn)生5-VOT，其經(jīng)腸道吸收進(jìn)入血液后轉(zhuǎn)移至體組織中，對(duì)人體健康造成一定的威脅。前人的研究?jī)H是對(duì)體液包括牛奶、血漿、尿液［19］以及牛羊肌肉、血漿、肝臟、腎臟、甲狀腺［23］中的5-VOT進(jìn)行了測(cè)定，而對(duì)雞蛋中5-VOT含量的測(cè)定鮮見報(bào)道?？梢?，測(cè)定雞蛋中5-VOT殘留量對(duì)雞蛋的安全食用評(píng)定具有很大的意義。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用高效液相色譜法，應(yīng)用紫外檢測(cè)器能夠滿足雞蛋中5-VOT的測(cè)定需求，用乙腈萃取雞蛋中5-VOT，樣品中雜質(zhì)少，對(duì)儀器的影響小，且在12 min內(nèi)可以將5-VOT與其他化合物完全分離開。標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度在6.3～63 800 ng/mL范圍之間線性關(guān)系好（R2=1.000 0），以RSN=3計(jì)算儀器檢出限為0.224 ng/mL，平均回收率在81.28%～103.28%之間，平均回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.75%～5.17%之間，重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.19%，精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.82%?？梢姡迷摲y(cè)定雞蛋中5-VOT殘留量結(jié)果可靠、準(zhǔn)確，能滿足雞蛋中5-VOT殘留量的測(cè)定需求。
Mabon［23］對(duì)牛羊體組織中5-VOT的測(cè)定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)不添加菜粕的牛羊體組織中不含有5-VOT，隨著日糧中菜粕含量的增加，體組織中的5-VOT的殘留量也逐漸增加；同時(shí)隨著飼喂菜粕日糧時(shí)間的延長(zhǎng)，各組織中5-VOT的殘留量也逐漸的增加；可見，日糧中5-VOT的含量與體組織中該物質(zhì)的殘留量有時(shí)間和劑量效應(yīng)；母羊停飼菜粕1 周后血清中5-VOT被完全清除，而甲狀腺中的5-VOT在停飼3 周后完全被清除［24］。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果與其相似，不添加菜粕組的雞蛋中不含有5-VOT，同時(shí)雞蛋中5-VOT殘留量隨著蛋雞飼糧中菜粕含量以及蛋雞飼喂菜粕時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，具有時(shí)間和劑量效應(yīng)。蛋雞停飼菜粕4 周后，雞蛋中未檢出有5-VOT殘留。
4 結(jié) 論
實(shí)驗(yàn)采用乙腈提取雞蛋粉中5-VOT，樣品經(jīng)超聲、離心、旋轉(zhuǎn)蒸干處理，用pH 7.0的磷酸鈉緩沖溶液復(fù)溶，下層溶液離心后上機(jī)，方法線性好（R2=1.000 0），回收率在81.28%～103.28%之間，可重復(fù)性和精密度高，是一種測(cè)定雞蛋中5-VOT的可靠方法。
雞蛋5-VOT的含量隨著蛋雞飼糧中菜粕含量以及蛋雞飼喂菜粕飼糧時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，具有時(shí)間和劑量效應(yīng)；蛋雞停飼菜粕4 周后，雞蛋中未檢出有5-VOT殘留。
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Analysis of 5-Vinyl-1，3-oxazolidine-2-thione Residue in Eggs by HPLC
ZHU Liping， WANG Jianping， DING Xuemei， ZENG Qiufeng， BAI Shiping， XUAN Yue， SU Zhuowei， ZHANG Keying*
（Key Laboratory for Animal Disease-Resistance Nutrition of China， Ministry of Education， Institute of Animal Nutrition，Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China）
The study was conducted to establish an analytical method for measuring 5-vinyl-1，3-oxazolidine-2-thione（5-VOT） residue in eggs and to apply it on eggs from laying hens fed different levels of rapeseed meal （RSM）. A total of 450 30-week-old Lohmann pink-shelled hens were randomly assigned to 3 dietary treatments， including 0%， 17.64% and 29.4% RSM supplementation for 16 weeks （which was withdrawn during the last 4 weeks）. 5-VOT was extracted with acetonitrile，and then evaporated to dryness with a rotating evaporator under vacuum at 35 ℃. The 5-VOT was re-dissolved in 2 mL of phosphate buffer （pH 7.0） and purified with 2 mL of n-hexane. Thereafter， the aqueous solution was transferred to a 2 mL tube and centrifuged for 5 min at 12 000 r/min. The aqueous phase was passed through a 0.45 μm filter for HPLC analysis. The average recovery rates of 5-VOT ranged from 81.28% to 103.28% with relative standard deviations （RSDs） between 0.75% and 5.17%. The RSDs of repeatability and precision were 2.19% and 0.82%， respectively. The further investigation showed that 5-VOT concentrations in eggs linearly increased with the increase in either the level of dietary RSM or feeding time. After 4 weeks of RSM withdrawal， 5-VOT residue was not detected in eggs.
high performance liquid chromatography； egg； 5-vinyl-1，3-oxazolidine-2-thione
10.7506/spkx1002-6630-201618026
S859.84
A
1002-6630（2016）18-0159-05
朱麗萍， 王建萍， 丁雪梅， 等. 高效液相色譜法測(cè)定雞蛋中5-乙烯基-1，3-噁唑烷-2-硫酮?dú)埩袅浚跩］. 食品科學(xué)， 2016，37（18）: 159-163. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618026. http://www.spkx.net.cn
ZHU Liping， WANG Jianping， DING Xuemei， et al. Analysis of 5-vinyl-1，3-oxazolidine-2-thione residue in eggs by HPLC［J］. Food Science， 2016， 37（18）: 159-163. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618026. http://www.spkx.net.cn
2015-10-23
“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2014BAD13B04）；四川省科技廳科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2014NZ0043；2014NZ0002）
朱麗萍（1991—），女，博士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)。E-mail：357009299@qq.com
張克英（1961—），女，教授，博士，研究方向?yàn)榧仪轄I(yíng)養(yǎng)。E-mail：zkeying@sicau.edu.cn
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