超高效液相色譜法同時測定降糖類保健食品中非法添加的13 種化學(xué)藥物

林　芳，李 濤*，王一欣，張　麗，劉海靜

（陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 西安 710065）

超高效液相色譜法同時測定降糖類保健食品中非法添加的13 種化學(xué)藥物

林芳，李 濤*，王一欣，張麗，劉海靜

（陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 西安 710065）

建立超高效液相色譜法，同時測定降糖類保健食品中可能非法添加的13 種化學(xué)藥物（鹽酸二甲雙胍、鹽酸丁二胍、鹽酸苯乙雙胍、甲苯磺丁脲、格列吡嗪、格列齊特、格列波脲、鹽酸羅格列酮、格列本脲、鹽酸吡格列酮、格列美脲、瑞格列奈、格列喹酮）。樣品采用甲醇提取，經(jīng)ZORBAX SB-C18色譜柱分離，乙腈和0.02 mol/L乙酸銨為流動相梯度洗脫，流速0.2 mL/min。采用二極管陣列檢測器，采集波長235 nm處的色譜圖進(jìn)行初篩和定量。并通過與13 種降糖藥物標(biāo)準(zhǔn)品的光譜比對進(jìn)行確證。結(jié)果表明，13 種降糖藥物在30 min內(nèi)可有效分離，在0.3～90 μg/mL的線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均大于0.999，平均回收率為83.2%～108.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于5.5%，檢出限為0.2～0.6 ng。該方法前處理簡單、分析時間相對較短、靈敏度高且重復(fù)性好，實(shí)現(xiàn)一個系統(tǒng)對13 種降糖藥物的同時檢測，可作為降糖類保健食品檢測非法添加化學(xué)成分的參考方法。

保健食品；降糖類藥物；非法添加；超高效液相色譜法

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展、生活水平的提高與生活節(jié)奏的加快，越來越多的人受到糖尿病、高血壓等慢性病的困擾。保健食品作為一種新興的功能性食品，常宣稱含有天然、有機(jī)、中草藥成分，具備輔助調(diào)節(jié)血糖、輔助降血壓等功能，是具有一種功效或宣稱功能的食品［1-2］。同時，通過一些不良媒體宣傳［3］，保健食品常被人們誤認(rèn)為可替代藥物，快速治療疾病且安全無副作用等。這種觀念，被不良商家利用，在保健品中非法加入化學(xué)藥物，以增強(qiáng)療效、謀取暴利［4］。很多添加的化學(xué)藥物如果長期使用不當(dāng)，將對人體造成極大的危害［5-7］。2012年12月14日，國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布了《保健食品中可能非法添加的物質(zhì)名單（第一批）》［8］，列出聲稱輔助降血糖（調(diào)節(jié)血糖）功能產(chǎn)品的中可能添加甲苯磺丁脲、格列苯脲、格列齊特等11 種降糖藥物，同時公布了檢驗(yàn)依據(jù)［9］，2014—2015年國家保健食品抽檢監(jiān)測工作要求對包括上述11 種降糖藥物在內(nèi)的共13 種降糖藥物開展非法添加篩查，并增加了3 個推薦的依據(jù)［10-12］。所有的檢驗(yàn)依據(jù)需要4 個液相系統(tǒng)完成對13 種降糖藥物的篩查，每個樣品的儀器檢測時間超過3 h，前處理還有所差異，檢測周期較長，工作量及對試劑耗材的消耗均較大。若是能夠簡化檢測方法，快速有效的完成對目標(biāo)物的檢測，將對檢驗(yàn)工作的開展，加強(qiáng)市場監(jiān)管及保障人民群眾健康起到積極作用。

與傳統(tǒng)的高效液相色譜相比［13-15］，超高效液相色譜具有更快的分離速率、更高的分辨率和靈敏度，可適用于復(fù)雜基質(zhì)中藥物的分離、分析［16-21］。本實(shí)驗(yàn)利用超高效液相色譜的高分辨率和高靈敏度等特性，建立了一個液相系統(tǒng)同時較快速地檢測鹽酸二甲雙胍、鹽酸丁二胍、鹽酸苯乙雙胍、甲苯磺丁脲、格列吡嗪、格列齊特、格列波脲、鹽酸羅格列酮、格列本脲、鹽酸吡格列酮、格列美脲、瑞格列奈、格列喹酮共13 種降糖藥物的方法。該方法結(jié)合二極管陣列檢測器的光譜特征分析，可在一次運(yùn)行中同時完成樣品快速篩查、光譜確證和定量分析，線性關(guān)系、回收率、分離度均良好，檢測簡便、較國標(biāo)推薦方法節(jié)約大量檢測時間、靈敏度高且重復(fù)性好。該方法檢測目標(biāo)物覆蓋了國家保健食品抽檢監(jiān)測工作降糖類保健食品要求篩查的所有藥物種類，可作為降糖類保健食品檢測非法添加化學(xué)成分的參考方法。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

檢測樣品為2015年陜西省國抽、省抽工作中從全省11 個市（區(qū)）抽取到的聲稱具有輔助降血糖功能的保健食品，共計30余批。

空白樣品：本實(shí)驗(yàn)所用的空白樣品為歷次抽檢中有代表性的固體、液體樣品，輔料成分為硬脂酸鎂、乳糖、預(yù)膠化淀粉、甜味劑、防腐劑等，經(jīng)檢測不含13 種降糖藥物。

甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國Meker公司；乙酸銨（純度≥99.0%） 美國Fluka公司；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

標(biāo)準(zhǔn)品：鹽酸二甲雙胍（含量100%，CAS號：1115-70-4）、鹽酸苯乙雙胍（含量99.7%，CAS號：834-28-6）、格列吡嗪（含量99.5%，CAS號：29094-61-9）、格列齊特（含量99.9%，CAS號：21187-98-4）、格列波脲（含量99.9%，CAS號：26944-48-9）、鹽酸羅格列酮（含量91.3%，CAS號：302543-62-0）、格列本脲（含量99.9%，CAS號：10238-21-8）、鹽酸吡格列酮（含量100%，CAS號：112529-15-4）、格列美脲（含量99.1%，CAS號：93479-97-1）、瑞格列奈（含量99.8%，CAS號：135062-02-1）、格列喹酮（含量99.5%，CAS號：33342-05-1） 中國食品藥品檢定研究院；鹽酸丁二胍（含量100%，CAS號：1190-53-0）加拿大TRC公司；甲苯磺丁脲（含量99.0%，CAS號：64-77-7） 美國Fluka公司。

1.2儀器與設(shè)備

1290 Infinity超高效液相色譜儀（配有1290二極管陣列檢測器） 美國Agilent公司；8040液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；AE-240雙量程電子天平瑞士Mettlor Toledo公司；AS20500B超聲波清洗器天津奧特賽恩斯儀器有限公司；Synergy型超純水儀美國Millipore公司；數(shù)顯恒溫水浴 江蘇省金華市榮華儀器制造有限公司。

1.3方法

1.3.1色譜及光譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫35 ℃；流速0.2 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；流動相A：乙腈，流動相B：0.02 mol/L乙酸銨溶液；梯度洗脫；檢測波長235 nm。

光譜條件：光譜范圍190～400 nm；光譜采集模式：全掃描。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取13 種標(biāo)準(zhǔn)品各10～20 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得單標(biāo)儲備液，質(zhì)量濃度約為1 mg/mL。再從各單標(biāo)儲備液中準(zhǔn)確移取0.5～1.5 mL，置于同一25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。再由混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液梯度稀釋成標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)，得13 種降糖類化學(xué)藥物的系列混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，質(zhì)量濃度為0.3～90 μg/mL。

1.3.3樣品前處理

樣品前處理方法參考相關(guān)文獻(xiàn)［14，22-24］、國家食品藥品監(jiān)督管理局批件2009029［9］、2013001［11］。固體樣品：取樣品5 次口服劑量（片劑除去包衣，膠囊劑取內(nèi)容物），研細(xì)。精密稱取相當(dāng)于1 次口服劑量樣品，置50 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理20 min，冷卻，加甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，取濾液作為供試品溶液。液體樣品：準(zhǔn)確移取相當(dāng)于一次口服劑量的溶液，60 ℃旋蒸至近干，轉(zhuǎn)移置50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，取濾液作為供試品溶液。同批樣品均做2 份平行樣，供試品溶液若檢出藥物含量過高，可根據(jù)具體情況再進(jìn)行稀釋。

1.3.4回收率和精密度測定

分別選取固體（膠囊劑內(nèi)容物）和液體（口服液）基質(zhì)的空白樣品。加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，使加標(biāo)質(zhì)量濃度達(dá)到方法檢出限、4 倍定量限、20 倍定量限3 個添加水平。按1.3.3節(jié)方法進(jìn)行處理，每種基質(zhì)的每個添加水平平行做3 份樣，每個樣品重復(fù)測定2 次，計算樣品的回收率。

取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)進(jìn)樣6 次，測定各個標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積，按色譜條件以峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）表示精密度。

1.3.5方法的穩(wěn)定性及重復(fù)性測定

取混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液分別在0、12、24、48、72 h進(jìn)樣，計算13 種降糖藥物峰面積的RSD。同時，選取檢出的陽性樣品，按1.3.3節(jié)方法處理，分別在0、12、24、48、72 h相同條件進(jìn)樣，計算檢出樣品對應(yīng)藥物含量的RSD，考察方法的穩(wěn)定性。

取同批次陽性樣品6 份，按1.3.3節(jié)方法平行處理，得到供試品溶液并測定。以檢出藥物含量的RSD考察方法的重復(fù)性。

1.3.6光譜確證分析

同時采集標(biāo)準(zhǔn)品和樣品在波長190～400 nm處光譜，根據(jù)13 種降糖藥物的特征吸收光譜建立光譜庫，當(dāng)檢測到樣品有與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間一致的色譜峰時，即與該標(biāo)準(zhǔn)對照藥物進(jìn)行光譜匹配度檢索，匹配度達(dá)90%以上且峰純度較高（大于90%）時，可判斷該類保健食品中添加了某種降糖藥物（必要時可用質(zhì)譜進(jìn)行確證），同時可計算出該類藥物的添加量。

1.3.7方法的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證本方法的可靠性，選取一份檢測陽性樣品，進(jìn)行質(zhì)譜確證。

液相及質(zhì)譜條件［9，22，25-26］：液相條件：流動相，甲醇、0.02 mol/L乙酸銨溶液，流速0.2 mL/min；質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測模式；電離電壓3.0 kV；錐孔電壓25 V；源溫度120 ℃；脫溶劑氣溫度250 ℃；碰撞氣體（氬氣）：壓力230 kPa；干燥氣流速15 L/min；霧化氣流速3 L/h。

2　結(jié)果與分析

2.1色譜條件的優(yōu)化

表1　梯度洗脫條件Table1　Gradient elution conditions

圖1　13 種降糖藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（20～60 μg/mL）Fig.1　Chromatograms of mixed standard solution of 13 anti-diabetic drugs （20-60 μg/mL

以ZORBAX SB-C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）作為分析柱。以流動相A：乙腈，流動相B：0.02 mol/L乙酸銨溶液作為流動相［22］，梯度洗脫，調(diào)整流動相比例，優(yōu)化洗脫條件。優(yōu)化后的洗脫條件見表1，可使13 種降糖藥物保持足夠的分離度和良好的峰形，經(jīng)相同色譜條件下的標(biāo)準(zhǔn)品單標(biāo)溶液定位，可確定13 種降糖藥物的出峰順序和保留時間。同時在波長235 nm處，檢測信號靈敏度較高，分離效果滿足檢測需要，此條件下所有降糖藥物在30 min前出峰。13 種降糖藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖1。

2.2線性關(guān)系、定量限和檢出限

將1.3.2節(jié)得到的13 種降糖藥物的系列混合標(biāo)曲溶液，按2.1節(jié)色譜條件進(jìn)行檢測，以對應(yīng)的色譜圖峰面積為縱坐標(biāo)（y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/mL）進(jìn)行回歸分析。如表2所示，13 種降糖藥物在該范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.999，說明本方法適用于保健食品中非法添加的13 種降糖類藥物的定量分析。

在本實(shí)驗(yàn)條件下，在空白樣品中分別加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按供試品的處理方法同法處理，連續(xù)稀釋至3 倍信噪比，作為本方法的檢出限。檢出限結(jié)合本方法進(jìn)樣體積（2 μL），得到本方法的檢出限。本方法檢出限為0.2～0.6 ng。連續(xù)稀釋至10 倍信噪比作為本方法的定量限。定量限結(jié)合本方法進(jìn)樣體積（2 μL），得到本方法的定量限，本方法定量限為0.6～1.8 ng。

表2　13 種降糖藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、定量限、檢出限Table2　Calibration curves， correlation coefficients （r2）， linear ranges，limits of quantification （LOQs）， limits of detection （LODs） for 13 anti-diabetic drugs

2.3回收率和精密度結(jié)果

如表3所示，按1.3.4節(jié)方法，13 種降糖藥物的3 個添加水平在固體基質(zhì)中回收率為86.1%～108.8%；液體基質(zhì)中回收率為83.2%～108.9%，RSD不大于5.5%。

表3　13 種降糖藥物不同基質(zhì)保健食品中的加標(biāo)回收率和精密度（n=6）Table3　Recoveries and RSDs for 13 anti-diabetic drugs spiked in different health food matrices （n= 6）

2.4精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按1.3.4節(jié)方法，鹽酸二甲雙胍、鹽酸丁二胍、鹽酸苯乙雙胍、甲苯磺丁脲、格列吡嗪、格列齊特、格列波脲、鹽酸羅格列酮、格列本脲、鹽酸吡格列酮、格列美脲、瑞格列奈和格列喹酮平均峰面積的RSD分別為3.5%、3.8%、2.0%、3.2%、2.0%、3.5%、1.8%、2.3%、2.0%、3.0%、1.5%、2.5%、4.0%，表明儀器精密度良好。

2.5方法的穩(wěn)定性及重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按1.3.5節(jié)方法，計算13 種降糖藥物混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液在不同檢測時間點(diǎn)峰面積的RSD在0.87%～4.82%之間。同時選取陽性樣品，對應(yīng)藥物含量在不同檢測時間點(diǎn)的RSD在1.02%～4.63%之間，說明標(biāo)準(zhǔn)品和樣品在72 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

按1.3.5節(jié)中的方法，同批次6 份陽性樣品檢出降糖藥物含量的RSD為1.97%～4.77%，說明本方法重復(fù)性良好。2.6 實(shí)際樣品檢測與光譜確證分析

13 種降糖藥物于波長190～400 nm處的特征吸收光譜如圖2所示。某廠家樣品膠囊按照1.3.3節(jié)方法前處理，2.1節(jié)色譜及光譜條件檢測，如圖3所示，峰1與鹽酸羅格列酮保留時間一致，且光譜特征一致；峰2與鹽酸比格列酮保留時間一致，且光譜特征一致，峰1與峰2光譜圖見圖3A、B，證實(shí)樣品含有鹽酸羅格列酮和鹽酸比格列酮。

圖2　13種降糖藥物的特征吸收光譜圖Fig. 2 Characteristic absorption spectra of 13 anti-diabetic drugs

圖3　陽性樣品色譜圖（A）、峰1（B）與峰2（C）的光譜圖Fig.3　Chromatogram of positive sample （A）， and absorption spectra of peak 1 （B） and peak 2 （C）

2.7質(zhì)譜驗(yàn)證結(jié)果

表4　2 種非法添加化學(xué)物的質(zhì)譜檢測參數(shù)Table4　Mass spectral parameters of 2 illegally added components

圖4　陽性樣品與標(biāo)準(zhǔn)品多反應(yīng)監(jiān)測模式圖譜Fig.4　MRM chromatograms of positive samples and standards

按1.3.7節(jié)方法，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法驗(yàn)證本方法的可靠性，選取2.5節(jié)中陽性樣品，檢出2 種物質(zhì)的離子信息如表4所示，樣品中母離子和2對子離子均有檢出，離子豐度比符合要求，再次確認(rèn)檢出物為羅格列酮與吡格列酮，如圖4所示。

3　結(jié) 論

本研究建立了超高效液色譜結(jié)合二極管陣列檢測器，同時測定降糖類保健食品中非法添加的13 種化學(xué)藥物的方法。該方法將國標(biāo)推薦的多液相系統(tǒng)檢測方法簡化為一個系統(tǒng)同時實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的快速篩查、光譜確證和定量分析，大大節(jié)約檢測時間與成本。該方法精密度和穩(wěn)定性良好，靈敏度高，分離度滿足要求，可作為降糖類保健食品檢測非法添加化學(xué)成分的參考方法。

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［23］ 黃湘鷺， 王靜文， 曹進(jìn)， 等. 降血糖類保健食品中非法添加的8 種藥物檢測及實(shí)例分析［J］. 食品科學(xué)， 2014， 35（10）: 149-152. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201410027.

［24］ 余小平， 王也， 周靜安， 等. 快速篩查檢驗(yàn)保健食品及中成藥中的12種化學(xué)降糖藥［J］. 藥物分析雜志， 2013， 33（6）: 1003-1006.

［25］ 曹梅榮， 李強(qiáng)， 張冬生. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測降糖類保健食品中的10 種非法添加物［J］. 分析試驗(yàn)室， 2015， 34（8）: 896-901.

［26］ 歐貝麗， 張紅偉， 徐宏祥. UPLC-MS/MS法測定中成藥及保健品中添加的36 種化學(xué)藥物［J］. 藥物分析雜志， 2013， 33（12）: 2141-2147.

Simultaneous Determination of 13 Illegally Added Chemical Drugs in Hypoglycemic Health Foods by Ultra Performance Liquid Chromatography

LIN Fang， LI Tao*， WANG Yixin， ZHANG Li， LIU Haijing
（Shaanxi Institute for Food and Drug Control， Xi’an 710065， China）

An ultra performance liquid chromatography （UPLC） method was developed for the simultaneous determination of 13 illegally added chemical drugs （metformin hydrochloride，buformin hydrochloride， phenformin hydrochloride，tolbutamide， glipizide， gliclazide， glibornuride， rosiglitazone hydrochloride， glibenclamide， pioglitazone hydrochloride，glimepiride， repaglinide and gliquidone） in hypoglycemic health foods. Samples were extracted by using methanol. ZORBAX SB-C18column was applied with a mobile phase consisting of acetonitrile and 0.02 mol/L ammonium acetate by gradient elution at a flow rate of 0.2 mL/min. The illegally added chemical drugs were detected by a photodiode array detector and a chromatogram with detection wavelength of 235 nm was used for screening and quantification. The results were then confirmed by comparison with the spectra of 13 reference substances. It was shown that the 13 anti-diabetic agents could be effectively separated within 30 min. The correlation coefficients were all above 0.999 over the concentration range of 0.3-90 μg/mL. The average recoveries ranged from 83.2% to 108.9% with relative stand deviations （RSDs） all below 5.5%. The limits of detection （LODs） were all in the range of 0.2 to 0.6 ng. This method has the advantages of simple pre-treatment， fast detection， satisfactory recovery rate and good reproducibility， and it is suitable for the simultaneous determination of the 13 anti-diabetic agents and can be used as a reference in the detection of the illegally added chemical drugs in hypoglycemic health foods.

health foods； anti-diabetic drugs； illegally added； ultra performance liquid chromatography

10.7506/spkx1002-6630-201618029

O657.72

A

1002-6630（2016）18-0178-07

林芳， 李濤， 王一欣， 等. 超高效液相色譜法同時測定降糖類保健食品中非法添加的13 種化學(xué)藥物［J］. 食品科學(xué)， 2016，37（18）: 178-184. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618029. http://www.spkx.net.cn

LIN Fang， LI Tao， WANG Yixin， et al. Simultaneous determination of 13 illegally added chemical drugs in hypoglycemic health foods by ultra performance liquid chromatography［J］. Food Science， 2016， 37（18）: 178-184. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618029. http://www.spkx.net.cn

2016-03-14

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程項(xiàng)目（2014FWPT-01）

林芳（1982—），女，主管藥師，碩士，研究方向?yàn)槭称?、保健食品理化檢驗(yàn)及安全性檢測。E-mail：fanqiehuayuan@126.com

李濤（1978—），男，副主任藥師，學(xué)士，研究方向?yàn)槭称芳氨＝∈称窓z驗(yàn)。E-mail：westyx@126.com