馮文婕 趙粼 闕斐

摘要：以魚鱗為原料，經(jīng)過(guò)粉碎、脫雜蛋白、脫礦物質(zhì)等預(yù)處理，采用酸酶合解法提取膠原蛋白。結(jié)果表明，以0.1 mol/L NaCl脫雜蛋白，0.3 mol/L EDTA脫礦物質(zhì)，檸檬酸和胃蛋白酶為提取介質(zhì)有利于膠原蛋白的提??；影響魚鱗膠原蛋白提取效率的主要因素分別為檸檬酸濃度、酶用量、提取時(shí)間，為保證蛋白質(zhì)不變性，最佳的提取工藝，檸檬酸濃度為3%、酶用量為魚鱗質(zhì)量的7%、提取時(shí)間6 h、提取溫度25 ℃（室溫），此時(shí)羥脯氨酸的提取量為2.395 μg/g。表明采用酸酶復(fù)合法進(jìn)行膠原蛋白的制備，不僅可以保證膠原蛋白的完整性，還有助于提高其產(chǎn)率。

關(guān)鍵詞：魚鱗；膠原蛋白；提??；酸酶復(fù)合法

中圖分類號(hào)：S986.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）05-1242-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.05.039

Optimization of Extraction Collagen from Scales Using Acid

and Enzymatic Composite Process

FENG Wen-jie，ZHAO Lin，QUE Fei

（Zhejiang Economic & Trade Polytechnic， Hangzhou 310018， China）

Abstract：Fish scales were used as raw material to extract collagen with acid and enzymatic composite process after pretreatment. The optimal solvent for removing impurity proteins and mineral impurities from fish scales respectively with 0.1 mol/L NaCl and 0.3 mol/L EDTA. The main factors affecting the efficiency of the extraction of collagen were respectively： citric acid concentration， enzyme dosage and Time. To ensure the invariance of protein， the optimal parameters for extraction were 3% citrate acid，amount of enzyme on the basis of 7% the weight of fish scales for 6 h at 25 ℃（room temperature）. Under these conditions，the extraction amount of hydroxyproline was up to 2.395 μg/g. Extraction collagen from scales using acid and enzymatic composite process，which not only ensure the integrity of collagen， but also helps to improve the yield.

Key words： scale； collagen； extraction； acid and enzymatic composite process

中國(guó)淡水魚產(chǎn)量約占全國(guó)水產(chǎn)總量的60%左右，近年來(lái)，中國(guó)淡水魚養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展的同時(shí)也帶動(dòng)了水產(chǎn)加工業(yè)規(guī)模的不斷提高，這也就意味著養(yǎng)殖產(chǎn)量較高的低值淡水魚加工品的比例將越來(lái)越大，其加工下腳料如魚鱗、魚皮等也將逐年增長(zhǎng)[1]。研究表明，淡水魚魚鱗、魚皮中含有豐富的膠原蛋白，在化妝品、生物醫(yī)學(xué)材料以及食品添加劑等領(lǐng)域均具有潛在的開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值[2-4]。

膠原蛋白是結(jié)締組織中極其重要的一種結(jié)構(gòu)蛋白，廣泛存在于動(dòng)物的骨、腱、肌鞘、韌帶、肌膜、軟骨和皮膚中。膠原蛋白的提取方法對(duì)如何獲取高活性、高產(chǎn)率的膠原產(chǎn)品具有至關(guān)重要的影響。目前，國(guó)外從海洋魚類魚鱗中提取膠原蛋白的工藝已較成熟，其膠原蛋白的提取率達(dá)到了25%～55%，并已運(yùn)用于工業(yè)化生產(chǎn)[5]。而國(guó)內(nèi)有關(guān)魚鱗中提取膠原蛋白的研究還處于起始階段。目前，國(guó)內(nèi)針對(duì)淡水魚中膠原蛋白的提取工藝和提取方法主要有酸提法、酶解法等[6-8]。酸提法與酶解法相比，成本低，但周期長(zhǎng)，膠原蛋白得率也低；用酶解法雖可以提高膠原蛋白的得率，但一般用酶量大、條件劇烈。采用酸酶復(fù)合法進(jìn)行膠原蛋白的制備，可保證較高產(chǎn)率的同時(shí)，縮短周期，減少酶的用量，更好地保證魚鱗膠原蛋白中多肽的功能性[9，10]。本試驗(yàn)以魚鱗為原料，經(jīng)過(guò)粉碎、脫雜蛋白、脫鈣礦物質(zhì)等預(yù)處理，采用酸酶合解法優(yōu)化魚鱗膠原蛋白提取工藝，為中國(guó)淡水魚魚鱗膠原蛋白的開發(fā)和應(yīng)用提供可以借鑒的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮魚鱗（市售鯽魚的新鮮魚鱗）；羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（上海時(shí)代生物科技有限公司）；氯胺T（上海譜振生物科技有限公司）；二甲氨基苯甲醛（上海紫一試劑廠）；動(dòng)物胃蛋白酶（南寧龐博生物工程有限公司）；EDTA（上海德穎生物科技有限公司，分析純）；檸檬酸（上海瑞特良化工有限公司，分析純）。

高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（FW-80型，北京紫光儀器儀表銷售有限公司），高速離心機(jī)（LG10-24A型，北京京立離心機(jī)有限公司），電子天平（SPS202F型，梅特勒-托利多稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 膠原蛋白制備工藝的流程 魚鱗洗凈→烘干、粉碎→氯化鈉脫雜蛋白→去離子水洗凈、過(guò)濾→EDTA脫鈣→去離子水洗凈、過(guò)濾→恒溫水浴鍋中酸酶復(fù)合法提取膠原蛋白。

1.2.2 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 通過(guò)測(cè)定膠原蛋白特征氨基酸——羥脯氨酸（Hyp）的含量，間接評(píng)價(jià)膠原蛋白的提取效果。將Hyp標(biāo)準(zhǔn)液經(jīng)氯胺T氧化后，與顯色劑二甲氨基苯甲醛反應(yīng)生成紅色化合物，在560 nm處測(cè)定其吸光度。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取50 mg羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用去離子水溶解，加一滴3 mol/L硫酸溶液，用去離子水定容。

移取5.00 mL上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至500 mL容量瓶中，用去離子水定容。分別移取該溶液0、10.00、20.00、30.00、40.00 mL于100 mL的容量瓶中，用去離子水定容，所得標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度依次為0、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/mL，空白用去離子水作對(duì)照，分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)液1 mL 加入1 mL 檸檬酸緩沖液和1 mL 0.05 mol/L 氯胺T溶液，室溫（25 ℃）氧化10 min 后，加入高氯酸1 mL（3.5 mol/L），放置10 min，加入對(duì)二甲基氨基苯甲醛試劑1 mL，在65 ℃水浴顯色10 min，冷卻后在560 nm處測(cè)定其吸光度，以羥脯氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程。

1.2.3 羥脯氨酸含量的測(cè)定 吸取10 mL提取液，按照“1.2.2”的方法測(cè)定提取液中羥脯氨酸的含量，以此表征膠原蛋白的提取效果。

1.2.4 雜蛋白脫除工藝的優(yōu)化 采用NaCl溶液作為脫雜劑，進(jìn)行脫雜蛋白處理。精確稱取1 g魚鱗，加入NaCl溶液，浸泡一定時(shí)間后，吸取脫雜上清液，分別測(cè)定其在280 nm 和560 nm處的吸光度[1]，比較在不同濃度NaCl、脫雜溫度、脫雜時(shí)間、料液比（魚鱗∶NaCl溶液，m∶m，下同）等條件下，NaCl脫除雜蛋白的效果和膠原蛋白的流失情況。

1.2.5 礦物質(zhì)脫除工藝的優(yōu)化 采用EDTA溶液作為脫雜劑，進(jìn)行脫除礦物質(zhì)處理。精確稱取1 g魚鱗，加入EDTA溶液，浸泡一定時(shí)間后，吸取脫雜上清液，測(cè)定脫雜液中鈣的含量和羥脯氨酸的溶出量。比較在不同濃度EDTA、脫雜溫度、脫雜時(shí)間、料液比等條件下，EDTA脫除礦物質(zhì)雜質(zhì)的效果和膠原蛋白的流失情況。

1.2.6 酸酶復(fù)合法提取魚鱗膠原蛋白工藝的優(yōu)化 分別稱取1 g魚鱗，在20 ℃下用10 mL 0.1 mol/L的NaCl溶液浸泡2 h，用去離子水洗凈瀝干，在20 ℃下用20 mL 0.3 mol/L的EDTA溶液浸泡3 h，再用去離子水洗凈瀝干后，在不同濃度檸檬酸、酶用量、提取時(shí)間、提取溫度條件下，利用酸酶復(fù)合法提取魚鱗中的膠原蛋白，以提取液中羥脯氨酸的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳提取工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)比色法測(cè)定不同濃度Hyp標(biāo)樣的吸光度，以Hyp標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)，測(cè)定的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，其回歸方程為y=0.208 8x+0.01 7，R2=0.999 3，表明當(dāng)羥脯氨酸濃度在0～2.0 μg/mL之間時(shí)，與吸光度值具有良好的線性關(guān)系。

2.2 魚鱗中雜蛋白脫除工藝的優(yōu)化

魚鱗中的蛋白質(zhì)占總重量的70%，主要為膠原蛋白和魚鱗角蛋白兩大類，在提取膠原蛋白時(shí)需要先將魚鱗中的其他雜蛋白去除，以提高提取效率。

以NaCl濃度、脫雜溫度、脫雜時(shí)間、料液比為因素，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)分析，結(jié)果如表1所示。表1中280 nm處測(cè)得的吸光度表征雜蛋白的溶出量，560 nm處測(cè)得的吸光度表征羥脯氨酸的溶出量，可以看出脫雜因素對(duì)脫雜效果的影響大小順序?yàn)榱弦罕?、脫雜溫度、脫雜時(shí)間、NaCl濃度，綜合分析選擇料液比1∶10、脫雜溫度20 ℃、脫雜時(shí)間2 h、NaCl濃度0.1 mol/L為最佳雜蛋白的脫除工藝條件，此時(shí)的雜蛋白脫除率較高，且羥脯氨酸的溶出量也相對(duì)較低。

2.3 魚鱗中礦物質(zhì)脫除工藝的優(yōu)化

魚鱗具有富集周圍環(huán)境中重金屬的作用，在提取膠原蛋白之前要去除魚鱗中的金屬離子（以鈣離子含量最高）。因?yàn)镋DTA具有螯合大部分金屬離子的作用，選擇EDTA來(lái)脫除礦物質(zhì)，以EDTA濃度、脫雜溫度、脫雜時(shí)間、料液比為因素，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)分析，結(jié)果如表2所示。以脫除液中的鈣含量表征EDTA脫除礦物質(zhì)雜質(zhì)的效率，用560 nm處測(cè)得的吸光度表征羥脯氨酸的溶出量。從表2中可以看出，各因素對(duì)魚鱗中礦物質(zhì)脫除效果的影響大小順序?yàn)榱弦罕?、EDTA濃度、脫雜時(shí)間、脫雜溫度，綜合分析選擇料液比1∶30、提取溫度20 ℃、脫雜時(shí)間3 h、EDTA濃度0.3 mol/L為最佳礦物質(zhì)的脫除工藝條件，此時(shí)不但礦物質(zhì)的脫除率較高，且羥脯氨酸的溶出量也相對(duì)較低。

2.4 檸檬酸濃度對(duì)酸酶復(fù)合法提取魚鱗膠原蛋白效果的影響

將經(jīng)過(guò)脫雜預(yù)處理的魚鱗樣品分別加入1%、3%、5%、7%的檸檬酸，再加5%魚鱗質(zhì)量的胃蛋白酶，置于30 ℃恒溫水浴中反應(yīng)5 h后，測(cè)定提取液中羥脯氨酸含量，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，隨著檸檬酸濃度的增加，膠原蛋白的提取效率（用羥脯氨酸提取量來(lái)表征，下同）先增加后下降，酸濃度的增加有利于膠原蛋白的溶出，但是過(guò)高的酸濃度可能導(dǎo)致膠原蛋白分子結(jié)構(gòu)的變化，提取效率反而降低，因此，選擇檸檬酸濃度為3%。

2.5 酶用量對(duì)酸酶復(fù)合法提取魚鱗膠原蛋白效果的影響

將經(jīng)過(guò)脫雜預(yù)處理的魚鱗樣品分別加入3%、5%、7%、9%魚鱗質(zhì)量的胃蛋白酶，3%的檸檬酸溶液，置于30 ℃恒溫水浴中反應(yīng)5 h后，測(cè)定提取液中羥脯氨酸含量，其結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，隨著酶用量的增加，膠原蛋白的提取效率逐漸增加，說(shuō)明酶的加入有利于膠原蛋白的溶出，但當(dāng)酶用量大于7%以后再增加酶用量，提取效率變化不大，因此選擇最佳的酶使用量為魚鱗質(zhì)量的7%。

2.6 溫度對(duì)酸酶復(fù)合法提取魚鱗膠原蛋白效果的影響

將經(jīng)過(guò)脫雜預(yù)處理的魚鱗樣品加入3%的檸檬酸溶液、5%魚鱗質(zhì)量的胃蛋白酶，分別置于20、25、30、40 ℃的恒溫水浴中反應(yīng)5 h后，測(cè)定提取液中羥脯氨酸含量，結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，隨著提取溫度的升高膠原蛋白提取效率總體呈上升趨勢(shì)，但由于淡水魚魚鱗膠原蛋白的變性溫度一般低于30 ℃，為保證膠原蛋白的生物活性，選擇25 ℃為適宜的提取溫度。

2.7 時(shí)間對(duì)酸酶復(fù)合法提取魚鱗膠原蛋白效果的影響

將經(jīng)過(guò)脫雜預(yù)處理的魚鱗樣品加入3%的檸檬酸溶液、5%魚鱗質(zhì)量的胃蛋白酶，置于25 ℃恒溫水浴中分別反應(yīng)2、3、4、5、6、8 h后，測(cè)定提取液中羥脯氨酸含量，結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，隨著提取時(shí)間的增加，膠原蛋白提取效率隨之上升，當(dāng)提取時(shí)間大于6 h時(shí)，提取效率變化不大。因此，選擇適宜的提取時(shí)間為6 h。

2.8 酸酶復(fù)合法提取魚鱗膠原蛋白的正交試驗(yàn)結(jié)果

以檸檬酸濃度、酶用量、提取時(shí)間為酸酶復(fù)合法提取魚鱗膠原蛋白的影響因素，進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)分析，結(jié)果如表3所示，表中以羥脯氨酸的提取量表征酸酶復(fù)合法提取膠原蛋白的效率。從表3可以看出，酸酶復(fù)合法提取膠原蛋白的工藝中各因素對(duì)膠原蛋白提取效果的影響大小順序是檸檬酸濃度、酶用量、提取時(shí)間。

結(jié)合單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)分析，酸酶復(fù)合法提取膠原蛋白的最佳提取工藝條件：檸檬酸濃度為3%、酶用量為魚鱗質(zhì)量的7%、提取時(shí)間6 h、提取溫度25 ℃（室溫），此時(shí)羥脯氨酸的提取量為2.395 μg/g。

3 討論

提取魚鱗中膠原蛋白時(shí)最常遇到的問(wèn)題就是提取效率較低，其主要原因一是魚鱗組織在生長(zhǎng)時(shí)，膠原蛋白與蛋白多糖和糖蛋白的特異親和性，使膠原蛋白呈不溶性；二是組織生長(zhǎng)過(guò)程中，膠原分子間形成纖維化連接，或膠原蛋白分子與其他成分之間形成共價(jià)鍵[一般位于膠原分子N及C端的非膠原（端肽）部分]，阻礙了膠原蛋白的提取[11，12]。為提高膠原蛋白的提取效率可以從兩個(gè)方面優(yōu)化其工藝，一方面是通過(guò)對(duì)提取原料的脫雜處理，去除雜蛋白及礦物質(zhì)（鈣）雜質(zhì)等。魚鱗中膠原纖維分子間和分子內(nèi)交聯(lián)的共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵使其結(jié)構(gòu)很穩(wěn)定，需進(jìn)行前處理以打破上述穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，使膠原分子得以釋放，同時(shí)除去魚鱗中的雜蛋白。常用的脫雜蛋白脫除劑主要有NaOH、NaCO3和NaCl，浸泡液堿性越高對(duì)雜蛋白的脫除效果越好，但過(guò)高的濃度反而會(huì)使魚鱗中的膠原蛋白發(fā)生溶解，從而造成損失[1，13]。本試驗(yàn)采用NaCl脫雜，既能保證有效地脫除雜蛋白，又能保證膠原蛋白的流失率相對(duì)較低；魚鱗主要由表層的鈣化層和內(nèi)部的膠原纖維層構(gòu)成，為提取魚鱗膠原蛋白，首先要脫除魚鱗表面的鈣化層，脫鈣方法主要有鹽酸脫鈣法和EDTA脫鈣法[14-16]，使用鹽酸脫鈣會(huì)造成膠原蛋白的大量損失[17]，本試驗(yàn)選用EDTA脫鈣，既保證鈣雜質(zhì)的脫除，又能保證較少的膠原蛋白損失。

另一方面是優(yōu)化提取方法，目前，膠原蛋白的提取方法主要有以下4種，即熱水提取法、鹽法、酸法和酶法，這些方法繁瑣、時(shí)間長(zhǎng)、成本高[18]。有研究用酶解法與熱水提取法結(jié)合、酸法與熱水提取法相結(jié)合等方法來(lái)提高提取率，但膠原蛋白在高溫下容易變性，在40 ℃下容易導(dǎo)致三螺旋結(jié)構(gòu)破壞，60 ℃容易導(dǎo)致某些共價(jià)鍵斷裂分解，造成損失[19-21]；也有研究采用超高壓熱水提取法，但設(shè)備昂貴，設(shè)備容積小，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化[22]。本試驗(yàn)采用檸檬酸結(jié)合胃蛋白酶的方法進(jìn)行膠原蛋白的制備，經(jīng)濟(jì)便捷，酸提取可將沒有交聯(lián)的膠原分子溶解出來(lái)，也可溶解含有醛胺類交聯(lián)鍵的膠原纖維，常用的酸有檸檬酸、乙酸、鹽酸、乳酸和磷酸等，檸檬酸酸性適中，而且滿足食品等工業(yè)加工的需求；酶提取可使不溶于酸溶液的相互交聯(lián)的膠原分子分散為可溶性的膠原單分子或相對(duì)細(xì)小的膠原微纖維，同時(shí)還可以切斷端肽的共價(jià)鍵，使膠原分子的螺旋結(jié)構(gòu)完整地保留下來(lái)。本試驗(yàn)采用酸酶復(fù)合法制備膠原蛋白，不僅可以保證膠原蛋白的完整性，還有助于提高其產(chǎn)率。

由于魚鱗膠原蛋白對(duì)熱不穩(wěn)定，高溫下易變性，且呈現(xiàn)出魚種特異性，即暖水性魚類的魚鱗膠原蛋白比冷水性魚類的變性溫度略高，這在提取不同魚類魚鱗膠原蛋白時(shí)需要特別注意。

4 小結(jié)

以魚鱗為原料通過(guò)NaCl脫除雜蛋白，EDTA脫除礦物質(zhì)，然后再以檸檬酸和胃蛋白酶為提取介質(zhì)提取膠原蛋白。研究表明，NaCl既能保證有效地脫除雜蛋白，又能保證膠原蛋白的溶出量相對(duì)較低；EDTA既能保證鈣雜質(zhì)的脫除，又能保證較少的膠原蛋白損失；將檸檬酸和胃蛋白酶結(jié)合提取膠原蛋白，不僅可以保證膠原蛋白的完整性，還有助于提高產(chǎn)率，且影響魚鱗膠原蛋白提取效率的主要因素分別為檸檬酸濃度、酶用量、提取時(shí)間。

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