ICA—HPLC檢測枸杞中赭曲霉毒素A提取方法的比較

劉海波　劉建利　賈沙

摘要：對免疫親和柱-高效液相色譜法（ICA-HPLC）測定枸杞中赭曲霉毒素A（OTA）的提取方法進(jìn)行研究。對4種提取液[0.1 mol/L正磷酸 ∶ 甲醇 ∶ 水（1 ∶ 10 ∶ 4），0.1 mol/L 正磷酸 ∶ 甲醇（1 ∶ 10），甲醇 ∶ 水（4 ∶ 1），2% NaHCO3 ∶ 15% NaCl（1 ∶ 1）]提取下枸杞干果中OTA含量的回收率進(jìn)行對比和差異性分析，對最佳方法做準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)，并用此方法檢測寧夏市場枸杞OTA污染情況。結(jié)果顯示，0.1 mol/L 正磷酸 ∶ 甲醇（1 ∶ 10）為最佳提取液，回收率為615%～77.19%，變異系數(shù)為2.22%～2.83%；以0.1 mol/L正磷酸 ∶ 甲醇（5 ∶ 50）為提取液、ICA-HPLC法測定枸杞干果中OTA方法穩(wěn)定、可靠；寧夏市場枸杞OTA檢測結(jié)果顯示不存在污染。

關(guān)鍵詞：寧夏枸杞；赭曲霉毒素A；免疫親和柱；高效液相色譜法

中圖分類號： S567.1+90.1；R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0347-03

赭曲霉毒素A（OTA）是一類真菌毒素，主要由赭曲霉（Aspergillus ochraceus）和純綠青霉（Penicillium viridicatum）產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，對人及多種動物具有腎臟毒性、肝臟毒性、免疫毒性、致畸毒性和致癌性，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)IARC將其確定為2B類致癌物[1-4]。OTA污染范圍較廣，可污染糧食谷物、蔬果、干果、調(diào)味劑、啤酒、葡萄酒及中草藥材等，嚴(yán)重影響人們的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食品安全[5]。

寧夏拘杞已有600多年的栽培歷史，全區(qū)枸杞種植面積2.97萬hm2，枸杞產(chǎn)品種類主要有枸杞干果、枸杞鮮果、枸杞鮮汁、枸杞粉、枸杞酒等[6]。由于枸杞具有多糖、含水率高、表皮有蠟質(zhì)層等特性，使得枸杞鮮果制干時(shí)間較長，致使其易發(fā)生霉變。研究表明，一般情況下，采摘后的枸杞鮮果不經(jīng)任何處理，3 d后霉變可高達(dá)50%～80%，嚴(yán)重影響枸杞干果的產(chǎn)量和質(zhì)量[7-8]。目前，關(guān)于 OTA 純化和測定方法的研究已經(jīng)較為深入，但現(xiàn)有的提取方法很多，不同樣品提取方法不盡相同，目前枸杞干果中OTA的研究未見報(bào)道，因此建立一種枸杞干果中OTA的提取方法具有重要意義。

本研究采用有機(jī)溶劑和碳酸氫鈉等溶液為提取液提取枸杞干果中的OTA，從回收率、精密度、準(zhǔn)確度等角度進(jìn)行分析，找出一種簡便高效的提取枸杞干果中OTA的方法，為寧夏枸杞安全生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

固相萃取裝置（美國Varian）；CY-200電動粉碎機(jī)（臺州市新恩精密量儀器有限公司）；赭曲霉毒素免疫親和柱 IC CF-04 （北京泰樂祺科技有限公司）；高效液相色譜儀（Agilent Technologies 1200Series，美國 Agilent）；熒光檢測器（Agilent Technologies 1200Series，美國 Agilent）；反相C18柱（pH值2～12，美國 Agilent）；Empower Software色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國 Agilent）；微量移液槍（德國Eppendorf）。

1.2 試劑

OTA 標(biāo)準(zhǔn)品（純度>99 %，F(xiàn)ermentek公司）；乙腈和甲醇（色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；其他試劑均為化學(xué)純。

OTA 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：1 mg OTA 標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇完全溶解，定容至50 mL（濃度20 μg/mL，-20 ℃避光保存）。

OTA 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：取2.5 mL OTA 標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇定容至50 mL（濃度1 μg/mL，4 ℃避光保存）。

樣品：寧夏枸杞干果購自銀川市同心路枸杞批發(fā)市場。

1.3 方法

樣品準(zhǔn)備（粉碎、稱量、加標(biāo)）→提取→免疫親和柱凈化→高效液相色譜儀檢測。

1.3.1 提取 用粉碎機(jī)將干燥后的枸杞干果粉碎，取粉碎后的枸杞樣品25 g，分別加入100 mL 0.1 mol/L正磷酸 ∶ 甲醇 ∶ 水（1 ∶ 10 ∶ 4）[9-10]、0.1 mol/L正磷酸 ∶ 甲醇（1 ∶ 10）[11-12]、甲醇 ∶ 水（4 ∶ 1）[13，15]、2% NaHCO3 ∶ 15% NaCl（1 ∶ 1）[16-19]等4種提取液，高速攪拌3min，15 000 r/min離心10 min，上清液用1.2 μm濾膜過濾，取15 mL濾液用001 mol/L PBS稀釋定容至100 mL，即為OTA提取液。

1.3.2 凈化 免疫親和柱凈化方法參照孫林超等的方法[14-15]，并適當(dāng)修改：（1）ICA柱活化。冰箱中取出免疫親和柱使之恢復(fù)到室溫，流盡保護(hù)液，使2～3 mL空氣通過柱體。（2）上樣。取20 mL OTA提取液過柱，流速控制在20～30滴/min。（3）淋洗。先用5 mL PBS（pH值7.2～7.4）淋洗，再用5 mL超純水淋洗，棄去洗脫液，使2～3 mL空氣通過柱體。（4）洗脫。用6 mL甲醇分3次洗脫（每次加入2 mL甲醇后孵育5 min再進(jìn)行洗脫）。合并洗脫液用氮?dú)獯蹈?，? mL色譜流動相溶解，0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾至樣液瓶中，供HPLC檢測。

1.3.3 HPLC-FD檢測方法 色譜條件：參考AOAC2001方法[19-20]。反相C18柱（Eclipse XDB-C18分析柱，5 μm，4.6 mm×150 mm）；流動相為乙腈 ∶ 雙重水 ∶ 冰乙酸=99 ∶ 99 ∶ 2，pH值=3.2；流速1.0 mL/min；熒光檢測條件為激發(fā)波長330 nm，發(fā)射波長460 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.4 加標(biāo)回收率計(jì)算方法

回收率=（加標(biāo)樣品測定值-空白樣品測定值）/理論加標(biāo)濃度×100%。

1.3.5 OTA含量計(jì)算公式

X=A×C×VAm×m

式中：X為寧夏枸杞子中OTA含量，ng/g；A為樣液OTA峰面積；Am為標(biāo)準(zhǔn)液OTA峰面積；C為標(biāo)準(zhǔn)液OTA的濃度，ng/mL；V為處理后的最終樣液體積，mL；m為最終樣液相當(dāng)?shù)脑嚇淤|(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍和檢測限

取OTA標(biāo)準(zhǔn)工作液，以流動相為溶劑，分別配制濃度為2、3、5、10、20、60、100 ng/mL的OTA標(biāo)準(zhǔn)液，按高效液相色譜法條件進(jìn)行檢測，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)濃度分別檢測5次，取平均值。以峰面積對OTA質(zhì)量濃度C（ng/mL）進(jìn)行回歸分析，線性方程為y=1.311 4x+0.286 3，相關(guān)系數(shù)r2=0.999 0，結(jié)果表明OTA在2.0～100.0 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（圖1）。OTA標(biāo)品的保留時(shí)間為7.023 min（圖2）。以3倍信噪比確定最低檢出限為0.27 ng/mL。

2.2 不同提取液結(jié)果比較

稱取25 g枸杞樣品，加入OTA標(biāo)準(zhǔn)工作液（1 μg/mL）50 μL，分別采用4種提取液提取，采用ICA-HPLC檢測，重復(fù)3次，結(jié)果見表1，以正磷酸 ∶ 甲醇（1 ∶ 10）為提取液回收率最高，達(dá)77.19%，變異系數(shù)最低，達(dá)2.25%，比以正磷酸 ∶ 甲醇 ∶ 水（1 ∶ 10 ∶ 4）、甲醇 ∶ 水（4 ∶ 1）、2% NaHCO3 ∶ 15% NaCl（1 ∶ 1）為提取液回收率分別高043、2793、3607百分點(diǎn)；結(jié)果表明正磷酸 ∶ 甲醇（1 ∶ 10）為最佳提取液；不同測定方法之間存在顯著差異（P>0.05），說明提取方法影響回收率的測定。因此，后續(xù)試驗(yàn)中提取液均采用正磷酸 ∶ 甲醇（1 ∶ 10）。

2.3 精密度試驗(yàn)

制備加標(biāo)濃度為2 ng/g的加標(biāo)樣品，用正磷酸 ∶ 甲醇（1 ∶ 10）提取，采用ICA-HPLC法檢測，重復(fù)3次，平均回收率為77.19%，標(biāo)準(zhǔn)差為1.74 ng/g，變異系數(shù)為2.25%（表2），說明該方法精密度高，穩(wěn)定性和重復(fù)性滿足要求。

2.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

制備加標(biāo)濃度為1、2、5 ng/g 的加標(biāo)樣品，用正磷酸 ∶ 甲醇（1 ∶ 10）提取，采用ICA-HPLC檢測，重復(fù)3次，回收率為61.5%～77.19%，變異系數(shù)為2.22%～2.83%（表3），說明該方法回收率高，準(zhǔn)確度能滿足試驗(yàn)要求。

2.5 寧夏枸杞中OTA含量測定

隨機(jī)抽取10份不同品種的市售寧夏枸杞進(jìn)行檢測，結(jié)果均未測得OTA存在，圖4為市售樣品“寧夏枸杞”的檢測色譜圖示。

3 結(jié)論與討論

提取是OTA測定的重要步驟之一，不僅要依據(jù)OTA的理化性質(zhì)選擇不同的提取試劑，同時(shí)還要考慮樣品性質(zhì)。OTA溶于極性溶劑和稀碳酸氫鈉溶液，微溶于水[3]，因此本試驗(yàn)選擇甲醇、稀碳酸氫鈉溶液等作為提取溶劑。本試驗(yàn)4種提取方法中得到的OTA回收率略低，原因可能與枸杞性質(zhì)和免疫親和柱凈化有關(guān)。首先枸杞的基質(zhì)非常復(fù)雜，OTA可以與基質(zhì)中的大分子如糖類、纖維素、蛋白質(zhì)等結(jié)合，從而導(dǎo)致提取過程中OTA損失較大；其次凈化是OTA進(jìn)行HPLC檢測的重要前提，對于少量OTA的基質(zhì)凈化，免疫親和萃取凈化法是目前較好的方法[14]。免疫親和柱具有高度特異性的優(yōu)點(diǎn)，使用時(shí)不需要活化，但是上樣液中有機(jī)溶劑含量要嚴(yán)格控制，甲醇體積分?jǐn)?shù)不得超過20%，否則將影響OTA抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)[16]。另外，在甲醇提取過程中，一些與赭曲霉毒素結(jié)構(gòu)相似的有機(jī)小分子諸如黃酮、色素、芳香物質(zhì)等也被提取出來，這些物質(zhì)可能會與抗原OTA競爭抗體上的結(jié)合位點(diǎn)，從而影響免疫親和柱凈化的回收效率，因此在保證較高凈化純度的同時(shí)回收率可能就不太理想，從加標(biāo)樣的色譜圖中就可以反映出這一點(diǎn)。

本研究中對寧夏市場枸杞樣品進(jìn)行檢測，均未檢出OTA，可能是因?yàn)楣r(nóng)在鮮枸杞制干過程中采用含NaOH、乙醇、Na2CO3、對羥基苯甲酸乙酯及其鈉鹽、對羥基苯甲酸丙酯鈉、過氧化氫和二氧化氯等成分的促干劑、脫蠟劑、防霉劑等，抑制了包括產(chǎn)OTA真菌在內(nèi)的果棲霉菌的生長[7-8]；或商品加工包裝過程中枸杞經(jīng)過嚴(yán)格分揀，去除霉變的枸杞。

正磷酸 ∶ 甲醇（1 ∶ 10）溶液作為提取液采用ICA-HPLC檢測枸杞干果中OTA的效果最好，并且研究方法穩(wěn)定、可靠。對寧夏市場枸杞進(jìn)行OTA檢測，均未檢測到OTA污染。

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