鐘正丹　何義國(guó)　趙興秀

摘要：采用稀釋涂布法結(jié)合革蘭氏染色、紙層析法從四川瀘州老窖濃香型白酒酒糟中分離乳酸菌，通過測(cè)定抗脂質(zhì)過氧化率、超氧陰離子清除率、DPPH自由基清除率系統(tǒng)評(píng)價(jià)篩選的12株乳酸菌的抗氧化能力，旨在篩選出高抗氧化活性的乳酸菌，為天然抗氧化劑的開發(fā)及乳酸菌在功能性食品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)，并對(duì)其中1株抗氧化活性較高的4#菌株進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化。結(jié)果表明：共得到12株乳酸菌，其中4#菌株在上述3種評(píng)價(jià)體系中均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力。對(duì)菌株4#進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化，其結(jié)果為牛肉膏20 g/L、葡萄糖15 g/L、pH值6，裝液量為60 mL，且優(yōu)化后4#菌株抗氧化能力提高了43.73百分點(diǎn)，這將為抗氧化菌株的進(jìn)一步應(yīng)用以及抗氧化產(chǎn)品的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：酒糟；乳酸菌；抗氧化；培養(yǎng)基優(yōu)化

中圖分類號(hào)： TS261.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0533-04

乳酸菌廣泛存在于泡菜、食醋、白酒、乳制品等發(fā)酵食品中，可改善食品風(fēng)味，為發(fā)酵食品提供豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，提高食品附加值。有大量研究表明，乳酸菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群、降低膽固醇、抑菌、抗癌、抗衰老、抗氧化等多種生理功能[1]。消費(fèi)者對(duì)食品安全和食品生理功能日益關(guān)注，而乳酸菌具有天然無毒、保健益生等特性[2]，是一種天然抗氧化劑，這使其抗氧化能力研究成為食品工業(yè)的重點(diǎn)與熱點(diǎn)[3]。

在食品科學(xué)領(lǐng)域，抗氧化乳酸菌可防止食品中油脂酸敗，清除自由基從而阻止自由基連鎖反應(yīng)。研究表明，機(jī)體內(nèi)自由基與機(jī)體衰老、癌癥、心血管等疾病[4-5]也密切相關(guān)，開發(fā)抗氧化產(chǎn)品對(duì)抗衰老、預(yù)防疾病有著重要意義。目前，已有研究者針對(duì)抗氧化乳酸菌的篩選、體內(nèi)外試驗(yàn)、作用機(jī)制[6-7]、有效成分等方面進(jìn)行了相應(yīng)研究。如張書文通過體外試驗(yàn)篩選抗氧化乳酸菌進(jìn)行抗氧化效果研究[8]；劉天祎等從泡菜汁、鵝腸等原料中篩得2株抗氧化活性較高的干酪乳桿菌[9]。但對(duì)于抗氧化乳酸的研究仍處于初級(jí)階段，應(yīng)用范圍還有待擴(kuò)展。目前，抗氧化乳酸菌主要用于酸奶、抗氧化劑等方面，而在保健食品、酒類及飲料、化妝品等行業(yè)仍須不斷地開發(fā)及創(chuàng)新。

本研究從四川瀘州老窖濃香型白酒酒糟中分離抗氧化乳酸菌，以抗脂質(zhì)過氧化率、超氧陰離子清除率、DPPH自由基清除率評(píng)價(jià)菌株抗氧化能力，得到抗氧化能力較強(qiáng)的乳酸菌，并可適應(yīng)白酒生產(chǎn)過程中復(fù)雜的環(huán)境，這將對(duì)于抗氧化酒品及其乙醇飲料開發(fā)創(chuàng)新有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃香型白酒酒糟由四川瀘州老窖股份有限公司提供。

吐溫-80、氯化鈉、葡萄糖、瓊脂粉、正丁醇、焦性沒食子酸、三羥甲基氨基甲烷等均為分析純（成都市科龍化工試劑廠）；硫代巴比妥酸（上?？曝S化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 試驗(yàn)儀器

55i+Ds-5M-UI正置生物顯微鏡（日本SONY公司）；UV2400紫外可見分光光度計(jì)（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；UP400S手提式超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新生物科技有限公司）；FL-2可調(diào)式封閉電爐（北京市永光明醫(yī)療器械有限公司）。

1.3 培養(yǎng)基

MRS固體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫-80 1.0 mL，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳 0.25 g，瓊脂18.0 g，用蒸餾水補(bǔ)足至1 L，pH值6.5。

初始培養(yǎng)基：蛋白胨25 g/L，葡萄糖20 g/L，檸檬酸氫二鈉2 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，乙酸鈉5 g/L，硫酸錳0.28 g/L，硫酸鎂0.58 g/L，吐溫-80 1 mL/L，裝液量50 mL（250 mL三角瓶），pH值6.5。

1.4 方法

1.4.1 乳酸菌的分離純化 稱取5 g酒糟于50 mL離心管中，加入50 mL 0.8%生理鹽水（加有玻璃珠），渦旋振蕩，靜置10 min，取1 mL上清液加入100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 靜置培養(yǎng)24 h。取1 mL培養(yǎng)液進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-7濃度，取0.1 mL不同濃度稀釋液進(jìn)行涂布，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，挑取乳白色、圓形、較小、表面光滑、邊緣整齊、中央隆起的菌落進(jìn)行劃線分離純化，并觀察其菌落形態(tài)。挑取培養(yǎng)時(shí)間為12 h的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，觀察其顯微鏡下個(gè)體形態(tài)。將純化后菌株接種于MRS斜面，于4 ℃冰箱保藏。

1.4.2 過氧化氫試驗(yàn) 挑取1環(huán)已純化菌株于潔凈試管內(nèi)，滴加3%過氧化氫溶液2 mL，觀察結(jié)果。于0.5 min內(nèi)發(fā)生氣泡者為陽性，不發(fā)生氣泡者為陰性[10]。

1.4.3 乳酸菌定性試驗(yàn) 采用紙層析法[11]。

1.4.4 抗氧化乳酸菌的篩選

1.4.4.1 樣品前處理 無菌體發(fā)酵液（CFE）：挑取1環(huán)純化菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中活化，以2%接種量接入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，4 000 r/min離心 20 min，收集菌體沉淀，取上清液進(jìn)行無菌體細(xì)胞發(fā)酵液抗氧化能力的測(cè)定。

菌體細(xì)胞提取物（IC）：使用磷酸緩沖液（pH值7.0）洗滌菌體沉淀2次后，用無菌水調(diào)整為2×109個(gè)/mL的菌懸液，然后進(jìn)行冰浴超聲波破碎（功率400 W、工作時(shí)間5 s、間隔時(shí)間5 s、破碎時(shí)間30 min），破碎液于8 000 r/min離心20 min，取上清液進(jìn)行菌體細(xì)胞提取物抗氧化能力的測(cè)定。

1.4.4.2 抗脂質(zhì)過氧化率測(cè)定[12] 在試管中依次添加 0.5 mL PBS、1 mL亞油酸、1 mL FeSO4、0.54 mL樣品。37 ℃水浴1.5 h，再添加0.2 mL三氯乙酸、2 mL硫代巴比妥酸，沸水浴30 min后迅速冷卻，4 000 r/min離心20 min后過濾，收集上清液，測(cè)定D532 nm。以無菌水代替樣品反應(yīng)為空白組。抗脂質(zhì)清除率的計(jì)算公式如下：

抗脂質(zhì)過氧化率=（1-D532 nm/D532 nm（空白））×100%。

1.4.4.3 超氧陰離子自由基清除率測(cè)定 采用鄰苯三酚法[13]。

1.4.4.4 DPPH自由基清除率的測(cè)定[14] 在試管中依次添加4 mL DPPH、2 mL樣品、1 mL 50%乙醇，在暗處反應(yīng) 60 min，離心20 min，取上清液，測(cè)定D517 nm。其計(jì)算公式如下：

DPPH自由基清除率=（1-D517 nm/D517 nm（空白））×100%。

1.4.5 抗氧化乳酸菌的培養(yǎng)條件優(yōu)化 挑取1環(huán)抗氧化較強(qiáng)的菌株9#，接種于初始培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h備用。以DPPH自由基清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別研究不同碳源種類（葡萄糖、蔗糖、淀粉）、氮源種類（牛肉膏、蛋白胨、酵母膏）、碳源添加量（15、20、25、30 g/L）、氮源添加量（20、25、30、35 g/L）、pH值（4.0、5.0、6.0、7.0）、裝液量（40、50、60、70 mL）對(duì)DPPH自由基清除率的影響，從而得到最優(yōu)培養(yǎng)基組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化

從濃香型白酒酒糟中共分離出12株乳酸菌，分別編號(hào)為1～12#，通過觀察其菌落形態(tài)、個(gè)體形態(tài)，12株過氧化氫試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，故初步鑒定為乳酸菌。其菌落形態(tài)、個(gè)體形態(tài)以4#為例，如圖1所示。

2.2 乳酸菌定性試驗(yàn)

將12株菌株分別接種至MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、 150 r/min 培養(yǎng)24 h，離心取上清液進(jìn)行紙層析，計(jì)算各菌株Rf值，其結(jié)果見表1。由表1可知，乳酸的Rf值為0.53，各菌株Rf值均為0.53左右，故12株菌株可確定為乳酸菌。

2.3 抗氧化乳酸菌的篩選

2.3.1 抗脂質(zhì)過氧化率測(cè)定 12株菌分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中于，37 ℃ 150 r/min培養(yǎng)24 h，經(jīng)樣品處理后得到無菌體發(fā)酵液和菌體細(xì)胞提取物，分別測(cè)定抗脂質(zhì)過氧化清除率，其結(jié)果如表2所示。

由表2可知，不同乳酸菌的發(fā)酵液和菌體細(xì)胞提取物的抗脂質(zhì)過氧化率差異很大。其中，發(fā)酵液的抗脂質(zhì)過氧化清除率較高的有1#、2#、3#、4#、9#，分別為10.07%、13.09%、11.12%、10.23%、10.07%。菌體細(xì)胞提取物的抗脂質(zhì)過氧化清除率較高的有1#、4#、9#、11#，分別為44.28%、47.71%、47.33%、41.60%。無菌體發(fā)酵液和菌體細(xì)胞提取物的抗脂質(zhì)過氧化清除率均較高的為1#、4#、9#。

2.3.2 超氧陰離子自由基清除能力的比較 12株菌分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，經(jīng)樣品處理后，得到無菌體發(fā)酵液和菌體細(xì)胞提取物，通過鄰苯三酚法分別對(duì)各菌株的超氧陰離子自由基清除能力進(jìn)行研究，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，無菌體發(fā)酵液的超氧陰離子清除率較高的有2#、3#、4#、9#，分別為32.47%、35.12%、43.76%、35.01%。菌體細(xì)胞提取物的超氧陰離子清除率較高的有 4#、5#、9#，分別為37.56%、40.88%、42.29%。無菌體發(fā)酵液和菌體細(xì)胞提取物的超氧陰離子清除率均較高的為4#、9#。

2.3.3 DPPH自由基清除率的比較 12株菌分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，經(jīng)樣品處理后，得到無菌體發(fā)酵液和菌體細(xì)胞提取物，分別對(duì)各菌株的 DPPH 自由基清除能力進(jìn)行研究，結(jié)果如表4所示。

由表4可知，無菌體發(fā)酵液的DPPH自由基清除率較高的有4#、9#、10#，分別為23.96%、25.96%、19.76%；菌體細(xì)胞提取物的DPPH自由基清除率較高的有1#、2#、4#、5#、9#，分別為33.04%、38.41%、41.07%、35.28%、33.21%。無菌體發(fā)酵液和菌體細(xì)胞提取物的DPPH自由基清除率均較高的為4#、9#。

綜上所述，菌株4#、9#的抗氧化能力最強(qiáng)，且其菌體細(xì)胞提取物的抗氧化能力均高于無菌體發(fā)酵液，后續(xù)試驗(yàn)選擇4#菌株作為出發(fā)菌進(jìn)行研究。

2.4 抗氧化乳酸菌的培養(yǎng)基優(yōu)化

2.4.1 不同碳源及碳源添加量對(duì)抗氧化能力的影響 選取抗氧化性較強(qiáng)的乳酸菌4#，分別接入不同碳源（葡萄糖、蔗糖、淀粉）和不同碳源添加量（15、20、25、30 g/L）MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測(cè)定無菌體發(fā)酵液對(duì)DPPH自由基清除率，結(jié)果如圖2和圖3所示。

由圖2和圖3可知，以葡萄糖為碳源時(shí)，無菌體發(fā)酵液對(duì)DPPH自由基清除率最高，達(dá)到21.36%；葡萄糖添加量為15 g/L，清除率達(dá)到最高，為47.5%，并隨著添加量的增加，清除率緩慢下降后在20～25 g/L時(shí)急劇下降。故菌株4#最佳

碳源為葡萄糖，最佳添加量為15 g/L。

2.4.2 不同氮源及氮源添加量對(duì)抗氧化能力的影響 將乳酸菌4#分別接入不同氮源（牛肉膏、蛋白胨、酵母膏）和不同氮源添加量（20、25、30、35 g/L）MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測(cè)定無菌體發(fā)酵液對(duì)DPPH自由基清除率，其結(jié)果如圖4、圖5所示。

由圖4、圖5可知，氮源為牛肉膏時(shí)，其無菌體發(fā)酵液對(duì)DPPH自由基清除率明顯高于酵母膏和蛋白胨；同時(shí)，清除率隨著牛肉膏添加量的增加而先增高后緩慢降低，在25 g/L時(shí)，DPPH自由基清除率最高，達(dá)到30.86%，故菌株4#最佳氮源為牛肉膏，最佳添加量為25 g/L。

2.4.3 不同pH值和裝液量對(duì)抗氧化的影響 pH值和裝液量是影響菌體生長(zhǎng)的重要指標(biāo)，將乳酸菌4#分別接入不同pH值（4.0、5.0、6.0、7.0）和不同裝液量（40、50、60、70 mL）MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測(cè)定無菌體發(fā)酵液對(duì)DPPH自由基清除率，結(jié)果見圖6、圖7。

由圖6、圖7可知，隨著pH值上升，DPPH自由基清除率明顯上升后下降；pH值為6時(shí)，清除率達(dá)到最高，為4758%，因此培養(yǎng)基的最優(yōu)pH值為6。不同裝液量的DPPH自由基清除率差異明顯，隨裝液量的增加，DPPH自由基清除率先上升后下降，在裝液量為60 mL時(shí)，DPPH自由基清除率最高為 42.57%，故菌株最佳裝液量為250 mL三角瓶中60 mL。

綜上所述，菌株4#的最佳培養(yǎng)基條件為：牛肉膏20 g/L、葡萄糖15 g/L、檸檬酸氫二鈉2 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、乙酸鈉5 g/L、硫酸錳0.25 g/L、硫酸鎂0.58 g/L、吐溫-80 1 mL/L，pH值為7，裝液量為60 mL。

2.5 培養(yǎng)基優(yōu)化驗(yàn)證試驗(yàn)

將菌株4#分別接入初始培養(yǎng)基和最佳培養(yǎng)基中，測(cè)定無菌體發(fā)酵液的抗脂質(zhì)過氧化清除率、超氧陰離子清除率、DPPH 自由基清除率，比較培養(yǎng)基優(yōu)化效果，其結(jié)果如表5所示。

由表5可知，優(yōu)化后的無菌體發(fā)酵液的抗脂質(zhì)過氧化率、超氧陰離子清除率稍有增高，DPPH自由基清除率明顯增高，分別增加6.18、8.13、29.42百分點(diǎn)。結(jié)合3種清除率，優(yōu)化后菌種的抗氧化能力有較大的增長(zhǎng)，增量達(dá)到43.73百分點(diǎn)。

3 結(jié)論

以四川瀘州老窖濃香型白酒酒糟為原料，采用稀釋涂布法結(jié)合革蘭氏染色、紙層析法分離乳酸菌，測(cè)定抗脂質(zhì)過氧化率、超氧陰離子清除率、DPPH自由基清除率，以比較菌株抗氧化能力，并采用單因素試驗(yàn)進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化。結(jié)果表明：共得到12株乳酸菌，以抗脂質(zhì)過氧化率、超氧陰離子清除率、清除DPPH自由基為抗氧化評(píng)價(jià)指標(biāo)，菌株4#、9#抗氧化能力最強(qiáng)。采用單因素試驗(yàn)對(duì)4#培養(yǎng)基的碳源、碳源添加量、氮源、氮源添加量、pH值、裝液量進(jìn)行優(yōu)化，其優(yōu)化結(jié)果為牛肉膏20 g/L、葡萄糖15 g/L、pH值7，裝液量為60 mL，且優(yōu)化后4#抗氧化能力提高了43.73百分點(diǎn)，這為抗氧化菌株的生產(chǎn)應(yīng)用、開發(fā)相關(guān)抗氧化產(chǎn)品提供一定的理論依據(jù)。同時(shí)，對(duì)于該菌株的培養(yǎng)條件優(yōu)化以及工業(yè)應(yīng)用還有待進(jìn)一步探索。

參考文獻(xiàn)：

[1]彭新顏，于海洋，李 杰，等. 乳酸菌抗氧化作用研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué)，2012，33（23）：370-374.

[2]吳祖芳，洪松虎，沈錫權(quán)，等. 乳酸菌高抗氧化活性菌株的篩選及鑒定[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2010，10（1）：73-78.

[3]王 曦，羅 霞，許曉燕，等. 不同乳酸菌菌株抗氧化能力的比較研究[J]. 食品科學(xué)，2010，31（9）：197-201.

[4]李素云，王立芹，鄭稼琳，等. 自由基與衰老的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)老年學(xué)雜志，2007，27（20）：2046-2048.

[5]李 勇，孔令青，高 洪，等. 自由基與疾病研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，29（4）：85-88.

[6]Kullisaar T，Zilmer M，Mikelsaar M，et al. Two antioxidative lactobacilli strains as promising probiotics[J]. International Journal of Food Microbiology，2002，72（3）：215-224.

[7]Talwalkar A，Kailasapathy K，Hourigan J，et al. An improved method for the determination of NADH oxidase in the presence of NADH peroxidase in lactic acid bacteria[J]. Journal of Microbiological Methods，2003，52（3）：333-339.

[8]張書文. 抗氧化乳酸菌的篩選及其特性研究[D]. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[9]劉天祎，潘道東. 抗氧化活性乳酸菌的篩選[J]. 食品科學(xué)，2011，32（19）：125-129.

[10]東秀珠，蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001.

[11]中國(guó)科學(xué)院微生物研究所細(xì)菌分類組.一般細(xì)菌常用鑒定方法[M]. 北京：科學(xué)出版社，1978.

[12]Lee J，Hwang K T，Heo M S，et al. Resistance of Lactobacillus plantarum KCTC 3099 from kimchi to oxidative stress[J]. Journal of Medicinal Food，2005，8（3）：299-304.

[13]張鳳敏，田豐偉，陳衛(wèi)，等. 具抗氧化活性乳酸菌的篩選[J]. 中國(guó)乳品工業(yè)，2007，35（2）：4-7.

[14]張?zhí)觳瑢幭脖? 乳酸菌對(duì)自由基清除能力的研究[J]. 中國(guó)乳品工業(yè)，2007，35（4）：10-12，19.