沈 輝, 萬夕和, 何培民, 姚國興, 陳愛華

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文蛤一種球形病毒的分離純化及細胞病理變化觀察

沈 輝1, 萬夕和1, 何培民2, 姚國興1, 陳愛華1

(1. 江蘇海洋水產(chǎn)研究所江蘇南通226007; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海201306)

為研究一種球形病毒引起的文蛤()細胞病理變化及該病毒的分類地位, 作者運用透射電鏡對異常死亡文蛤的細胞病理變化及感染的病毒粒子進行了超微結(jié)構(gòu)觀察, 并通過差速離心、酒石酸鉀超速離心和氯化銫密度梯度離心結(jié)合等方法對首次對該病毒粒子進行了分離純化。結(jié)果表明: 患病個體的鰓、消化盲囊、消化道和外套膜均大量存在一種病毒顆粒, 該病毒呈球形, 無囊膜, 直徑45~55 nm, 核心與核衣殼間無明顯界限, 未發(fā)現(xiàn)病毒包涵體, 該病毒存在于細胞間質(zhì)及被破壞的細胞質(zhì)中。該病毒粒子的感染引起的細胞病理變化主要表現(xiàn)為: 細胞核染色質(zhì)集聚, 溶酶體增多, 線粒體腫漲, 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹, 肌原纖維排列混亂, 細胞結(jié)構(gòu)變得無規(guī)則直至解體。病毒粗提液于4℃ 150 000 g氯化銫密度梯度離心20 h可該病毒粒子提純, 經(jīng)純化后負染顯示, 該病毒粒子呈球形, 二十面體對稱, 無囊膜, 直徑在60~75 nm, 表面結(jié)構(gòu)粗糙, 殼粒結(jié)構(gòu)較明顯, 該病毒粒子在氯化銫中的浮密度為1.554~1.582 g/mL。本文結(jié)果為文蛤死亡病原的研究提供了基礎(chǔ)資料。

文蛤(); 球形病毒; 分離純化; 細胞病理

文蛤()隸屬瓣鰓綱(Lamelli-branchia)、真瓣鰓目(Eulamellibranchia)、簾蛤科(Veneridae)、文蛤?qū)?), 是江蘇沿海灘涂增養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟貝類。近10年來文蛤的病害頻繁發(fā)生, 對江蘇沿海文蛤的增養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成重要危害, 尤其在2005年夏秋季發(fā)生在江蘇南通沿海區(qū)域的文蛤大規(guī)模死亡, 發(fā)病率與死亡率極高, 經(jīng)濟損失嚴重。

有關(guān)文蛤病害的研究自20世紀70年代末以來受到關(guān)注, 報道主要集中在弧菌、環(huán)境脅迫和寄生蟲等方面。楊美桂[1]從臺灣養(yǎng)殖發(fā)病的麗文蛤()中分離得到副溶血弧菌(s), 并認為該弧菌為麗文蛤大規(guī)模死亡的病原菌, 沈亞林等[2]與劉軍義等[3]也分別從江蘇南部沿海及廣西沿海發(fā)病文蛤中分離得到副溶血弧菌。鄭國興等[4]從江蘇南部沿海發(fā)病文蛤中分離得到一種溶藻弧菌(), 觀察到該弧菌侵襲腸上皮及肝組織, 在細胞質(zhì)內(nèi)形成上百個細菌的集群, 通過回感實驗認為該弧菌造成1991年江蘇南部沿海文蛤大規(guī)模的死亡。王廣和等[5]從發(fā)病文蛤中分離到弗尼氏弧菌(), 同樣認為該弧菌為文蛤死亡的致病菌。于志華等[6]認為水溫是造成文蛤死亡的首要因素, 文蛤暴發(fā)死亡時期的海水溫度為20~37℃, 溶藻弧菌在此溫度條件下最適宜生長, 弧菌的大量繁殖導(dǎo)致感染死亡; 對寄生的研究報道, 吸蟲(sp.)在文蛤體內(nèi)的寄生而造成一定數(shù)量的死亡發(fā)生[7-10]。有關(guān)環(huán)境脅迫方面的報道, 主要集中在氨氮[11]、重金屬[12]、藻類缺乏引起的饑餓[13]等方面的研究。文蛤大規(guī)模死亡的時期通常在文蛤繁殖期過后[14], 姚國興等[15]認為棲息底泥硫化氫含量過高與繁殖盛期文蛤體質(zhì)虛弱兩方面因素的結(jié)合疊加引發(fā)大規(guī)模的死亡。

隨著貝類病害研究的深入發(fā)展, 海洋貝類病毒病的研究逐漸成為熱點。近幾十年來, 多種病毒已被發(fā)現(xiàn)并分離鑒定, 證明有些病毒是貝類死亡的直接病原, 尤其皰疹病毒()引發(fā)了不同地域牡蠣大規(guī)模死亡的重要病原[16-21]。病毒感染文蛤的研究也已有報道, 任素蓮等[22-23]從河北省“紅肉病”文蛤組織細胞中發(fā)現(xiàn)了3種病毒顆粒, 著重描述和討論了其中一種球形病毒的形態(tài)特征及細胞病理學(xué), 并推測該病毒粒子為文蛤“紅肉病”的主要病原體。Lo等[24]從臺灣養(yǎng)殖的麗文蛤患黑鰓癥個體的軟體組織中分離得到一種水生雙RNA病毒, 推測該病毒引起了麗文蛤的大規(guī)模死亡。作者在常規(guī)流行病學(xué)調(diào)查的基礎(chǔ)上, 著重對發(fā)現(xiàn)于大量發(fā)病文蛤中的病毒粒子及與其相關(guān)的細胞病理變化進行了觀察與研究, 以期為深入揭示引發(fā)文蛤大規(guī)模死亡的病因提供基礎(chǔ)性資料。

1 材料與方法

1.1 材料

發(fā)病文蛤采自于2013年夏秋季江蘇南通沿海文蛤增養(yǎng)殖海區(qū)的發(fā)病現(xiàn)場, 取回實驗室后去殼后留取軟體部分–70℃保存。

1.2 方法

1.2.1 超微病理切片的制作

取患病文蛤的鰓、消化盲囊、斧足、外套膜和消化道等組織切成1 mm3小塊, 用2.5%戊二醛固定, 1%鋨酸再固定, 經(jīng)酒精-丙酮逐脫水, 低溫包埋劑(ERL-4026)包埋, Reichert-Jung切片機超薄切片, 經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色, 日立H600-Ⅱ型透射電鏡下觀察。

1.2.2 病毒液的制備

將患病文蛤組織加入液氮研磨, 按1/5()比例加入TEN緩沖液(0.05 mol/L Tris-HCl, 0.01mol/L EDTA, 0.36 mol/L NaCl, pH 7.8), 勻漿液在–70℃與25℃反復(fù)凍融3次, 于4℃ 1 000 g離心30 min, 收集上清于新的離心管, 將沉淀加入適量TEN緩沖液重懸后再以4℃ 1 000 g離心30 min, 棄沉淀, 合并上清, 于4℃ 7 000 g離心30 min, 棄沉淀, 收集上清。將上清分別鋪于濃度為40%()的酒石酸鉀墊(︰=2︰1)和濃度為40%()的蔗糖墊, 于4℃ 100 000 g離心4 h, 棄上懸液, 以適量TE緩沖液(0.01mol/L Tris-HCl, 0.001mol/L EDTA, pH 7.8)重懸沉淀, 比較兩種介質(zhì)層面純化效果。

1.2.3 病毒粒子的分離純化

由TE緩沖液配制蔗糖密度梯度(45%、50%、55%、60%、65%)、酒石酸鉀-甘油密度梯度(D液、C液、B液、A液)[25]和CsCl密度梯度(25%、35%、45%、55%)3種密度梯度介質(zhì), 于4℃ 150 000 g分別離心3、6和20 h, 收集各梯度的分層, 加TE緩沖液稀釋后, 于4℃ 100 000 g離心1.5 h后去除梯度介質(zhì), TE重懸沉淀, 并比較純化效果。

1.2.4 病毒粒子的負染與浮密度測定

分別取差速離心、蔗糖墊超速離心和密度梯度離心后的病毒重懸液, 滴加在覆有Formver膜的銅網(wǎng)上, 約5 min后從銅網(wǎng)邊緣吸去多余液體, 室溫風干, 滴加濃度2%、pH 7.2的磷鎢酸負染5 min, 用濾紙吸去多余染液, 室溫風干, 于日立H600-Ⅱ型透射電鏡下觀察攝片。

病毒粒子浮密度測定按文獻[26]: 用10 μL微量移液器(Gilson)吸取密度梯度中分離的病毒層面, 加入已知測重的0.2 mL PCR薄壁管中, 在十萬位的電子天平上稱量, 由質(zhì)量與體積的除商得到該病毒粒子的浮密度。

2 結(jié)果

2.1 病毒粒子的分布與形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

發(fā)病文蛤個體組織超薄切片電鏡觀察顯示, 鰓、消化盲囊、消化道、外套膜的結(jié)締組織細胞質(zhì)及細胞間質(zhì)中存在大量電子密度高的病毒顆粒(圖1~圖4, V)。該病毒粒子呈球形, 無囊膜, 直徑為45~55 nm, 核心與核衣殼之間沒有明顯的界限, 未見雙層衣殼結(jié)構(gòu), 電子密度較高, 呈分散狀態(tài)分布于細胞質(zhì)中, 在細胞核中未發(fā)現(xiàn)該病毒粒子的感染。超微結(jié)構(gòu)未顯示該病毒包涵體的存在, 但在細胞質(zhì)中觀察到一種病毒囊泡樣結(jié)構(gòu), 其中包裹著大量已裝配成熟的病毒粒子(圖2-2, 圖3-2, 圖4, MBS)。

1-1. 線粒體和微管結(jié)構(gòu)異常; 1-2. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體異常; V. 病毒顆粒; M. 線粒體; MT. 微管; RER. 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

1-1. Pathological changes inmitochondria (M) and microtubule (MT); 1-2. Pathological changes in rough endoplasmic reticulum (RER) and mitochondria (M); Virus particle (V)

2-1. 線粒體、細胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及溶酶體異常; 2-2. 出現(xiàn)囊泡樣結(jié)構(gòu)。V. 病毒顆粒; M. 線粒體; RER. 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng); L. 溶酶體; MBS. 囊泡樣結(jié)構(gòu)

2-1. Pathological changes in mitochondria (M), nuclear (N), rough endoplasmic reticulum (RER), and lysosome (L). 2-2. Membrane- bounded structure (MBS); V. Virus particle

3-1. 細胞核、溶酶體及線粒體異常; 3-2. 出現(xiàn)囊泡樣結(jié)構(gòu); V. 病毒顆粒; M. 線粒體; L. 溶酶體; MBS. 囊泡樣結(jié)構(gòu)

3-1. The pathological changes in mitochondria (M) and lysosome (L). 3-2. Membrane-bounded structure (MBS); V. Virus particle

4-1. 溶酶體和次極溶酶體增多, 出現(xiàn)囊泡樣結(jié)構(gòu); 4-2. 線粒體和肌纖維異常。V. 病毒顆粒; M. 線粒體; L. 溶酶體; SL. 次級溶酶體; MF. 肌纖維; MBS. 囊泡樣結(jié)構(gòu)

4-1. Increase in lysosomes and secondary lysosomes in the cell and a membrane-bounded structure; 4-2. Pathological changes in mitochondria (M) and muscle fiber (MF); V. Virus particle; L. lysosome; SL. secondary lysosome

2.2 細胞病理學(xué)變化及特征觀察

發(fā)病文蛤的檢樣超薄切片顯示, 上述病毒粒子的存在并引發(fā)鰓、消化盲囊、消化道及外套膜等組織的細胞病理變化, 其中以消化盲囊的細胞病理變化最為明顯。各病理變化主要表現(xiàn)為:

鰓: 在發(fā)病文蛤上皮細胞與結(jié)締組織細胞的胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)大量病毒粒子的存在(圖1-1, 圖1-2, V)。線粒體腫漲, 嵴由于內(nèi)層膜的伸展而變短, 嚴重的嵴消失(圖1-1, 圖1-2, M), 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面核糖體脫落增多, 可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡化現(xiàn)象(圖1-2, RER), 微管“9+2”結(jié)構(gòu)受損(圖1-1, MT)。

消化盲囊: 在發(fā)病文蛤消化盲囊的上皮細胞質(zhì)中存在大量的病毒粒子(圖2-1, 圖2-2, V)。細胞核內(nèi)染色質(zhì)凝集, 沿核膜內(nèi)層分布(圖2-1, N), 線粒體腫脹呈圓形, 嵴結(jié)構(gòu)模糊不清, 甚至消失(圖2-1, 圖2-2, M), 胞內(nèi)溶酶體增多(圖2-1, L)。

消化道: 在發(fā)病文蛤消化道皮下結(jié)締組織細胞質(zhì)及細胞間質(zhì)中存在大量病毒粒子(圖3-1, 圖3-2, V)。細胞核內(nèi)染色質(zhì)凝集靠邊(圖3-1, N), 細胞核周圍溶酶體明顯增多(圖3-1, L), 胞線粒體腫漲, 基質(zhì)密度下降, 多數(shù)內(nèi)嵴減少或消失, 結(jié)構(gòu)模糊不清(圖3-1, M)。

外套膜: 在發(fā)病文蛤外套膜結(jié)締組織細胞質(zhì)與肌纖維中可見大量病毒粒子分布(圖4-1, 圖4-2, V)。線粒體腫脹, 嵴模糊不清(圖4-2, M), 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變形, 核糖體從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫落增多, 胞質(zhì)內(nèi)溶酶體增多(圖4-1, L, SL)。

2.3 病毒粒子的純化與浮密度

蔗糖與酒石酸鉀兩種不同離心介質(zhì)墊的初步純化方法顯示, 離心管中都呈現(xiàn)3個層面, 上層澄清, 中間層呈黃濁色, 底層為乳黃色或褐黃色沉淀(表1)。蔗糖與酒石酸鉀-甘油密度梯度離心盡管都出現(xiàn)黃褐色分層(圖5-1, 圖5-2), 而在氯化銫密度梯度中出現(xiàn)了一條明顯的乳白色分層(圖5-3)。在蔗糖梯度離心的分層中主要為浮密度不同的細胞碎片, 偶見病毒粒子, 在離心管沉積中發(fā)現(xiàn)大量病毒顆粒且夾雜大量細菌碎片(圖6-1)。經(jīng)酒石酸鉀-甘油密度梯度離心后, 可見大量結(jié)構(gòu)完整的病毒粒子出現(xiàn)在離心管底部的乳白色沉淀中, 并夾雜少量的細胞碎片(圖6-2)。收集氯化銫乳白色分層, 負染觀察發(fā)現(xiàn)大量的結(jié)構(gòu)完整、直徑均勻的病毒粒子(圖6-3)。利用稱量法對氯化銫密度梯度離心不同離心管中的乳白色分層進行測量, 得到該病毒粒子的浮密度見表2。

表1 3種不同介質(zhì)密度梯度離心的分層情況

表2 病毒粒子浮密度的稱量結(jié)果

5-1. 蔗糖密度梯度離心分層, 黃色分層靠近底部為細菌碎片; 5-2. 酒石酸鉀-甘油密度梯度離心分層, 黃色分層靠近中部為細菌碎片; 5-3. 氯化銫密度梯度離心分層, 乳色分層靠近底部為病毒顆粒; CB.細胞碎片

5-1. The yellow layer appeared close to the bottom of tube after sucrose density gradient ultracentrifugation; 5-2. The yellow layer appeared mid-tube after potassium tartrate-glycerol gradient ultracentrifugation; 5-3. A milky layer appeared close to the bottom of the tube after CsCl density gradient ultracentrifugation. CB. Cell debris

6-1. 經(jīng)蔗糖墊離心后沉淀中的病毒顆粒和細菌碎片; 6-2. 經(jīng)酒石酸鉀-甘油墊墊離心后沉淀中的病毒顆粒和細菌碎片; 6-3. 經(jīng)氯化銫密度梯度離心后, 乳白色分層中大量結(jié)構(gòu)完整的病毒顆粒

6-1. The viral particles and cell debris precipitated after sucrose density gradient ultracentrifugation; 6-2. The viral particles and cell debris precipitated after potassium tartrate-glycerol gradient ultracentrifugation; 6-3. The virus particles present in the milky layer after CsCldensity gradient ultracentrifugation

3 討論

3.1 病毒的初步定位

自Farley等[27]從美洲牡蠣成體血淋巴細胞核中首次發(fā)現(xiàn)直徑70~90 nm的皰疹病毒以來, 迄今已報道貝類病毒主要有皰疹病毒()[16-21]、虹彩病毒()[28-29]、呼腸孤病毒()[30-31]、雙RNA病毒()[32-34]、乳多空病毒()[35-36]與小RNA病毒()[37]等。上述病毒具不同的形態(tài)學(xué)特征, 本研究中的病毒粒子形態(tài)為無囊膜的二十四面體對稱, 這一特征可以排除皰疹病毒科與虹彩病毒科的可能聯(lián)系。另外, 細胞超微結(jié)構(gòu)與病理變化表明, 該病毒粒子具有在細胞質(zhì)內(nèi)感染增殖的特性, 在已報道水生動物病毒中與之有相同性質(zhì)的為水生雙RNA病毒、呼腸孤病毒以及小RNA病毒。已報導(dǎo)的小RNA病毒粒子直徑一般為20~30 nm[37], 與作者發(fā)現(xiàn)的病毒粒子相差甚遠, 由此可以將該病毒定位于雙RNA病毒科或呼腸孤病毒科兩者中的一種。過去雙RNA病毒科歸屬于呼腸孤病毒科, 直到1973年雙RNA病毒才從呼腸孤病毒科中分離出來, 1995年ICTV在雙RNA病毒科中分設(shè)了水生雙RNA病毒屬()。該屬病毒在形態(tài)學(xué)上與水生呼腸孤病毒的主要區(qū)別為無特征性雙層衣殼, 代表種為傳染性胰壞死病毒(Infectious pancreas necrosis virus)。水生雙RNA病毒為無囊膜的二十面體, 直徑約60~ 75 nm, 在感染細胞的超薄切片中核心直徑為45 nm, 廣泛寄生于海洋水生動物中[32-34]。在本研究中, 病毒粒子無囊膜, 未見雙層衣殼結(jié)構(gòu), 核心直徑為45~55 nm,負染病毒粒子直徑為60~75 nm, 在細胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制發(fā)生, 這些結(jié)果表明該病毒具有水生雙RNA病毒的特征。不過, 其分類地位的確定仍需要基因序列、蛋白性質(zhì)等方面的研究證據(jù)加以證實。

3.2 病毒的靶組織及病毒囊泡樣結(jié)構(gòu)

Lo等[24]從臺灣養(yǎng)殖的具黑鰓癥狀的麗文蛤()中分離得到一種水生雙RNA病毒, 該病毒大量寄生于鰓組織的細胞質(zhì)中, 無囊膜, 直徑為62.8 nm±0.6 nm, 未見報道發(fā)現(xiàn)病毒包涵體, 僅發(fā)現(xiàn)病毒囊泡樣結(jié)構(gòu)。任素蓮[23]在河北養(yǎng)殖的“紅肉病”文蛤消化盲囊的細胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)一種無囊膜、直徑約50~80 nm的病毒粒子, 并在細胞質(zhì)中觀察到不同形態(tài)的病毒包涵體存在。在本研究中, 不同發(fā)病文蛤的超微切片觀察結(jié)果表明, 該病毒粒子的靶組織不局限于文蛤的鰓和消化盲囊, 在外套膜和消化道組織中也感染寄生, 該病毒并不具有感染的特異性。在研究觀察中, 細胞質(zhì)與細胞核中均未發(fā)現(xiàn)病毒包涵體的存在, 但在多個組織細胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)類似于Lo等[24]所報道的病毒囊泡樣結(jié)構(gòu), 其中分布著大量已裝配成熟的病毒粒子, 顯示該病毒的發(fā)生基質(zhì)為細胞質(zhì)。在已報道的貝類病毒中, 特別是牡蠣的皰疹病毒所形成的包涵體, 經(jīng)常呈現(xiàn)排列規(guī)則的晶體結(jié)構(gòu), 其中包被著尚未或已經(jīng)裝配成熟的病毒粒子[27-28]。本實驗觀察發(fā)現(xiàn)的病毒囊泡樣結(jié)構(gòu)(圖2-2, 圖3-2, 圖4-1, MBS), 其內(nèi)無特定晶體方式排列, 因此該病毒可能是一種無包涵體的病毒。

3.3 病毒粒子純化與浮密度

本實驗采用了差速離心、酒石酸鉀超速離心及CsCl密度梯度離心相結(jié)合的方法研究了病毒粒子的分離與純化。實驗表明, 該病毒粒子在CsCl密度梯度中浮密度達到1.554~1.582 g/mL, 運用蔗糖密度梯度[19, 38-39]或酒石酸鉀-甘油密度梯度離心的方法[25, 40]無法使該病毒粒子在介質(zhì)梯度中分層, 而是在離心管的底部形成了沉淀, 因此無法估算病毒粒子的浮密度。蔗糖梯度離心、酒石酸鉀-甘油密度梯度離心分離方法與CsCl密度梯度離心相比, 分離純度較低。作者從以上分析中認為該病毒歸屬于水生雙RNA病毒, 從浮密度研究結(jié)果看該病毒粒子較明顯地大于已發(fā)現(xiàn)的水生雙RNA病毒的浮密度1.33~ 1.34 g/mL[24, 32-34]。浮密度量值特征是病毒分類依據(jù)之一, 但在同科甚至同屬中病毒粒子浮密度相差較大的例子也存在, 鼻病毒與腸道病毒同屬于小RNA病毒科,鼻病毒的浮密度為1.38~1.56 g/mL, 而腸道病毒一般只有1.33~1.44 g/mL[41], 浮密度的不同可能是因為病毒衣殼蛋白結(jié)構(gòu)不同或結(jié)合銫離子以及對原先結(jié)合于病毒粒子上陽離子交換能力不同造成的[42]。

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Purification and ultrastructure of a spherical virus in the cultured hard clamLinnaeus

SHEN Hui1, WAN Xi-he1, HE Pei-min2, YAO Guo-xing1, CHEN Ai-hua1

(1. Jiangsu Institute of Marine Fisheries, Nantong 226007, China; 2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)Received：Dec. 9, 2014

Linnaeus; spherical virus; purification; cytopathology

In order to study the taxonomic status of a spherical virus and its cytopathic effect on the cells of, transmission electron microscopy (TEM) was used to observe pathological cell changes in the moribund clams and the ultrastructure of the virus. The virus particles were first purified by combining differential centrifugation, potassium tartrate cushion ultracentrifugation, and CsCl density gradient centrifugation. The results showed that there were a large number of virus particles in the intercellular substance and cytoplasm of the gill, digestive diverticula, mantle, and digestive tract. The virus particles were spherical, approximately 45 to 55 nm in diameter, of a non-envelope structure, and showed no ambit between the core and nucleocapsid surrounding the cytoplasm. Obvious pathological changes caused by the virus were that the endoplasmic reticulum swelled and mostly turned into vesicles, the nuclear chromatin condensed, the mitochondria swelled and dissolved, the muscle fiber disarrayed, and the number of lysosomes increased. The virus particles were purified at a concentration of 150000 g for 20 h, showed isometric symmetry, were approximately 60 to 75 nm in diameter, showed obvious capsomers on the surface of the virions, and had a buoyant density of 1.554 to 1.582 g/mL on the isopycnic CsCl gradient. The results of this paper supply fundamental data for the study ofpathogens.

S944

A

1000-3096(2016)07-0046-08

10.11759//hykx20141209001

2014-12-09;

2015-01-14;

國家科技支撐計劃課題(2012BAC07B03); 2014年省屬公益院所科研條件與能力建設(shè)(BM2014040)

[Foundation: Key Project of the National Science & Technology Pillar Program, No. 2012BAC07B03; The Building of Research Conditions and Capacity of Provincial Institute of Public Welfare in 2014, No. BM2014040]

沈輝, 男(1981-), 江蘇徐州人, 博士研究生, 主要從事海洋微生態(tài)學(xué)研究, E-mail: darkhui@163.com;萬夕和,通信作者, E-mail: wxh1708@163.com

(本文編輯: 譚雪靜)