程方 葉建仁

摘要 初步探索了以濕地松幼樹新生芽為外植體的側(cè)芽增殖植株再生體系的條件，結(jié)果表明，4月中下旬為濕地松側(cè)芽增殖最佳采樣時(shí)間；20 mg/L抗壞血酸（VC）對(duì)濕地松新抽芽的褐化有一定抑制作用；6-BA的濃度為7 mg/L時(shí)，濕地松外植體的萌動(dòng)最明顯；改良GD+4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+1 mg/L GA3對(duì)經(jīng)高濃度6-BA處理后萌動(dòng)的外植體的側(cè)芽增殖起促進(jìn)作用；0、1、3、5 mg/L的GA3培養(yǎng)基均對(duì)新采集的外植體側(cè)芽的誘導(dǎo)沒有促進(jìn)作用；改良GD+6 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA、改良GD+8 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA成功誘導(dǎo)出側(cè)芽或不定芽，側(cè)芽在后期培養(yǎng)中生長良好。

關(guān)鍵詞 濕地松；側(cè)芽增殖；外植體；快繁技術(shù)；新抽芽

中圖分類號(hào) S791.246 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2016）09-0160-02

Abstract Study on lateral buds proliferation of Pinus elliottii was done. The main results were as followed：the best acquisition time of explants was in mid-April；20 mg/L of VC could inhibite the explants to brown；the explants germinated obviously on the media with 7 mg/L 6-BA；the explants on modified GD media with 4 mg/L 6-BA and 0.2 mg/L NAA and 1 mg/L GA3 induced lateral bud on high concentration 6-BA；0，1，3，5 mg/L of GA3 medium had no promating effect for the new collection of explant of lateral bud；the explants on modified GD media with 6 mg/L 6-BA and 0.4 mg/L NAA，modified GD media with 8 mg/L 6-BA and 0.3 mg/L NAA induced lateral bud successfully，and the buds grew well in the latter time.

Key words Pinus elliottii；lateral buds proliferation；explants；propagation technology；new buds

植物微體繁殖的植株再生途徑有體細(xì)胞胚胎發(fā)生植株再生、器官發(fā)生植株再生、側(cè)芽增殖植株再生[1]。在抗病育種過程中，利用種子萌發(fā)獲得帶子葉頂芽作為起始外植體的器官發(fā)生方式獲得的再生植株，其抗病性是否能保持和母本一致，還需在后期進(jìn)行抗病性測(cè)定。而側(cè)芽增殖是利用頂芽和側(cè)芽中已經(jīng)形成的芽分生組織來進(jìn)行增殖的，比器官發(fā)生再生植株在遺傳性上更穩(wěn)定、自發(fā)性變異頻率低、再生完整植株所需的培養(yǎng)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。目前以濕地松成熟胚、離體胚無菌苗、無菌實(shí)生苗等為外植體，成功地建立其器官發(fā)生的組織培養(yǎng)再生體系，并且獲得的試管苗移栽成活[2-3]，暫無濕地松側(cè)芽增殖的相關(guān)報(bào)道。因此，探索濕地松側(cè)芽增殖再生體系的條件，對(duì)加快濕地松抗病育種進(jìn)程顯得尤為重要。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及無菌處理

2009年3—5月不同時(shí)間段的晴天中午分別采集南京林業(yè)大學(xué)后山苗圃五年生濕地松新抽芽為外植體，將其用洗潔精水浸泡0.5 h，流水沖洗2 h，于超凈工作臺(tái)上用75%酒精浸泡30 s后用0.1%升汞中滅菌3.5 min，轉(zhuǎn)接至設(shè)計(jì)的初誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

1.2 初誘導(dǎo)培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)

改良GD+4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的培養(yǎng)基培養(yǎng)不同時(shí)間采集的外植體，觀察芽的成活、污染情況，篩選出最佳采樣時(shí)間；改良GD+4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的培養(yǎng)基，設(shè)置抗壞血酸濃度為0、10、20、40 mg/L，觀察統(tǒng)計(jì)外植體的褐化情況；以改良GD為基本培養(yǎng)基，NAA濃度0.2 mg/L，設(shè)置6-BA濃度為4、5、6、7 mg/L；改良GD+4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的培養(yǎng)基，設(shè)置赤霉素（GA3）濃度為0、1、3、5 mg/L。以改良GD為基本培養(yǎng)基，A因素（6-BA濃度為4、6、8 mg/L）、B因素（NAA濃度為0.2、0.3、0.4 mg/L）進(jìn)行完全隨機(jī)試驗(yàn)，觀察統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同采集時(shí)間對(duì)濕地松新抽芽污染與成活的影響

外植體的分化程度及幼嫩程度對(duì)誘導(dǎo)結(jié)果有很大影響。因此，外植體的采集時(shí)間也成為影響試驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵因素之一。從春季不同采集日期，分析最佳外植體采集時(shí)間，為以后濕地松進(jìn)行大規(guī)模組織培養(yǎng)工作提供依據(jù)。結(jié)果顯示，4月12日采集的外植體成活率最高，為83.3%，4月29日采集的外植體成活率次之，為81.2%，而4月22日的成活率也達(dá)到了75%的較高值?？梢?，在4月中下旬采集的外植體成活率比3月、5月的高得多，為較佳采集時(shí)間（表1）。處在迅速生長期的新抽芽及新梢莖段在不同的采集時(shí)間隨著新抽梢的伸展，其鱗片狀的芽被漸少，在相同的滅菌時(shí)間里污染率也會(huì)隨著采集時(shí)間的推遲而變化。

2.2 抗壞血酸（VC）使用濃度對(duì)濕地松新抽芽褐變的影響

抗壞血酸（VC）有防止材料褐變、抵制多酚類物質(zhì)的作用。本次結(jié)果表明，添加抗壞血酸對(duì)外植體的褐化有一定的抑制作用，添加濃度為20 mg/L時(shí)，其褐化率最低，為25%，同時(shí)成活率最高，為50%（表2）。

2.3 6-BA對(duì)濕地松新抽芽誘導(dǎo)的影響

6-BA的主要作用是促進(jìn)芽的形成，也可以誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生。40 d后觀察到所有成活的外植體底部均膨大形成愈傷組織，6-BA濃度為7 mg/L的培養(yǎng)基中外植體的萌動(dòng)最明顯（圖1D），其他濃度中的外植體只有稍微的萌動(dòng)。

2.4 赤霉素（GA3）的添加對(duì)濕地松新抽芽啟動(dòng)誘導(dǎo)的影響

孫錫本等[4]研究表明，赤霉素對(duì)蘋果側(cè)芽萌發(fā)有明顯的促進(jìn)作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)赤霉素處理30 d后外植體均沒有增殖出側(cè)芽，表明在GD+4 mg/L 6-BA+0.2 mg/LNAA培養(yǎng)基中，赤霉素濃度為0、1、3、5 mg/L均對(duì)濕地松側(cè)芽的誘導(dǎo)沒有促進(jìn)作用（圖2）。

2.5 赤霉素（GA3）對(duì)經(jīng)6-BA處理過的濕地松新抽芽啟動(dòng)誘導(dǎo)的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度6-BA處理過的外植體轉(zhuǎn)接到GD+4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+GA3（0、1 mg/L）的培養(yǎng)基中，30 d后觀察到萌動(dòng)的外植體轉(zhuǎn)入不含赤霉素的培養(yǎng)基中只長出頂芽和針葉，沒有側(cè)芽（圖3B），沒有萌動(dòng)的外植體轉(zhuǎn)入不含赤霉素的培養(yǎng)基后略微露出頂芽（圖3A）；萌動(dòng)的外植體在含赤霉素的培養(yǎng)基中成功誘導(dǎo)出側(cè)芽（圖3D），而沒有萌動(dòng)的外植體即使轉(zhuǎn)入含赤霉素的培養(yǎng)基中，也不能誘導(dǎo)出側(cè)芽（圖3C）。表明經(jīng)高濃度6-BA處理后，赤霉素對(duì)萌動(dòng)的外植體的側(cè)芽增殖起促進(jìn)作用。

2.6 6-BA、NAA組合對(duì)濕地松新抽芽初代誘導(dǎo)的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，GD+6 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA（圖4F）和GD+8 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA（圖4H）成功誘導(dǎo)出側(cè)芽或不定芽，增殖出的側(cè)芽在后期培養(yǎng)中生長良好（圖5），其余處理的外植體在培養(yǎng)過程中有的褐化死亡；有的長出小芽點(diǎn)（圖4B、4E），后期死亡。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，在4月中下旬采集的外植體比其他時(shí)間段采集的成活率高很多，為最佳采集時(shí)間。褐變是由于外植體中的多酚氧化酶被激活，使細(xì)胞的代謝發(fā)生變化，酚類物質(zhì)被氧化后產(chǎn)生呈棕褐色的醌類物質(zhì)，它們會(huì)逐漸擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，抑制其他酶的活性，毒害培養(yǎng)的材料[5]。褐變的影響因素極其復(fù)雜，隨著植物種類、基因型、外植體的部位及生理狀況等的不同，危害程度也有區(qū)別[6]。許多研究表明，選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w和培養(yǎng)條件是克服褐變的最主要手（下轉(zhuǎn)第165頁）

段。VC作為抗氧化劑有一定的抗褐變功能，本試驗(yàn)結(jié)果表明添加20 mg/L的VC對(duì)濕地松新抽芽的褐化有一定抑制作用。VC一般使用濃度為5 mg/L，本試驗(yàn)高出3倍，可能是由于材料類型、年齡等不同對(duì)VC的敏感度不同的原因。由于6-BA具有高效、穩(wěn)定、廉價(jià)和易于使用等特點(diǎn)，因而被廣泛采用，并且是組織培養(yǎng)中最常用的細(xì)胞分裂素。6-BA的主要作用是促進(jìn)芽的形成，也可以誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生。

張慶瑞等[7]研究表明，GA3具有打破芽休眠的生理作用，是影響芍藥莖尖啟動(dòng)培養(yǎng)的主要因素，在一定的濃度范圍內(nèi)隨著GA3濃度的提高，啟動(dòng)率也相應(yīng)增加。GA3與6-BA混合使用時(shí)芍藥芽萌動(dòng)快，且利于芽的高生長。張曉英等[8]研究表明，BA和IBA與GA3 配合使用有利于樹莓芽的誘導(dǎo)和生長。本試驗(yàn)結(jié)果表明，6-BA的濃度為7 mg/L時(shí)，外植體的萌動(dòng)最明顯，其他濃度有稍微的萌動(dòng)；GD+4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+1 mg/L GA3對(duì)經(jīng)高濃度6-BA處理后萌動(dòng)的外植體的側(cè)芽增殖起促進(jìn)作用。GD+4 mg/L 6-BA+NAA 0.2 mg/L+0、1、3、5 mg/L GA3的培養(yǎng)基均對(duì)新采集的外植體側(cè)芽的誘導(dǎo)沒有促進(jìn)作用。6-BA、NAA組合試驗(yàn)表明，GD+6 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA、GD+8 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA成功誘導(dǎo)出側(cè)芽或不定芽，增殖出的側(cè)芽在后期培養(yǎng)中生長良好。由于試驗(yàn)材料有限，本試驗(yàn)未獲得大量側(cè)芽，同時(shí)也說明了濕地松側(cè)芽增殖的條件是復(fù)雜的，要建立高效穩(wěn)定的側(cè)芽增殖體系，還需要做進(jìn)一步的研究。

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