2，4—D殘留免疫學(xué)檢測(cè)方法研究進(jìn)展

欒姝

摘要 概述環(huán)境樣品、生物樣品和各類(lèi)農(nóng)作物等樣品中2，4-D殘留的免疫學(xué)檢測(cè)方法的研究進(jìn)展，并指出免疫學(xué)檢測(cè)方法在使用中存在的問(wèn)題和未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞 2，4-D；免疫學(xué)檢測(cè)方法；殘留；研究進(jìn)展

中圖分類(lèi)號(hào) S481.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2016）05-0141-02

2，4-D又稱為2，4-滴、2，4-D酸，化學(xué)名為2，4-二氯苯氧乙酸，低濃度的2，4-D常用作植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，主要作用是提高坐果，誘導(dǎo)單性結(jié)實(shí)，促進(jìn)果實(shí)生長(zhǎng)，防止采前落果，高濃度的2，4-D常作為除草劑，還常用作果蔬保鮮劑。2，4-D屬于低毒性農(nóng)藥，在自然條件下不易降解，并且水溶性差，吸附性較強(qiáng)，易殘留于植物表面[1]，使用不當(dāng)會(huì)造成藥害，甚至造成環(huán)境污染。2，4-D可在生物體內(nèi)積累，在較高劑量時(shí)具有致畸性，同時(shí)它具有潛在的致癌性、致突變性，是一種內(nèi)分泌干擾物質(zhì)，對(duì)免疫系統(tǒng)和生育系統(tǒng)具有不良影響[2-6]。因此，尋找一種高效、便捷、快速的殘留檢測(cè)方法具有非常重要的意義。

我國(guó)規(guī)定生活飲用水中2，4-D限量為0.03 mg/L[7]，檢測(cè)方法為GC-ECD法[8]；還制定了食品中2，4-D的限量[9]和GC-ECD和HPLC-MS的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[10-11]。目前，國(guó)內(nèi)外的2，4-D殘留檢測(cè)方法絕大多數(shù)為GC-ECD或HPLC-UV檢測(cè)。GC法不僅需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，而且需要衍生化，較為繁瑣；HPLC-UV檢測(cè)成本相對(duì)較低，但是對(duì)于痕量檢測(cè)，紫外檢測(cè)器的定性能力不足，必須消除基質(zhì)的干擾，其可靠性不如MS檢測(cè)器。HPLC-MS定性準(zhǔn)確，靈敏度好，但設(shè)備昂貴，同時(shí)必須考慮基質(zhì)效應(yīng)對(duì)目標(biāo)分子離子化效率的影響?？傊瑑x器檢測(cè)方法不僅儀器昂貴，檢測(cè)費(fèi)用高，樣品前處理方法繁瑣，并且需要專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員操作，而近些年來(lái)新興起的免疫學(xué)分析技術(shù)在這方面具有很大的發(fā)展前景。

1 免疫學(xué)檢測(cè)方法

免疫分析法（IA）是利用抗體對(duì)目標(biāo)檢測(cè)物抗原進(jìn)行特異性識(shí)別的特性，從而達(dá)到定性和定量分析的分析技術(shù)。

1.1 酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定是將抗原或抗體吸附在固相載體表面，通過(guò)加入酶標(biāo)抗體或抗原，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，形成酶標(biāo)免疫復(fù)合物，洗滌后，游離的酶標(biāo)抗體或抗原被洗掉，再加入酶底物與免疫復(fù)合物結(jié)合顯色，進(jìn)而進(jìn)行定性或定量測(cè)定。

于基成等[12]通過(guò)活化酯法和混合酸酐法合成2，4-D-BSA和2，4-D-OVA，再分別采用UV法和間接ELISA法進(jìn)行鑒定。結(jié)果是2種方法合成的完全抗原中2，4-D和蛋白質(zhì)的偶聯(lián)比分別為24∶1和17∶1，抗血清效價(jià)為1.28×104～2.56×104，成功合成了2，4-D 的完全抗原。許 艇等[13]制備了2，4-D特異性多克隆抗體，用間接ELISA法檢測(cè)抗血清效價(jià)和競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法檢測(cè)2，4-D。結(jié)果2，4-D與BSA和OVA的偶聯(lián)比率分別為32∶1 和18∶1，抗血清效價(jià)>6.4×105，在優(yōu)化條件下2，4-D檢測(cè)限達(dá)37 ng/mL。李會(huì)娜等[14]也做了相關(guān)研究，獲得的抗血清效價(jià)達(dá)1.6×105，2，4-D檢測(cè)限達(dá)50 ng/mL，李會(huì)娜等[15]隨后又用該方法測(cè)定了地下水、蔬菜和原糧等樣品中的2，4-D含量。檢測(cè)樣品中的2，4-D含量變異系數(shù)<15%，樣品回收率誤差在<15%。上述方法抗體對(duì)2，4-D的檢測(cè)靈敏度不高，影響因素可能是抗體對(duì)2，4-D與載體蛋白之間的連接鍵的親和力強(qiáng)于對(duì)2，4-D的親和力；或2，4-D與載體蛋白偶聯(lián)過(guò)程中改變了2，4-D分子中的電子云排布，出現(xiàn)新的空間構(gòu)象，從而產(chǎn)生了一些針對(duì)這些空間構(gòu)象特異性抗體。因此，若要提高2，4-D的檢測(cè)靈敏度，需改變免疫原的合成方法或者制備高特異性的單克隆抗體。王升吉等[16]通過(guò)改良EDC法，最終獲得的2，4-D類(lèi)農(nóng)藥多克隆抗體對(duì)目標(biāo)檢測(cè)物2，4-D、2，4-Dbutyl ester靈敏度與上述方法相比確有提高，抑制中濃度（I50）、檢測(cè)限（I20）分別為2，4-D 179.80、1.09 ng/mL；2，4-D butyl-ester 3 010.00、1.53 ng/mL。余若禎等[17]制備了小分子環(huán)境污染物的多克隆抗體，優(yōu)化了抗原合成的多種反應(yīng)條件，得到了多種結(jié)合比的2，4-D-BSA完全抗原。首次通過(guò)balb/c小鼠的免疫試驗(yàn)評(píng)價(jià)不同結(jié)合比完全抗原的免疫性能。隨后余若禎等[18]又采用自行制備的2，4-D單克隆特異性抗體，建立了水中2，4-D的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法。采用添加乙醇的反應(yīng)緩沖體系削弱樣品基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。但是平行樣品測(cè)定數(shù)據(jù)之間的變異系數(shù)較大，需要進(jìn)一步改進(jìn)檢測(cè)方法。龔 芳等[19-21]在成功獲得了特異性好、親和力較高的鼠源抗2，4-D多克隆抗體血清之后，又通過(guò)雜交瘤細(xì)胞技術(shù)成功獲得了高敏感性、高親和力和高特異性的2，4-D單克隆抗體，其篩選出的3株特異性高的雜交瘤細(xì)胞1F11、2A12、2G12單抗亞型均為lgG1型，對(duì)2，4-D的IC50分別為801、1 332、1 564 ng/mL。2，4-D單克隆抗體相比多克隆抗體靈敏度大大提高。陸 歡等[22]采用產(chǎn)自美國(guó)的水樣專(zhuān)用2，4-D試劑盒檢測(cè)青椒和番茄中殘留的2，4-D，從8種有機(jī)溶劑中篩選出基質(zhì)干擾最小的乙酸乙酯作為萃取劑。靈敏度為1.782 ng/mL，加標(biāo)回收率在74%以上。隨后，魏茂瓊等[23]也采用該試劑盒以直接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法測(cè)定蔬菜中2，4-D殘留量。并將該方法與UPLC-MS法進(jìn)行比較，2種檢測(cè)方法的靈敏度分別可以達(dá)到1.739、3.000 μg/kg。2，4-D試劑盒的問(wèn)世不僅簡(jiǎn)化了檢測(cè)的操作步驟、提高了檢測(cè)效率，并且其靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于儀器分析方法，非常經(jīng)濟(jì)實(shí)用，適合大批量樣品檢測(cè)。

1.2 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)（CLIA）

化學(xué)發(fā)光免疫分析是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)結(jié)合的新型免疫測(cè)定技術(shù)。

張 靜[24]首次獲得雞卵黃抗2，4-D多克隆抗體，并用自制的10，10′-二烯丙基-3，3′-二氨基-9，9′雙吖啶標(biāo)記抗2，4-D雞卵黃抗體，建立了2，4-D的雙抗夾心化學(xué)發(fā)光免疫分析新方法，2，4-D測(cè)定的線性范圍為7.5×10-10～7.5×10-8 g/mL，檢測(cè)限為2.04 ng/mL，土壤樣品中的2，4-D含量為24.48 pg/mL，回收率在96%～101%之間。CLIA技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、線性范圍寬、儀器簡(jiǎn)單、操作方便、無(wú)放射性污染等優(yōu)點(diǎn)，完全能夠滿足樣品中2，4-D快速檢測(cè)的要求。

1.3 酶聯(lián)熒光免疫分析技術(shù)（ELFIA）

酶聯(lián)熒光免疫分析技術(shù)是在酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的將酶系統(tǒng)與熒光免疫分析結(jié)合的快速檢測(cè)技術(shù)。它是利用理想的熒光底物代替生色底物，實(shí)現(xiàn)了提高檢測(cè)靈敏度，擴(kuò)大測(cè)量范圍以及減少試劑用量。

余宇燕等[25]采用活化酯法合成人工抗原2，4-D-BSA，通過(guò)免疫新西蘭白兔獲得抗血清2，4-D-IgG，再用異硫氛酸熒光素（FITC）標(biāo)記，得到熒光抗體。采用雙抗夾心熒光免疫分析法通過(guò)考察抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)的抑制活性來(lái)反映抗體與標(biāo)記抗體對(duì)2，4-D的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合能力。用方陣滴定方法對(duì)雙抗夾心熒光法中抗體和標(biāo)記抗體的工作濃度進(jìn)行篩選和確定。其線性范圍為0.2～10.0 μg/L，IC50=2.28，檢測(cè)限IC20=0.089 μg/L。該法制備的熒光抗體僅對(duì)2，4-D具有特異性識(shí)別能力，而對(duì)其他類(lèi)似物的交叉反應(yīng)率都較低。

1.4 膠體金層析技術(shù)（GLCA）

膠體金層析技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物應(yīng)用于免疫反應(yīng)的新型免疫標(biāo)記技術(shù)。王寶芹[26]通過(guò)優(yōu)化2，4-D膠體金探針的最佳偶聯(lián)條件，制備出2，4-D膠體金試紙條，能夠在1～2 min內(nèi)出線，從而得到一種快速檢測(cè)2，4-D的方法，檢測(cè)限為10.0 ng/mL；還制備出不同2，4-D抗體標(biāo)記的磁性探針和2，4-D-OVA標(biāo)記的熒光探針，探討出磁性探針最佳優(yōu)化條件，得到檢測(cè)限為260 mg/mL。在此基礎(chǔ)上將磁性微球換成金磁微粒，得到檢測(cè)限達(dá)30.907 ng/mL。利用膠體金試紙條原理，初步探究了制備金磁試紙條的方法。金磁標(biāo)記的層析試紙條既具有膠體金的光學(xué)性質(zhì)，能夠通過(guò)肉眼直接進(jìn)行定性分析，又具有磁性微粒的磁性，可以通過(guò)檢測(cè)磁信號(hào)進(jìn)行定量分析，大幅度提高了檢測(cè)的靈敏度，方法更簡(jiǎn)捷、效果更直觀，并且無(wú)需昂貴儀器檢測(cè)，適用于2，4-D樣品的快速檢測(cè)、臨場(chǎng)檢測(cè)以及高通量檢測(cè)。

1.5 免疫傳感器技術(shù)

免疫傳感器的結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)的生物傳感器相似，可分為生物敏感膜、換能器和信號(hào)數(shù)據(jù)處理器3個(gè)部分，其中生物敏感膜的構(gòu)建是決定免疫分析的關(guān)鍵。當(dāng)待測(cè)物與分子識(shí)別元件特異性結(jié)合后，所產(chǎn)生的復(fù)合物通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢暂敵龅碾娦盘?hào)、光信號(hào)，從而達(dá)到分析檢測(cè)的目的。

蔡 強(qiáng)等[27]以EDC作為交聯(lián)劑，制備偶聯(lián)物（2，4-D-BSA以及2，4-D-PLL），以2，4-D∶偶聯(lián)物=1∶16制備兔抗血清。采用絲網(wǎng)印刷工藝制備電極，通過(guò)酶促反應(yīng)檢測(cè)還原電流的原理研制出安培型免疫傳感器，并將該傳感器與傳統(tǒng)的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行比較。該方法2，4-D的檢出限達(dá)到1.69 ng/mL，線性區(qū)間1.69～30 000 ng/mL，適合飲用水中2，4-D的檢測(cè)要求。時(shí)巧翠[28]將亞鐵氰化鉀溶液包埋于脂質(zhì)體中，脂質(zhì)體中的亞鐵氰化鉀溶液，通過(guò)戊二醛溶液的作用，與2，4-D免疫抗體溶液交聯(lián)。采用自制MWNT′s修飾的石墨電極插入脂質(zhì)體—抗體—吡咯溶液中，通過(guò)方波伏安法測(cè)定電流值。應(yīng)用該法檢測(cè)尿樣中2，4-D，其線性范圍在0.05～2.50 mg/L之間，檢出限為15.4 μg/L。免疫傳感器具有靈敏度高、儀器簡(jiǎn)單、方法靈活多樣等優(yōu)點(diǎn)，但是自制設(shè)備之間往往存在差異。

1.6 納米金技術(shù)

納米金技術(shù)是以納米金為免疫標(biāo)記物的檢測(cè)技術(shù)，其本質(zhì)是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到納米金顆粒表面的包被過(guò)程。鐘菲菲等[29]利用靜電吸附作用，將2，4-D抗體固定在由自組裝L-半胱氨酸和靜電吸附納米金修飾的金電極表面，制備出無(wú)試劑型的免疫傳感器，通過(guò)交流阻抗技術(shù)考察了電極的電化學(xué)特性。2，4-D的檢測(cè)范圍為1～5 000 ng/mL，檢出限為0.5 ng/mL。該方法提高了2，4-D抗體的固定量，增強(qiáng)了傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性。魯 哲[1]采用壓電間接競(jìng)爭(zhēng)免疫法來(lái)檢測(cè)2，4-D，通過(guò)使用納米金作二抗標(biāo)記物以放大響應(yīng)信號(hào)，2，4-D檢出限為13.0 ng/mL，該傳感器再生性較好，可重復(fù)使用9次以上且其靈敏度沒(méi)有明顯降低；之后也采用自組裝技術(shù)與免疫競(jìng)爭(zhēng)技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建安培型生物免疫傳感器，檢測(cè)2，4-D。通過(guò)在電極上進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)，用納米金標(biāo)記的羊抗鼠lgG抗體將信號(hào)進(jìn)一步放大，提高檢測(cè)靈敏度，使用交流伏安法進(jìn)行檢測(cè)。2，4-D檢出限為0.1 ng/mL。以納米金為標(biāo)記物的免疫分析快速檢測(cè)技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)。

2 展望

免疫學(xué)分析技術(shù)應(yīng)用抗原抗體的特異性結(jié)合制備的高特異性多克隆抗體或單克隆抗體來(lái)快速檢測(cè)樣品中2，4-D的殘留，可達(dá)到比儀器檢測(cè)更高的靈敏度。該技術(shù)在樣品前處理方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，大多數(shù)水樣只需離心或微孔濾膜過(guò)濾后就可直接檢測(cè)，土壤或農(nóng)作物樣品經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑提取后，適度稀釋就能很好地消除基質(zhì)影響。但是，該類(lèi)方法尚未成熟，存在假陰性率和假陽(yáng)性率高的問(wèn)題，有待于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究。目前，國(guó)外已經(jīng)研制出2，4-D的免疫檢測(cè)試劑盒和試紙條，而我國(guó)正處于研發(fā)階段，若能研制成功，使其商業(yè)化，不僅降低了檢測(cè)成本，而且便于普及，更加省時(shí)、省力、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保，為國(guó)民安全飲食、中毒事件的甄別、環(huán)境保護(hù)等方面做出巨大貢獻(xiàn)。

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