柯正辰　辛梓　肖雅玲

摘要 作為一種廣泛使用的飼料添加劑，洛克沙胂經(jīng)由畜禽糞便進(jìn)入環(huán)境，產(chǎn)生潛在的砷污染。自然環(huán)境中，降雨變化具有時(shí)空分布不均勻性，導(dǎo)致土壤含水率時(shí)刻發(fā)生變化，從而對(duì)洛克沙胂的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生影響。本研究選取自然界中常見(jiàn)的奧奈達(dá)湖希瓦氏菌（Shewanella oneidensis MR-1）為模型微生物，利用多孔介質(zhì)石英砂作為模擬土壤的介質(zhì)，研究洛克沙胂在不同含水率情形下的生物轉(zhuǎn)化情況。研究結(jié)果表明，含水率的變化對(duì)于洛克沙胂的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程影響明顯。在低含水率的條件下（12.50%），洛克沙胂難以被希瓦氏菌轉(zhuǎn)化；而當(dāng)含水率提升后，洛克沙胂才能夠被S.oneidensis MR-1轉(zhuǎn)化。通過(guò)砷平衡分析可以看出3-氨基-4-羥基苯胂酸為洛克沙胂生物轉(zhuǎn)化的唯一產(chǎn)物，未檢測(cè)出無(wú)機(jī)形態(tài)砷。

關(guān)鍵詞 洛克沙胂；希瓦氏菌；含水率；多孔介質(zhì)；生物轉(zhuǎn)化

中圖分類號(hào) X53 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2016）05-0209-03

Abstract Roxarsone，one of wildly used animal additives，will enter in environment via the manure of poultry or livestocks，resulting in potential arsenic pollution risks.Due to the space-time heterogeneity of rainfall，soil moisture content fluctuated constantly，consequently influencing roxarsone biotransformation process.In this study，Shewanella oneidensis MR-1 and quartz sand were selected to represent as model bacteria and simulated medium，respectively，and the biotransformation process of roxarsoneat various moisture content were investigated.Results showed that moisture content remarkably affected roxarsone biotransformation.At low moisture content（12.50%），roxarsone was hardly transformed.While moisture content elevated，the majority of roxarsone could be reduced to HAPA as the sole product.Meanwile，no inorganic arsenic could be dectected.

Key words roxarsone；Shewanella oneidensis MR-1；moisture content；porous media；biotransformation

洛克沙胂（Roxarsone，3-硝基-4-羥基苯胂酸），因可促生長(zhǎng)、抑制寄生蟲、使皮毛光滑以及提高喂食效率和產(chǎn)蛋率，近幾十年來(lái)作為畜禽飼料添加劑被廣泛應(yīng)用[1-8]，我國(guó)肉雞飼養(yǎng)業(yè)每年排放到環(huán)境中的洛克沙胂及其代謝物約1 000 t，加上養(yǎng)豬業(yè)，排放量更高[9]。洛克沙胂本身是一種低毒性的有機(jī)胂制劑，會(huì)被畜禽以原形排到自然環(huán)境中，但暴露在自然環(huán)境或者堆肥過(guò)程中的洛克沙胂則有可能轉(zhuǎn)化成高毒性形態(tài)的砷化物，產(chǎn)生砷污染危害[10-13]。洛克沙胂在自然環(huán)境中主要轉(zhuǎn)化為三價(jià)砷化物、五價(jià)砷化物、一甲基胂酸（DMA）、二甲基胂酸（MMA）以及3-氨基-4-羥基苯胂酸（HAPA），其中三價(jià)砷化物毒性最高，對(duì)環(huán)境危害巨大[5，11-14]。

希瓦氏菌（S.oneidensis MR-1）是一種兼性厭氧菌，在土壤、海洋和其他水體中廣泛存在，最適生長(zhǎng)溫度一般在25～40 ℃之間[15]，能在厭氧條件下利用多種電子受體，包括鐵（Ⅲ）、硝酸鹽、亞硝酸鹽和重金屬離子等，進(jìn)行產(chǎn)能代謝和電子傳遞[16]。在自然土壤中，由于降雨的時(shí)空不均勻性，其含水率時(shí)刻發(fā)生變化，對(duì)生存其中的土壤微生物產(chǎn)生巨大影響。因此，研究含水率的變化對(duì)于深刻理解洛克沙胂的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程至關(guān)重要。本文利用多孔介質(zhì)石英砂作為模擬土壤的介質(zhì)，選取了奧奈達(dá)湖希瓦氏菌（Shewanella oneidensis MR-1）作為模型微生物，研究其在不同含水率情形下的轉(zhuǎn)化過(guò)程，明確洛克沙胂在土壤中的生物轉(zhuǎn)化機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌種培養(yǎng)

S.oneidensis MR-1（MCCC 1A01706）細(xì)菌由中國(guó)海洋微生物菌種保藏管理中心提供，凍干管中的菌種經(jīng)活化后使用。將菌種置于LB培養(yǎng)基中，在30 ℃下避光靜置培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體在高速離心機(jī)（Eppendorf，5810R）中以90 000×g離心10 min后收集，用經(jīng)滅菌的基礎(chǔ)試驗(yàn)培養(yǎng)基重復(fù)洗滌3次、重懸。整個(gè)試驗(yàn)中所用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為50 mmol/L碳酸氫鈉緩沖培養(yǎng)基[17]?；A(chǔ)培養(yǎng)基使用之前置于121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌20 min，冷卻后加入30 mmol/L乳酸鹽，并調(diào)pH值為7.0。

1.2 多孔介質(zhì)的制備

在整個(gè)試驗(yàn)中，石英砂（270 μm）作為多孔介質(zhì)，用去離子水洗滌3次，105 ℃烘干備用。石英砂使用之前用121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌20 min。

1.3 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)在滅菌過(guò)的50 mL離心管中進(jìn)行，每個(gè)離心管中分裝4 g石英砂。通過(guò)稱重法，測(cè)得這4 g石英砂的飽和含水率為40.25%。為了研究從干燥到飽和含水率之間不同情況，本試驗(yàn)設(shè)置含水率梯度為12.50%、25.00%、35.00%、40.25%、100.00%。將重懸的細(xì)菌液與培養(yǎng)基以及洛克沙胂（純度>99%，Sigma-Aldrich）混合均勻，保證細(xì)菌濃度、乳酸鹽濃度和洛克沙胂濃度分別為8.0×106 cells/mL，50 mmol/L和1 mmol/L。分別向離心管中加入不同份量以上混合液，控制含水率水平。分別在0、20、35、85 h進(jìn)行采樣分析。該試驗(yàn)在厭氧條件下避光完成，控制溫度為（30.0±0.5）℃。所有試驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)平行樣，樣品使用同樣的方法進(jìn)行測(cè)試分析。

1.4 樣品提取

取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的離心管，加入磷酸鹽緩沖溶液（0.1 mol/L的H3PO4溶液和0.1 mol/L的NaH2PO4·2H2O溶液以1∶9的體積比混合）20 mL，放入超聲震蕩器中超聲震蕩4 min，取上清液3 mL，用分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度計(jì)算生物量。剩余樣品經(jīng)55 ℃水浴加熱10 h，然后在10 000×g下離心5 min取上清液過(guò)0.22 μm水系微孔濾膜，放入4 ℃冰箱待測(cè)[8，12]。

1.5 生物量的測(cè)定

本試驗(yàn)的細(xì)菌生物量由紫外分光光度計(jì)（UV-2600，Unico Instrument Co.，Ltd.）以及吖啶橙熒光染色計(jì)數(shù)法確定[18]。吖啶橙熒光染色之后的菌液濾過(guò)0.2 μm的黑色聚碳酸酯濾膜（Whatman，25 mm diameter），將濾膜固定在載玻片上，在激光共聚焦顯微鏡（FV1000，Olympus Co.，Japan）下鏡檢計(jì)數(shù)，整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程在暗室中進(jìn)行，盡量避光以防熒光淬滅[19]。并與菌液在600 nm下測(cè)得的吸光度呈對(duì)應(yīng)關(guān)系，做成標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗(yàn)中的樣品測(cè)得吸光度后可參照標(biāo)準(zhǔn)曲線得到細(xì)菌的生物量。

1.6 分析方法

洛克沙胂和HAPA的濃度由高效液相色譜儀（HPLC 1260，Agilent Technology）測(cè)定，使用的色譜柱為Elite Hyper-silODS2 column（4.6 mm× 150 mm，5 μm），用純凈水配置10 mmol/L磷酸二氫鉀溶液pH值調(diào)至7.2作為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10.0 μL，洛克沙胂和HAPA的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為450 nm和300 nm，柱溫設(shè)置為（30.0±0.5）℃[8]。

包括三價(jià)砷化物、無(wú)價(jià)砷化物在內(nèi)的無(wú)機(jī)砷檢測(cè)由高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光聯(lián)用技術(shù)（HPLC-HG-AFS）得到，試驗(yàn)方法參考Huang等[12]的方法。

乳酸鹽濃度的測(cè)定由高效液相色譜儀（HPLC 1260，Agilent Technology）測(cè)定，使用的色譜柱為CNW Sep H-M column（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為用純凈水和優(yōu)級(jí)純硫酸配置的2.5 mmol/L硫酸溶液，流速為0.25 mL/min，進(jìn)樣量為2.0 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫保持在為（55.0±0.5）℃[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 含水率變化對(duì)希瓦氏菌生物量的影響

從圖1中可以看出，整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，含水率水平在12.50%和25.00%的試驗(yàn)組細(xì)菌數(shù)目幾乎沒(méi)有變化，維持在初始濃度水平，說(shuō)明該含水率水平不足以提供希瓦氏菌生長(zhǎng)繁殖所必須的水環(huán)境。而當(dāng)試驗(yàn)含水率提高到35.00%以上時(shí)，細(xì)菌數(shù)量則優(yōu)明顯增長(zhǎng)。在試驗(yàn)進(jìn)行到20 h時(shí)，含水率為35.00%的試驗(yàn)組細(xì)菌數(shù)目達(dá)到1.23×107 cells/mL；飽和含水率40.25%以及100%含水率水平組中細(xì)菌數(shù)目濃度接近，達(dá)到1.29×107 cells/mL左右。

隨著試驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)，不同含水率水平試驗(yàn)組中細(xì)菌數(shù)目差距變大，含水率水平高的細(xì)菌生物量大，含水率水平低的細(xì)菌生物量小。在飽和含水率40.25%以及含水率100.00%的2組，由于后者能給試驗(yàn)菌種提供更好的水環(huán)境，導(dǎo)致了細(xì)菌數(shù)目上的差距增大。

2.2 含水率變化對(duì)底物乳酸鹽的影響

乳酸鹽在試驗(yàn)中為細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖提供碳源，同時(shí)提供希瓦氏菌還原洛克沙胂所需要的電子，從圖2中可以看出，試驗(yàn)中乳酸鹽的變化情況。與細(xì)菌生物量變化規(guī)律類似，在含水率水平為12.50%和25.00%的試驗(yàn)組中乳酸鹽幾乎沒(méi)有被利用，一直保持在30 mmol/L左右，這與2組試驗(yàn)中細(xì)菌數(shù)量沒(méi)有增長(zhǎng)相互印證。

在含水率較高的試驗(yàn)組中，乳酸鹽被作為碳源以及電子供體消耗，其消耗量變化趨勢(shì)與細(xì)菌數(shù)目增長(zhǎng)的量呈相對(duì)應(yīng)的關(guān)系。試驗(yàn)終止時(shí)，含水率35.00%的試驗(yàn)組中，乳酸鹽的含量為8.95 mmol/L；含水率上升到40.25%時(shí)，乳酸鹽含量下降到7.39 mmol/L。當(dāng)含水率增大到100.00%時(shí)，乳酸鹽含量最低，為1.60 mmol/L。乳酸鹽被消耗多的試驗(yàn)組試驗(yàn)終止時(shí)對(duì)應(yīng)的細(xì)菌數(shù)目含量也是最多的。

2.3 含水率水平對(duì)洛克沙胂生物轉(zhuǎn)化的影響

含水率水平明顯會(huì)影響到多孔介質(zhì)中希瓦氏菌轉(zhuǎn)化洛克沙胂，從圖3中可以看出，含水率在12.50%和25.00%時(shí)，洛克沙胂基本維持在初始添加的濃度（1.0±0.1）mmol/L，沒(méi)有被希瓦氏菌所轉(zhuǎn)化。當(dāng)含水率逐步提高后，洛克沙胂轉(zhuǎn)化效率逐步提高。在試驗(yàn)開始后的20 h，含水率水平35.00%、40.25%和100.00%試驗(yàn)組的洛克沙胂濃度分別下降為0.63、0.52、0.54 mmol/L。相對(duì)而言，含水率水平為35%的試驗(yàn)組中洛克沙胂轉(zhuǎn)化率較低，而飽和含水率40.25%以及100.00%含水率水平組中洛克沙胂轉(zhuǎn)化程度相近。這是由于在飽和含水率40.25%和100.00%含水率2組中細(xì)菌增長(zhǎng)數(shù)目相近（圖1），而且有足夠的水環(huán)境供希瓦氏菌轉(zhuǎn)移電子。在試驗(yàn)進(jìn)行到35 h，含水率35.00%、40.25%和100.00%水平組的洛克沙胂含量進(jìn)一步降低到0.19、0.13、0.06 mmol/L。結(jié)果表明，含水率水平能夠顯著影響洛克沙胂的轉(zhuǎn)化過(guò)程，并且其轉(zhuǎn)化率隨著含水率的增高而增高。洛克沙胂的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程與因?yàn)樵谠摃r(shí)刻不同含水率水平下希瓦氏菌的細(xì)菌量是不一樣的（圖1），因此能有效轉(zhuǎn)移給洛克沙胂的電子量不一樣，從而洛克沙胂被還原的量有所差別。在試驗(yàn)終止時(shí)，除了含水率水平在12.50%和25.00%的試驗(yàn)組，洛克沙胂均已完全轉(zhuǎn)化。

2.4 不同含水率條件下HAPA的生成情況

在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，HAPA濃度如圖4所示，樣品在高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光聯(lián)用技術(shù)（HPLC-HG-AFS）檢測(cè)中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)除了洛克沙胂和HAPA以外其他形態(tài)的砷存在。

從圖4中可以發(fā)現(xiàn)，含水率為12.50%和25.00%的試驗(yàn)組中沒(méi)有檢測(cè)到HAPA的存在。隨著試驗(yàn)進(jìn)行，在第20 h，35.00%、40.25%、100.00%含水率水平的試驗(yàn)組中HAPA濃度分別為0.37、0.48、0.46 mmol/L，含水率水平為35.00%的試驗(yàn)組中HAPA濃度較低，而飽和含水率40.25%以及100.00%含水率水平組中HAPA濃度相近。在試驗(yàn)進(jìn)行到35 h，含水率35.00%、40.25%和100.00%水平組的HAPA濃度進(jìn)一步增加到0.78、0.87、0.94 mmol/L，結(jié)果表明含水率越高，洛克沙胂還原率越高。在試驗(yàn)終止時(shí)，除了含水率水平在12.50%和25.00%的試驗(yàn)組，HAPA濃度均在（1.0±0.1）mmol/L。對(duì)比2.3中洛克沙胂的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，洛克沙胂和HAPA的濃度符合砷的平衡，即在試驗(yàn)條件下，洛克沙胂完全轉(zhuǎn)化為HAPA。

3 結(jié)論

針對(duì)不同含水率情形下希瓦氏菌對(duì)洛克沙胂的生物轉(zhuǎn)化研究整個(gè)試驗(yàn)中得到的數(shù)據(jù)分析研究，得出以下結(jié)論：①多孔介質(zhì)中含水率能明顯影響希瓦氏菌轉(zhuǎn)化洛克沙胂，只有到達(dá)一定含水率水平，足夠提供希瓦氏菌生長(zhǎng)繁殖以及轉(zhuǎn)移電子的水環(huán)境，洛克沙胂才能夠被希瓦氏菌所轉(zhuǎn)化，該臨界值可以通過(guò)試驗(yàn)來(lái)確定。②在洛克沙胂能夠被希瓦氏菌所轉(zhuǎn)化的含水率條件下，含水率越高，洛克沙胂被轉(zhuǎn)化的效率越高。③在試驗(yàn)條件下，洛克沙胂被轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物全為HAPA，沒(méi)有檢測(cè)到其他形態(tài)的砷化物。

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