文/王小亮 徐立蒲 王靜波 王姝 曹歡 張文 王澎

虹鱒魚(yú)源氣單胞菌的藥物感受性及變化

文/王小亮 徐立蒲 王靜波 王姝 曹歡 張文 王澎

本文從北京市兩家虹鱒魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)的發(fā)病魚(yú)體上共分離出25株疑致病性氣單胞菌，其對(duì)磺胺類(lèi)藥物呈現(xiàn)較高的耐受性，耐藥率均在84%以上。虹鱒魚(yú)源氣單胞菌對(duì)鹽酸多西環(huán)素和氟喹諾酮類(lèi)藥物較為敏感，耐藥率均低于10%；其中鹽酸多西環(huán)素為最敏感的藥物，敏感率為100%。氟苯尼考易使病原菌短時(shí)間產(chǎn)生較高的耐藥性。研究表明不同種類(lèi)的菌株對(duì)抗菌藥物的感受性不同，同種菌的不同菌株之間對(duì)抗菌藥物的感受性也不同，需要針對(duì)具體樣品及時(shí)檢測(cè)，依據(jù)檢測(cè)結(jié)果指導(dǎo)養(yǎng)殖者合理使用抗菌藥物，才可能取得較好的效果。

當(dāng)前，細(xì)菌性疾病是危害魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖的最主要的生物源性疾病。防治細(xì)菌性疾病的主要手段是使用化學(xué)藥物，但在使用過(guò)程中藥物濫用問(wèn)題突出，主要表現(xiàn)在輕預(yù)防重治療和濫用藥物。針對(duì)藥物濫用突出問(wèn)題，已經(jīng)引起各相關(guān)部門(mén)、學(xué)者的高度關(guān)注。并開(kāi)展了相關(guān)的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用技術(shù)研究。北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站自2009年開(kāi)始在魚(yú)類(lèi)病原菌的耐藥性方面開(kāi)展研究和應(yīng)用，篩選了適合北京市養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)主要病原菌的分離、鑒定、保種方法以及病原菌藥物感受性檢測(cè)方法。

本文旨在通過(guò)開(kāi)展虹鱒魚(yú)氣單胞菌的藥物感受性普查，獲得虹鱒魚(yú)源氣單胞菌對(duì)漁用抗菌藥物感受性及其變化的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，了解和掌握抗菌藥物的使用對(duì)氣單胞菌耐藥性的變化規(guī)律，指導(dǎo)虹鱒魚(yú)養(yǎng)殖者科學(xué)合理使用漁用抗菌藥物。

一、材料和方法

1.材料

（1）菌株

2015年4月至2015年10月，從北京懷柔區(qū)順通虹鱒魚(yú)養(yǎng)殖中心和臥佛山莊養(yǎng)殖有限公司飼養(yǎng)的虹鱒魚(yú)體內(nèi)分離到25株氣單胞菌，其中嗜水氣單胞菌8株、溫和氣單胞菌9株，殺鮭氣單胞菌8株。菌株詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1.虹鱒魚(yú)源氣單胞菌來(lái)源

（2）儀器和試劑

超低溫冰箱（MDF-382，日本SANYO公司）、生化培養(yǎng)箱（LRH-150B，上海一恒公司）、細(xì)菌濁度計(jì)（WGZ-2-X，上海昕瑞儀器儀表有限公司）、PCR儀（Mastercycle Gradient，德國(guó)Eppendorf公司）、電泳儀（DYY-6C，北京六一儀器廠）、凝膠成像系統(tǒng)（IS-3400， Alpha Innotech 公司）。

Mulluer-Hinton肉湯（MHB）和RS瓊脂購(gòu)于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（BHI）和腦心浸液瓊脂（BHIA）購(gòu)于英國(guó)OXOID公司。鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考、甲砜霉素、鹽酸諾氟沙星、乳酸諾氟沙星、磺胺嘧啶鈉、磺胺二甲氧嘧啶鈉、新諾明等9種抗菌藥物為原料藥。

2.方法

（1）采樣方法

采樣方法為固定每月中旬采樣1次，在虹鱒魚(yú)發(fā)病時(shí)，及時(shí)采集樣品；未發(fā)病時(shí)，取池塘中游動(dòng)緩慢的魚(yú)（不少于6尾）和原池水裝入高壓聚乙烯袋，加冰塊，立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。采集樣品時(shí)，記錄漁場(chǎng)的發(fā)病情況、發(fā)病水溫、用藥情況、魚(yú)類(lèi)死亡情況等信息。

（2）病原菌分離、鑒定方法

取4尾病虹鱒魚(yú)，分別無(wú)菌操作取肝、腎組織塊，首先接種于腦心浸液肉湯（BHI），然后在腦心浸液瓊脂（BHIA）劃線分離。前者22℃增菌24小時(shí)～48小時(shí)，然后采用RS瓊脂劃線分離，選擇黃色、圓形、微凸且有芳香性氣味的菌落進(jìn)行純化。后者于22℃培養(yǎng)72小時(shí)，若出現(xiàn)產(chǎn)褐色素的菌落，則分離純化。

純化的菌落采用API鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，如為氣單胞菌，則采用BHI在適宜溫度增菌16小時(shí)～20小時(shí)，-80℃保存。若產(chǎn)褐色素的菌落，PCR 擴(kuò)增16S rDNA基因，測(cè)序判定為殺鮭氣單胞菌，則增菌后-80℃保存。

（3）菌株的藥物感受性檢測(cè)方法

藥敏檢測(cè)借鑒美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)制定的《抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)（2010年）》，采用其中的濃度梯度稀釋法（定量法），培養(yǎng)溫度調(diào)整為28℃，敏感線依同類(lèi)藥物界定，自定標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)沒(méi)有的抗菌藥物的敏感線。不同種類(lèi)抗菌藥物的溶劑及界定的敏感線見(jiàn)表2。

表2.水產(chǎn)用抗菌藥物的溶劑及界定的敏感線

（4）結(jié)果記錄和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

結(jié)果記錄為將加菌的藥物濃度梯度管與對(duì)應(yīng)的未加菌的藥物濃度梯度管比較，肉眼觀察試管中培養(yǎng)基變渾濁，即為未抑制菌生長(zhǎng)，反之，為抑制菌生長(zhǎng)。將抑制菌生長(zhǎng)的試管中藥物濃度最低的值最為最小抑菌濃度（MIC），記錄該藥物抑制檢測(cè)菌的MIC值。

耐藥率=（高于耐藥MIC值的菌株數(shù)÷總檢測(cè)菌株數(shù)）×100%，加權(quán)平均MIC=∑（菌株數(shù)×對(duì)應(yīng)的MIC值）/菌株總數(shù)。

二、結(jié)果

1.疾病種類(lèi)及用藥情況

在監(jiān)測(cè)期間，虹鱒魚(yú)發(fā)生的主要病害臨床癥狀主要表現(xiàn)為：眼突出、眼潰爛、水霉、疥瘡等，其中由殺鮭氣單胞菌引起的疾病和不明病因病造成的經(jīng)濟(jì)損失最為嚴(yán)重，殺鮭氣單胞菌病造成的經(jīng)濟(jì)損失約500kg。其中，順通養(yǎng)殖場(chǎng)的虹鱒在4月份發(fā)生突眼病，采用過(guò)氟苯尼考和嗯諾沙星，使用時(shí)間3天，使用劑量均為10mg/kg魚(yú)。在6月13日發(fā)生殺鮭氣單胞菌?。ê蟠_診），連續(xù)使用7天氟苯尼考，劑量約為20mg/kg魚(yú)；使用3天嗯諾沙星，劑量約為15mg/kg魚(yú)；后采用鹽酸土霉素和三黃粉。9月初，發(fā)生不明病因病，使用氟苯尼考，劑量約為15mg/kg魚(yú)。兩個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)采用的藥物種類(lèi)和總用量如下：聚維酮碘8箱（500mL/瓶，20瓶/箱），鹽酸土霉素10kg，氟苯尼考2.5kg，鹽酸恩諾沙星5kg，三黃粉8.8kg。并且調(diào)查發(fā)現(xiàn)兩個(gè)虹鱒魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)曾連續(xù)多年使用氟苯尼考。

2.虹鱒魚(yú)源氣單胞菌對(duì)抗菌藥物的感受性總體情況

總體上，北京市虹鱒魚(yú)源氣單胞菌對(duì)磺胺類(lèi)藥物耐藥最為嚴(yán)重，耐藥率均在84%以上，耐藥濃度在512g/mL以上；其次是氟苯尼考和甲砜霉素，耐藥率約為60%，耐藥濃度在30g/mL以上。耐藥率低于10%的藥物種類(lèi)為乳酸諾氟沙星、煙酸諾氟沙星和鹽酸多西環(huán)素，耐藥率分別為8.0%、4.0%和0%。詳見(jiàn)表3。

表3.虹鱒魚(yú)源氣單胞菌對(duì)抗菌藥物的感受性分布表

3.不同種類(lèi)病原菌對(duì)抗菌藥物的感受性

從表4可以看出，不同種類(lèi)的菌株對(duì)抗菌藥物的感受性不一樣，如嗜水氣單胞菌對(duì)乳酸諾氟沙星的耐藥率達(dá)25.0%，而溫和氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌的耐藥率為0%。溫和氣單胞菌對(duì)硫酸新霉素的耐藥率為55.6%，嗜水氣單胞菌的耐藥率為25.0%，殺鮭氣單胞菌為0%，加權(quán)平均MIC值也有較大差異。另外，同種菌的不同菌株之間對(duì)抗菌藥物的感受性也不一樣，例如溫和氣單胞菌對(duì)乳酸諾氟沙星的感受性，有些MIC為8g/mL，有些為0.5g/mL，有些則≤0.25g/mL。

表4.不同病原菌種類(lèi)的加權(quán)平均MIC值和耐藥率

4.病原菌隨使用抗菌藥物的感受性變化

將順通養(yǎng)殖場(chǎng)不同日期分離的虹鱒魚(yú)病原菌的MIC值進(jìn)行加權(quán)平均，形成病原菌加權(quán)平均MIC值隨時(shí)間的變化圖（見(jiàn)圖1）。顯然，病原菌的加權(quán)MIC值隨藥物的使用呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而隨藥物的停用逐漸下降。說(shuō)明藥物使用與病原菌的加權(quán)平均MIC值呈正相關(guān)性。其中氟苯尼考在使用過(guò)程中，更易使病原菌短時(shí)間產(chǎn)生較高的MIC值。

圖1.順通養(yǎng)殖場(chǎng)虹鱒魚(yú)病原菌加權(quán)平均MIC值隨時(shí)間的變化圖

三、討論

本文從北京市兩家虹鱒魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)的發(fā)病魚(yú)體上共分離出25株疑致病性氣單胞菌，其對(duì)磺胺類(lèi)藥物呈現(xiàn)較高的耐受性，耐藥率均在84%以上。研究表明：病原菌體外耐藥體內(nèi)一定耐藥。因此，這兩家養(yǎng)殖場(chǎng)現(xiàn)階段暫不能使用該類(lèi)藥物用于虹鱒魚(yú)的疾病防治。

氟苯尼考是我國(guó)1999年批準(zhǔn)的一種新型的動(dòng)物專(zhuān)用的氯霉素類(lèi)廣譜抗生素，曾廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖生產(chǎn)。近年的室內(nèi)研究報(bào)道，氟苯尼考容易使病原菌短時(shí)間產(chǎn)生較高的耐藥性，并且耐藥性消失較慢。本文從養(yǎng)殖場(chǎng)獲取的數(shù)據(jù)驗(yàn)證了這一結(jié)論。同時(shí)，抗菌藥物的使用與氣單胞菌的MIC值呈正相關(guān)，即使按標(biāo)準(zhǔn)劑量使用抗菌藥物也會(huì)使氣單胞菌的耐藥濃度數(shù)倍增加。并且，使用嗯諾沙星會(huì)使氣單胞菌對(duì)同類(lèi)藥物的耐藥性增加。

本文檢測(cè)的虹鱒魚(yú)源氣單胞菌對(duì)鹽酸多西環(huán)素和氟喹諾酮類(lèi)藥物較為敏感，耐藥率均低于10%。其中鹽酸多西環(huán)素為最敏感的藥物，敏感率為100%。由于不同養(yǎng)殖場(chǎng)、不同病原菌種類(lèi)、甚至同種病原菌的不同菌株對(duì)抗菌藥物的感受性不同，因此在實(shí)際生產(chǎn)中針對(duì)某一漁場(chǎng)樣品，需要針對(duì)具體樣品及時(shí)檢測(cè)，依據(jù)檢測(cè)結(jié)果指導(dǎo)養(yǎng)殖者合理使用抗菌藥物，才可能取得較好的效果。本文的結(jié)果，可以用于養(yǎng)殖場(chǎng)無(wú)法送樣時(shí)，可參考使用文中的敏感藥物及劑量。

本文采用的兩種氟喹諾酮類(lèi)藥物乳酸諾氟沙星和煙酸諾氟沙星已經(jīng)于2016年1月1日起禁止用于養(yǎng)殖生產(chǎn)，屆時(shí)可采用該類(lèi)藥物中的嗯諾沙星。

采用藥物控制細(xì)菌性疾病，只是魚(yú)病診治過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，在考慮到使用敏感藥物種類(lèi)及劑量情況下，還應(yīng)同時(shí)關(guān)注養(yǎng)殖水環(huán)境以及魚(yú)體免疫水平的改善。

作者單位：北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站