李燦 王永清

摘要[目的]研究一種或多種適合春劍（Cymbidum longibracteatum）愈傷組織誘導(dǎo)的方法，并試圖找到有效控制褐化的措施。[方法]以春劍花梗為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)，通過正交設(shè)計(jì)研究不同基本培養(yǎng)基及激素配比對花梗培養(yǎng)時(shí)褐化、生長和愈傷組織發(fā)生的影響；同時(shí)研究不同防褐化處理對花梗切段褐化率的影響。[結(jié)果]不同基本培養(yǎng)基及激素配比對花梗培養(yǎng)的影響顯著，不同處理方式對花梗褐化控制效果顯著?；üＧ卸斡鷤M織誘導(dǎo)的最佳配方為B5+2，4D 2.0 mg/L+TDZ 0.6 mg/L +GA30.5 mg/L，誘導(dǎo)率為7.32%。當(dāng)花芽長度為2.0 cm時(shí)，花梗褐化率較低；當(dāng)花梗切割厚度為8.0 mm時(shí)，花梗褐化率較低；PVP、VC、CA、8HQS對花梗切段褐化均有顯著的抑制作用，其中以8HQS效果最好。[結(jié)論]建立了春劍花梗離體培養(yǎng)技術(shù)體系，為春劍快速繁殖和遺傳育種奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞春劍；花梗；離體培養(yǎng)；愈傷組織誘導(dǎo)；褐化

中圖分類號S604+.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2016）04-178-05

Study on in vitro Culture of Peduncle in Cymbidium longibracteatum

LI Can， WANG Yongqing* （College of Landscape Architecture， Sichuan Agricultural University， Chengdu， Sichuan 611130）

Abstract[Objective] The aim was to find the best way of callus induction for Cymbidium longibracteatum and the effective measures for browning control. [Method] C. longibracteatum peduncle was used as explants for in vitro culture. The effects of different basic medium and hormones on browning， growth and callus induction were studied through orthogonal design， as well as effects of different browning control treatments on browning in peduncle cutting culture.[Result] Different basic culture mediums and hormone combinations had significant effects on peduncle culture， different treatments had significant controlling effects on browning. The best medium for callus induction from peduncle was B5 +2，4D 2.0 mg/L +TDZ 0.6 mg/L +GA3 0.5 mg/L， resulting in 7.32% of callus induction.When the length of flower bud was 2 cm， the peduncle had low browning rate； peduncle explants of 8 mm thickness had the lowest rate of browning； PVP， VC， Citric acid and 8HQS had significant effects on browning control， but 8HQS displayed best results. [Conclusion] The in vitro culture technology system of Cymbidium longibracteatum peduncle is established， which will lay a foundation for rapid propagation and genetic breeding.

Key wordsCymbidium longibracteatum； Peduncle； in vitro culture； Callus induction； Browning

蘭花（Cymbidium ssp.）屬于蘭科蘭花屬植物，是我國的傳統(tǒng)名花，包括春蘭、建蘭、蕙蘭、墨蘭、寒蘭等，其中春劍（C.longibracteatum）名品較多，為春蘭的變種，稀少而珍貴，而常規(guī)的分株繁殖很難滿足愛好者的需求。蘭花新繁殖技術(shù)的探索始于20世紀(jì)初，20世紀(jì)70年代后，國蘭的組織培養(yǎng)在我國興起。目前已陸續(xù)建立了建蘭、春蘭、蕙蘭、墨蘭、寒蘭等組織培養(yǎng)快速繁殖無性系[1-9]。然而國蘭離體培養(yǎng)中褐化問題較嚴(yán)重，對外植體的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)造成巨大障礙。控制褐化的常用措施有取材時(shí)間、外植體成熟度[11]、母株或外植體預(yù)處理[12]、低溫處理[13]、切口封閉[5]、吸附劑和抗氧化劑[14]、熱激處理[15]、暗培養(yǎng)[16] ，均可在一定程度上減輕褐化影響。目前國蘭組織培養(yǎng)常用種子、莖尖、側(cè)芽作為外植體建立再生體系，少數(shù)蘭花用花器官、根狀莖作為外植體。通過種子萌發(fā)的無菌苗在遺傳物質(zhì)方面較難保持母株的優(yōu)良性狀；莖尖和側(cè)芽的取材對母株傷害較大，在名品蘭花上較難應(yīng)用?；ㄑ孔鳛榇簞^容易取得的材料，如果能從花梗建立再生體系，將對春劍的快速繁殖和遺傳育種具有重要意義。筆者以春劍的花梗為外植體，研究了不同處理方法和基本培養(yǎng)基及激素配比對花梗生長和愈傷組織誘導(dǎo)的影響，同時(shí)對春劍花梗切段培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的褐化問題進(jìn)行研究，旨在找到一種合適春劍愈傷組織誘導(dǎo)的材料和方法，并試圖找到有效控制褐化的措施，以期為春劍快速繁殖和遺傳育種奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料供試材料為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝系脫毒中心室外種植春劍植株的花芽。

1.2方法

1.2.1外植體準(zhǔn)備。選取健壯植株出土飽滿的花芽，在加有洗衣粉的洗滌液中浸泡5 min，用軟毛刷輕輕刷去表面污垢，流水下清洗后，剝除2～3張苞片，然后轉(zhuǎn)入超凈工作臺，用濾紙吸干水分，用75%乙醇消毒30 s，無菌水清洗4次，再用0.1%氯化汞消毒6 min，無菌水清洗5次；剝除2～3張苞片，用0.01%氯化汞消毒3 min，無菌水清洗5次。用鑷子剝除所有的苞片，用手術(shù)刀分割花芽的花梗。

1.2.2不同基本培養(yǎng)基及激素配比對花梗培養(yǎng)的影響?；üＧ卸闻囵B(yǎng)設(shè)計(jì)了4因素（基本培養(yǎng)基種類、2，4D濃度、TDZ濃度、GA3濃度）4水平，采用5因素4水平正交設(shè)計(jì)表（表1）。

1.2.3不同處理對花梗切段褐化的影響。

1.2.3.1不同花芽大?。ǔ墒於龋üＧ卸魏只挠绊憽Ｈ〕鐾?.0（處理①）、4.0（處理②）、6.0（處理③）、8.0 cm（處理④）長的花芽，清洗消毒后，切割花梗接種于1/2MS+6BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中，每瓶接種2個(gè)外植體，每個(gè)處理接種10瓶，重復(fù)3次。

1.2.3.2不同切割厚度對花梗切段褐化的影響。將分離好的花梗進(jìn)行切割，節(jié)段厚度為2.0（處理①）、4.0（處理②）、6.0（處理③）、8.0 cm（處理④），分別接于1/2MS+6BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中，每瓶接種2個(gè)外植體，每個(gè)處理接種10瓶，重復(fù)3次。

1.2.3.3不同浸泡液對花梗切段褐化的影響。將花梗切段分別浸泡于200 mg/L聚乙烯吡咯烷酮（PVP）（處理①）、200 mg/L 抗壞血酸（VC）（處理②）、200 mg/L檸檬酸（CA）（處理③）、200 mg/L 8羧基哇琳硫酸鹽（8HQS）（處理④）、無菌水（處理⑤，CK）中；振蕩24 h，分別接于1/2MS+6BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中，每瓶接種2個(gè)外植體，每個(gè)處理接種10瓶，重復(fù)3次。

1.3培養(yǎng)條件除培養(yǎng)溫度試驗(yàn)外，其他材料培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，空氣相對濕度為70%～75%，光照強(qiáng)度為1 500～2 000 lx，光照時(shí)間為16 h/d。培養(yǎng)基蔗糖濃度30.0 g/L，瓊脂粉7.5 g/L，pH 5.5。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel和DPS版統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、方差分析及多重比較。

一級褐化率=達(dá)到一級褐化標(biāo)準(zhǔn)的外植體數(shù)未污染的外植體數(shù)×100%

二級褐化率=達(dá)到二級褐化標(biāo)準(zhǔn)的外植體數(shù)未污染的外植體數(shù)×100%

三級褐化率=達(dá)到三級褐化標(biāo)準(zhǔn)的外植體數(shù)未污染的外植體數(shù)×100%

總褐化率=褐化的外植體數(shù)未污染的外植體數(shù)×100%

轉(zhuǎn)綠百分率=轉(zhuǎn)綠的外植體數(shù)未污染的外植體數(shù)×100%

生長百分率=生長的外植體數(shù)未污染的外植體數(shù)×100%

愈傷組織誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)未污染的外植體數(shù)×100%

2結(jié)果與分析

2.1不同基本培養(yǎng)基及激素配比對花梗切段培養(yǎng)的影響由表2可知，不同基本培養(yǎng)基及激素配比對花梗切段培養(yǎng)的影響顯著，處理①褐化率最低（32.75%），與其他處理間差異均不顯著；花梗轉(zhuǎn)綠百分率最高（38.11%），只與處理⑧差異顯著。

生長百分率最高（37.01%）的配方為處理⑧，同時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率也最高為7.32%。處理①對花梗切段轉(zhuǎn)綠效果最好，配方為1/2MS+2，4D 0.5 mg/L+TDZ 0.2 mg/L；處理⑧對花梗切段生長和愈傷組織發(fā)生的效果最好，配方為B5+2，4D 2.0 mg/L+TDZ 0.6 mg/L+GA3 0.5 mg/L。

方差分析表明，2，4D對花梗切段轉(zhuǎn)綠、生長、愈傷組織誘導(dǎo)的影響達(dá)極顯著水平。進(jìn)一步對2，4D、GA3和TDZ進(jìn)行多重比較，結(jié)果表明，2，4D對花梗生長和愈傷發(fā)生的影響顯著，最適濃度為2.0 mg/L；TDZ對花梗生長的影響顯著，最適濃度為0.6 mg/L；GA3對花梗切段轉(zhuǎn)綠的影響顯著，最適濃度為0.5 mg/L。

大部分花梗切段能夠通過不同激素配比的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)綠，長時(shí)間培養(yǎng)后花梗表皮增厚，花梗切段逐漸膨大，少數(shù)外植體切口處凹凸不平，進(jìn)一步培養(yǎng)出現(xiàn)少量愈傷組織，但愈傷組織很難繼續(xù)生長并增殖，在長時(shí)間的培養(yǎng)中，愈傷組織會逐步褐化最后死亡（圖1）。

2.2不同處理對花梗切段褐化的影響

2.2.1不同花芽大小對花梗切段褐化的影響。由表3可知，不同花芽大小對花梗切段褐化的影響顯著。2.0 cm長花芽的花梗一級褐化率最低（15.79%），隨著花芽成熟度的增加花梗褐化率隨之增加，三級褐化率也隨著花芽的增大而增加， 8.0 cm長花芽的花梗褐化率最高（29.38%）。當(dāng)花芽長為2.0 cm時(shí)，花?？偤只首畹停?5.61%），當(dāng)花芽長為8.0 cm時(shí)，花梗總褐化率最高（75.74%）。花梗褐化程度見圖2。

2.2.2不同切割厚度對花梗切段褐化的影響。由表4可知，不同切割厚度對花梗一級褐化率、二級褐化率影響顯著。隨著切割厚度的增加，三級褐化率逐漸減小，2.0 mm處理的花梗三級褐化率最高（78.34%），8.0 mm處理的花梗三級褐化率最低（11.99%），同時(shí)總褐化率（58.55%）也最低。不同切割厚度花梗切段生長情況見圖3。

2.2.3不同浸泡液對花梗切段褐化的影響。由表5可知，不同浸泡液對花梗切段褐化的影響顯著。用8HQS處理的外植體一級褐化率最低（10.53%），三級褐化中，CA處理的褐化率顯著高于VC和8HQS處理；4種處理的總褐化率均顯著低于對照，其中8HQS處理的總褐化率最低（36.45%）。

3結(jié)論與討論

3.1愈傷組織的發(fā)生理論上，中國蘭各種離體器官和組織都能誘導(dǎo)形成原球莖，再經(jīng)分化培養(yǎng)形成植株。該試驗(yàn)花梗切段誘導(dǎo)過程中，培養(yǎng)60 d后，切口處誘導(dǎo)出愈傷組織，誘導(dǎo)率為7.32%，比李子紅等[17]、曾宋君等[18]采用花芽的誘導(dǎo)率高。而有些未誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體切口處或表皮處呈卵狀突起，深綠色，幼嫩，含水豐富，外表光滑，顏色稍淺，或表面有不規(guī)則凸凹，生長旺盛，與陳進(jìn)勇等[19]、項(xiàng)艷等[20]的研究結(jié)果相似。

3.2不同基本培養(yǎng)基及激素配比對外植體培養(yǎng)的影響植物外植體的誘導(dǎo)主要受基本培養(yǎng)基和激素配比的影響。不同基本培養(yǎng)基在組織培養(yǎng)中的影響較大，郭翠娥[21]研究表明1/2MS培養(yǎng)基較適合春劍芽及根狀莖誘導(dǎo)，也有研究表明B5培養(yǎng)基有利于花蕾的培養(yǎng)。該試驗(yàn)選用1/2MS、B5、花寶、KC作為花梗培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種基本培養(yǎng)基對花梗切段培養(yǎng)的影響均不顯著。

在原球莖的誘導(dǎo)階段，添加生長素如NAA和細(xì)胞分裂素對原球莖的誘導(dǎo)有利[22]，在一定范圍內(nèi)原球莖誘導(dǎo)率隨著6BA濃度的增加而增大，6BA濃度在1.0～10.0 mg/L時(shí)均能誘導(dǎo)出原球莖，但以5.0 mg/L誘導(dǎo)效果最好；6BA濃度大于5.0 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率下降[23-24]，尤其是高濃度6BA會使組織嚴(yán)重褐化。該試驗(yàn)中，NAA濃度對萼片的培養(yǎng)有顯著影響，最適濃度為1.5 mg/L；6BA濃度對花蕾的培養(yǎng)有顯著影響，最適濃度為1.5 mg/L。

伍成厚等[25]用蝴蝶蘭子房切段、花梗切段在2，4D 1.0 mg/L加6BA 0.1 mg/L培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出非胚性愈傷組織，愈傷組織白色，疏松。低濃度的2，4D和NAA對花梗誘導(dǎo)原球莖無明顯效果，高濃度的2，4D能促進(jìn)愈傷組織形成，但抑制愈傷組織形成原球莖[26]。該試驗(yàn)中，2，4D對花梗愈傷組織形成具有顯著影響，最適濃度為2.0 mg/L。

TDZ誘導(dǎo)植物離體再生的效果顯著優(yōu)于6BA[27]。周南镚等[28]指出在只有NAA的培養(yǎng)基中，其誘導(dǎo)率僅為5.8%。在 NAA、TDZ配合的培養(yǎng)基中皆有較高的誘導(dǎo)率。當(dāng)TDZ濃度為0.50 mg/L時(shí)， 誘導(dǎo)率最高。該試驗(yàn)中，TDZ對花梗的培養(yǎng)具有顯著影響，最適濃度為0.6 mg/L。隨著TDZ濃度的增加，誘導(dǎo)效果越明顯，但當(dāng)TDZ濃度超過0.6 mg/L后，培養(yǎng)效果開始下降。

GA較少應(yīng)用在國蘭的離體培養(yǎng)中，該研究表明，GA3對花梗切段轉(zhuǎn)綠的影響顯著，最適濃度為0.5 mg/L。

3.3不同處理對花梗切段褐化的影響Wang等[29]發(fā)現(xiàn)不同植物、同種植物的不同類型在組織培養(yǎng)中發(fā)生褐變的頻率和程度都存在很大差別，而同種植物在不同生長時(shí)期，外植體的褐化程度也有所不同，一般認(rèn)為褐變隨著母株年齡增大和組織木質(zhì)化程度加強(qiáng)而增加，處于幼齡狀態(tài)的外植體比處于成熟狀態(tài)的外植體褐變輕。該試驗(yàn)取2.0、4.0、6.0、8.0 cm長花芽，剝離出花梗進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)較幼嫩花芽（2.0 cm）的花梗培養(yǎng)時(shí)褐化最輕，8.0 cm花芽的花梗褐化最重，與前人的研究結(jié)果一致[5]。

外植體的大小和受傷害程度影響組織培養(yǎng)中外植體的褐化。一般認(rèn)為外植體越小，切面與體積的比率越大，傷害及褐化程度就越大[30-32]。該試驗(yàn)花梗切段培養(yǎng)中， 2.0 mm的花梗切片太薄，切割時(shí)破壞的組織較多，外植體容易褐化死亡，褐化率達(dá)到89.6%。8.0 mm的切段褐化率較小，但外植體過大不利于營養(yǎng)和激素的吸收運(yùn)輸，影響花梗生長和愈傷組織誘導(dǎo)。

該試驗(yàn)中VC對花梗的褐化有較顯著的抑制作用，這與王異星[33]、彭筱娜等[34]、李麗等[35]的研究結(jié)果相似。而與張俊琦等[36]的VC在牡丹組織培養(yǎng)中加劇了組織培養(yǎng)物的褐化程度的研究結(jié)果不一致。這說明VC對不同外植體材料的防褐化效果不同。PVP的浸泡對花梗切段的褐化有顯著的抑制作用，總褐化率比對照低24.75%，與前人的研究結(jié)果相同[37-38]。CA對花梗的一級、二級褐化有顯著的抑制作用，但對外植體的三級褐化反而有加重作用，但總褐化率比對照低22.22%。研究表明CA可以有效地防止外植體的褐化[39-40]。也有研究表明CA抗褐化效果較差[38，41]，反而加劇了褐化。該試驗(yàn)中8QHS對花梗的褐化抑制效果最佳，與湯浩茹等[42]的研究結(jié)果相同。4種處理對花?？偤只实囊种谱饔脼镃A

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