代婷婷 林華萍 段婕 徐向東 石紅梅

摘要：基于堿性介質(zhì)中，磺胺類藥物對Ag配合物與魯米諾（Luminol， Lu）化學發(fā)光體系的發(fā)光強度有抑制作用，建立了毛細管電泳化學發(fā)光分離檢測磺胺甲噁唑（Sulfamethoxazole， SMZ）、磺胺二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine， SDM）、磺胺噻唑（Sulfathiazole， ST）的方法。3種磺胺類藥物經(jīng)毛細管電泳分離后，分別與Ag配合物和魯米諾化學發(fā)光體系作用，以相對遷移時間定性，相對化學發(fā)光強度定量，采用標準曲線法測定樣品中的待測物含量。對影響毛細管電泳的分離與化學發(fā)光檢測的條件均進行了優(yōu)化。在最佳分離檢測條件下，3種磺胺類藥物在2.0～200 μg/mL范圍內(nèi)線性良好（r>0.9977）。對3種磺胺類藥物平行測定7次，相對標準偏差（RSD）為1.3%～1.9%，3種磺胺類物質(zhì)的檢出限分別為0.33， 0.20和0.034 μg/mL，加標回收率為80.2%～102.9%。將本方法應用于豬肉、雞肉、牛奶中的3種磺胺類藥物殘留量檢測，結(jié)果令人滿意。

關鍵詞 ：毛細管電泳； 化學發(fā)光； Ag配合物； 磺胺類藥物

1 引 言

磺胺類藥物（Sulfonamides， SAs）是一類廣譜抑菌藥物，性質(zhì)穩(wěn)定、價格低廉，作為獸藥廣泛用于家畜飼料中，用于預防和治療家畜疾病。這些藥物進入動物體內(nèi)后， 可殘留在肉、蛋、奶等動物性食品中，并會在食用者體內(nèi)蓄積，影響其健康?；前芳讎f唑（Sulfamethoxazole， SMZ）、磺胺二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine， SDM）、磺胺噻唑（Sulfathiazole， ST）是常用的磺胺類藥物，其殘留能引起中毒或過敏性反應，并被懷疑有致癌性[1，2]。因此，建立一種操作簡便、快速、準確的磺胺類藥物殘留檢測方法，對于動物源性食品的安全監(jiān)測具有重要意義。

已報道的磺胺類藥物主要檢測方法為高效液相色譜法，檢測器為紫外、熒光及質(zhì)譜檢測器[3～14]。色譜法需要使用大量有機溶劑， 且儀器價格昂貴、運行成本高。近年來，毛細管電泳（Capillary electrophoresis， CE）做為一種高效的分離技術被廣泛研究。由于其設備簡單，效率高，溶劑和樣品的使用量少，運行成本相對較低，使CE相比其它方法更具吸引力[15，16]?；瘜W發(fā)光（Chemiluminescence， CL）作為CE檢測系統(tǒng)，具有以下特點：靈敏度高；成本低廉，組裝簡便；不需要光源，避免了雜散光對測定的影響。因此，將CL的高靈敏度與CE的高分離效率相結(jié)合，具有一定的優(yōu)勢[17，18]。

在前期工作中，本研究組將Ag配合物與魯米諾組成化學發(fā)光體系，并與流動注射和毛細管電泳相結(jié)合，用于測定血尿樣本和藥物制劑中的皮質(zhì)醇、多巴胺、腎上腺素及去甲腎上腺素等[19～22]。本研究中，將高靈敏的化學發(fā)光體系作為毛細管電泳的檢測系統(tǒng)，用于檢測動物源性食品中獸藥殘留。采用固相萃取凈化濃縮樣品后，利用毛細管電泳進行分離，并采用化學發(fā)光檢測系統(tǒng)進行檢測， 方法簡便、快速， 結(jié)果令人滿意。

2 實驗部分

2.1 試劑與藥品

SMZ，SDM和ST（德國Dr. Ehrenstorfer公司）。魯米諾（日本TCI公司）；甲醇（色譜純，Honeywell Burdick & Jackson公司）。其它試劑均為優(yōu)級純（北京化學試劑廠）。

SMZ，SDM和ST儲備溶液：稱取適量SMZ，SDM和ST標準品，溶于0.01 mol/L NaOH溶液中，以超純水定容。魯米諾儲備液：稱取適量魯米諾標準品，溶于1.0 mol/L NaOH溶液中，以超純水定容。

2.2 毛細管電泳化學發(fā)光檢測裝置

本實驗所用儀器為自行組裝毛細管電泳化學發(fā)光檢測裝置， 如圖2所示。此裝置由高壓電源提供電壓，光電倍增管收集化學發(fā)光信號。分離毛細管（65 cm×50 μm i.d.）、試劑引入毛細管（40 cm ×200 μm i.d.）和反應毛細管（15 cm×530 μm i.d.）由三通接頭連接固定。將分離毛細管的一端（約7 cm）燒去聚酰亞胺涂層，經(jīng)HF刻蝕45 min后，插入反應毛細管中。反應毛細管燒去約1 cm聚酰亞胺涂層，作為檢測窗口，反應毛細管的刻蝕端插入到檢測窗口處，氧化試劑以重力方式引入毛細管，形成同軸環(huán)流，在檢測窗口處與分離毛細管末端流出的還原試劑混合，產(chǎn)生化學發(fā)光，檢測窗口固定于光電倍增管前。化學發(fā)光反應系統(tǒng)與光電倍增管等密封于暗箱中。

實驗開始前，先沖洗活化石英毛細管。依次用0.1 mol/L NaOH、超純水沖洗10 min后，再用運行緩沖液（硼砂和NaOH）平衡約20 min，進行電泳。新的石英毛細管在使用前需要進行簡單處理，依此用1 mol/L NaOH沖洗30 min，0.1 mol/L HCl沖洗10 min，超純水沖洗20 min。

2.3 樣品處理

豬肉和雞肉樣品：依據(jù)國家標準方法[25]處理。 稱取樣品（5±0.05）g，于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加乙酸乙酯20 mL重復提取，合并兩次提取液于雞心瓶中，加入4 mL 0.1 mol/L HCl ，于40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至少于3 mL，轉(zhuǎn)至10 mL離心管中，用2 mL 0.1 mol/L HCl和3 mL正己烷依次沖洗雞心瓶，轉(zhuǎn)至同一離心管中，渦旋混和30 s，3000 r/min離心5 min，棄正己烷相，取下層液備用。

牛奶樣品：根據(jù)國家標準方法[26]，取樣品（5±0.05）mL，置于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入25 mL HClO4溶液（pH 2），于渦旋振蕩器振蕩提取1 min，超聲波萃取10 min，備用。

SCX固相萃取柱：依次用2 mL甲醇和2 mL 0.1 mol/L HCl活化。取備用液過柱，依次用1 mL 0.1 mol/L HCl和2 mL 50%（V/V）甲醇乙腈溶液淋洗，用4 mL 5%（V/V）氨水甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，于40℃氮氣吹干，1 mL 0.1 mol/L NaOH溶液溶解殘余物，0.45 μm濾膜過濾，待測。

Oasis HLB固相萃取柱：使用前在柱上塞上一小塊脫脂棉，再依次用3 mL甲醇和5 mL HClO4（pH 2）活化，取備用液過柱，再用5 mL超純水淋洗，抽干，用3 mL甲醇洗脫。收集洗脫液，于40℃氮氣吹干，1 mL 0.1 mol/L NaOH溶液溶解殘余物，0.45 μm濾膜過濾，待測。

3 結(jié)果與討論

3.1 化學發(fā)光信號的優(yōu)化

SMZ，SDM和ST對AgLuminol化學發(fā)光體系的發(fā)光信號有明顯抑制作用。本研究對檢測體系中 Ag配合物溶液的濃度及pH值、魯米諾的濃度等參數(shù)進行了優(yōu)化。

3.1.2 魯米諾濃度的優(yōu)化

考察了魯米諾濃度（1.0～4.0 mmol/L）對化學發(fā)光信號的影響（圖 5）。結(jié)果表明，隨著魯米諾濃度逐漸增大，化學發(fā)光信號先增強后逐漸減弱。為了兼顧3種磺胺類物質(zhì)都能在最強的化學發(fā)光條件下進行檢測，魯米諾的最優(yōu)濃度選擇為2.0 mmol/L。

在CECL檢測系統(tǒng)，SMZ，SDM和ST由分離毛細管通過重力作用引入，在緩沖溶液的作用下進行分離。緩沖液溶液中硼砂及NaOH通過影響溶液的pH值及離子強度，最終影響電泳的分離效果及化學發(fā)光的信號強度。結(jié)果表明，硼砂濃度可影響遷移率及CL信號。硼砂濃度在2～15 mmol/L范圍內(nèi)，隨著其濃度的增高，SAs的分離效果提高（圖6）。此外，考慮到對分離效果和信號強度的影響，在保證3種磺胺類藥物完全分離的前提下，選擇能得到最強化學發(fā)光信號的濃度作為最優(yōu)濃度，即硼砂濃度為12 mmol/L。為了達到更好的分離效果，對運行緩沖液的pH值進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，當NaOH的濃度范圍為1.0～10 mmol/L（pH 9.2～9.6）時，隨著NaOH濃度增加，分離效果明顯提高（圖7）。當NaOH濃度為8 mmol/L（pH 9.5）時，SMZ，SDM和ST分離效果最好。

3.3 石英毛細管管長、電泳電壓及進樣時間的選擇

從理論上講，石英毛細管管長和分離電壓均可影響SAs的遷移速率和分離效果[27，28]，研究結(jié)果表明，實驗考察了石英毛細管長度范圍為50～75 cm，當石英毛細管為65 cm時，可達到較好的分離效果。石英毛細管長度一定時，隨著分離電壓的增高，遷移時間縮短，在一定的范圍內(nèi)，柱效隨電壓增大而增高，但隨著分離電壓的不斷升高，柱內(nèi)的焦耳熱增加，柱效反而下降，緩沖液的黏度減小。電壓考察范圍為5～20 kV，在保證中3種磺胺類藥物分離效果最好的前提下，最佳電壓為18 kV。

虹吸進樣是常用的毛細管電泳進樣方式。當進樣時間太短時，常會使進樣精密度變差；而進樣時間長時，毛細作用引起的自發(fā)進樣的差異對進樣量的影響降低，但進樣時間不宜太長，否則會增加樣品塞的長度，使柱效和分離度降低。因此，只要檢測器能夠提供足夠大的信號，進樣區(qū)帶宜越小越好[28]。實驗考察了進樣時間的范圍為5～26 s，結(jié)果表明，當進樣時間達到18 s時，可獲得穩(wěn)定的化學發(fā)光強度及較好的峰型。

3.4 分析檢測線性范圍、精密度與檢出限

在優(yōu)化條件下，對3種磺胺類物質(zhì)系列標準溶液進行檢測，線性范圍、回歸方程、精密度以及檢出限等參數(shù)見表1。檢出限的峰高值為3倍的基線噪聲（S/N=3），定量限為10倍的基線噪聲（S/N=10）。

3.5 樣品分析

在優(yōu)化的條件下，即Ag配合物溶液濃度為0.05 mmol/L，Ag配合物溶液中NaOH濃度為0.01 mol/L（pH 12.1），緩沖溶液中魯米諾濃度為2.0 mmol/L，硼砂濃度為12 mmol/L，NaOH濃度為8.0 mmol/L（pH=9.5），對已處理的豬肉、雞肉和牛奶樣品進行了測定（圖8）。豬肉、雞肉和牛奶樣品均購買于當?shù)厥袌黾俺?。分別取豬肉、雞肉、牛奶各9份，共27份樣品，檢測結(jié)果為未檢出，同時采用國家標準方法[25，26]進行了比對，結(jié)果均為未檢出。動物在正常使用量下，磺胺類藥物的休藥期是8～20天，休藥期后組織內(nèi)含量可達到MRL水平及以下，但當過量或長時間使用下動物組織內(nèi)會大量蓄積。本檢測結(jié)果為未檢出，可能原因為未使用磺胺類藥物或已過休藥期。

3.6 回收率實驗

取豬肉、牛奶樣品各9份， 在其中依次加入3種磺胺類標準品，每份樣品按照樣品前處理的方法進行處理，制得低、中、高3種濃度的加標樣品，每份樣品平行測定3次，計算回收率，回收率為80.2%～102.9%之間見表2。在同樣的加標水平下，國家標準方法的回收率為83.0%～99.2%。本方法及國標HPLC法分別加標MRL含量，經(jīng)單點校正法測定，回收率分別為81.5%和83.3%。

3.7 Ag配合物魯米諾化學發(fā)光體系檢測機理推斷

根據(jù)該體系的前期研究推斷[19，21]，可能的化學發(fā)光反應機理為：堿性介質(zhì)中，作為氧化劑的Ag配合物與魯米諾組成化學發(fā)光體系， Ag配合物氧化魯米諾產(chǎn)生化學發(fā)光，即為基線信號。SMZ，SDM和ST均對Ag魯米諾體系化學發(fā)光有抑制作用。Ag配合物和魯米諾及本研究的3種磺胺類物質(zhì)的反應均為自由基反應，且3種磺胺類物質(zhì)與Ag反應較魯米諾與Ag的反應慢得多，反應過程中魯米諾產(chǎn)生的自由基一部分轉(zhuǎn)移給磺胺分子，從而使魯米諾自由基不同程度的減少，發(fā)光體的量減少，使得體系的發(fā)光強度不同程度的降低。

4 結(jié) 論

采用固相萃取法對豬肉、雞肉以及牛奶樣品進行凈化和富集，通過毛細管電泳分離，Ag配合物魯米諾化學發(fā)光新體系的化學發(fā)光檢測器進行檢測，建立了CECL法同時對動物源性食品中3種磺胺類藥物殘留進行分離檢測方法，同時對Ag配合物魯米諾化學發(fā)光新體系的可能檢測機理進行了探討。方法避免了使用大量有機試劑，儀器組裝簡單、成本低廉，檢測靈敏度高，為動物源性食品中磺胺類獸藥殘留的檢測提供了一種快速簡單、靈敏的檢測手段。

References

1 Yu H， Mu H， Hu Y M. J. Pharmaceut. Anal.， 2012， 2（1）： 76-81

2 Natalia A M， Laura G G， Ana M G C. Food Chem.， 2014， 143： 459-464

3 Zhao Y G， Zhou L X， Pan S D， Zhan P P， Chen X H， Jin M C. J. Chromatogr. A， 2014， 1345： 17-28

4 Hou X L， Chen G， Zhu L， Yang T， Zhao J， Wang L， Wu Y L. J. Chromatogr. B， 2014， 962： 20-29

5 Bedendo G C， Fontes J I C S， Carasek E. J. Chromatogr. A， 2010， 1217（42）： 6449-6454

6 Cai Z X， Zhang Y， Pan H F， Tie X W， Ren Y P. J. Chromatogr. A， 2008， 1200： 144-155

7 Xu Y， Ding J， Chen H Y， Zhao Q， Hou J， Yan J， Wang H， Ding L， Ren N Q. Food Chem.， 2013， 140： 83-90

8 Yu H， Mu H， Hu Y M. J. Pharmaceut. Anal.， 2012， 2： 76-81

9 Yan H Y， Sun N， Liu S J， Row K H， Song Y X. Food Chem.， 2014， 158： 239-244

10 Xu W J， Su S F， Jiang P， Wang H S， Dong X C， Zhang M. J. Chromatogr. A， 2010， 1217（42）： 7198-7207

11 Tsaia W H， Huang T C， Chen H H， Wu Y W， Huang J J， Chuang H Y. J. Chromatogr. A， 2010， 1217（3）： 250-255

12 Granja R H， Montes Nino A M， Rabone F， Salerno A G. Anal. Chim. Acta， 2008， 613： 116-119

13 Chen Y S， Schwack W. J. Chromatogr. A， 2014， 1331： 108-116

14 Sajid M， Na N， Safdar M， Lu X， Ma L， He L， Ouyang J. J. Chromatogr. A， 2013， 1314： 173-179

15 Ban E， Song E J. J. Chromatogr. B， 2013， 929： 180-186

16 Petersen J R， Okorodudu A O， Mohammad A， Payne D A. Clin. Chim. Acta， 2003， 330： 1-30

17 JI XingHu， XU QinFeng， HE ZhiKe. Chinese J. Anal. Chem.， 2008， 36（11）： 1579-1586

吉邢虎， 徐秦峰， 何治柯. 分析化學， 2008， 36（11）： 1579-1586

18 Baeyens W R G， Schulman S G， Calokerinos A C， Zhao Y， Garcí C M A， Nakashima K， Keukeleire D D. J. Pharmaceut. Biomed.， 1998， 17： 941-953

19 Shi H M， Xu X D， Ding Y， Liu S， Li L， Kang W J. Anal. Biochem.， 2009， 387（2）： 178-183

20 Bai J B， Shi H M， Zhang Y Z， Tian D H， Xu X D， Kang W J. Chin. J. Chem.， 2009， 27（4）： 745-750

21 Xu X D， Shi H M.， Ma L， Kang W J， Li S. Luminescence， 2011， 26： 93-100

22 Xu X D， Zhang H Y， Shi H M， Ma Ch L， Cong B， Kang W J. Anal. Biochem.， 2012， 427（1）： 10-17

23 Blikungeri A， Pelletier M， Monnier D. Inorg. Chim. Acta， 1977， 22： 7-14

24 Blikungeri A， Pelletier M. Inorg. Chim. Acta， 1978， 29： 141-148

25 GB/T 296942013， Determination of Sulfonamidesresidues in animal derived food by High Performance Liquid Chromatographic method， National Standards of the Peoples Republic of China

動物源性食品中13種磺胺類藥物多殘留的測定 高效液相色譜法. 中華人民共和國國家標準. GB/T 296942013

26 GB/T 229662008， Determination of Sixteen Sulfonamide Residues in Milk and Milk PowderLCMSMS method， National Standards of the Peoples Republic of China

牛奶和奶粉中16種磺胺類藥物殘留量的測定 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法. 中華人民共和國國家標準. GB/T 22966-2008

27 ZHANG HuiWen， HE LiMing. Chinese Journal of Modern Drug Application， 2007， 24（7）： 640-643

張慧文， 何麗明. 中國現(xiàn)代應用藥學雜志， 2007， 24（7）： 640-643

28 Mayer B X. J. Chromatogr. A， 2001， 907： 21-37

29 Maximum Residue Limits of Veterinary Drugs in Animal Food， Ministry of agriculture， 235-2002

動物性食品中獸藥最高殘留限量， 農(nóng)業(yè)部235號公告2002

30 （EU）NO37/2010， On Pharmacologically Active substances and Their Classification Regarding Maximum Residue Limits in Foodstuffs of Animal Origin

31 21CFR556， Allowable Amount of Veterinary Drug Residues in Food， Federal Regulations in the United States 21 volumes， 556 parts

Abstract Based on sulfonamides inhibited the chemiluminescence （CL） intensities of the system consisting of Ag complexes with Luminol （Lu） in basic medium， a method for capillary electrophoresis （CE）CL separation and determination of sulfamethoxazole （SMZ）， sulfadimethoxine （SDM） and sulfathiazole （ST） was established. The three kinds of sulfonamides were separated by capillary electrophoresis， and reacted with Ag complexesLuminol CL system， respectively. In the relative migration time， the relative CL intensity was quantitative and the standard curve method was used to determine the content of the analytes in the sample. The conditions for the separation and chemiluminescence detection system were all optimized. Under the optimized conditions， the linear ranges for the determination of SMZ， SDM and ST were 2.0-200.0 μg/mL （r>0.9977）， with detection limits （S/N=3） of 0.33， 0.20 and 0.034 μg/mL， respectively. Relative standard deviation （RSD） values for the peak height were 1.3% to 1.9% （n=7）. The proposed method was applied to the determinations of sulfonamides residues in pork， chicken， milk samples with satisfactory results.

Keywords Capillary electrophoresis； Chemiluminescence； Silver complex； Sulfonamides