鐘　琦，吳慧昊，代軍飛，牛　鋒*

(1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 實(shí)驗(yàn)中心，甘肅 蘭州 730124)

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響應(yīng)面法優(yōu)化油脂酵母發(fā)酵產(chǎn)油的影響因子

鐘琦1，吳慧昊2，代軍飛1，牛鋒1*

(1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 實(shí)驗(yàn)中心，甘肅 蘭州 730124)

微生物油脂作為一種新型油料資源，研究其發(fā)酵條件具有重要意義.以實(shí)驗(yàn)室保存菌株EAM-AC16為出發(fā)菌，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化菌株EAM-AC16的發(fā)酵條件.確定最優(yōu)發(fā)酵條件為：葡萄糖濃度82.37 g/L，接種量9.45%，培養(yǎng)時(shí)間為146.4 h，pH6.0，培養(yǎng)溫度30 ℃，空氣量(裝液量mL/三角瓶mL)70mL/250mL和(NH4)2SO4濃度1 g/L時(shí)，菌株EAM-AC16的油脂產(chǎn)量達(dá)5.204 g/L.利用氣相色譜分析菌株EAM-AC16合成油脂的主要成分為：棕櫚酸(C16:0)、亞油酸(C18:2)、γ-亞麻酸(C18:3)和反油酸(C18:3)等.

油脂酵母;微生物油脂;發(fā)酵條件;氣相色譜

傳統(tǒng)油脂主要從動(dòng)植物中提取，但因產(chǎn)量不穩(wěn)定、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)且經(jīng)濟(jì)成本高等原因，嚴(yán)重制約著其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn).因此，世界各國(guó)開(kāi)始致力于開(kāi)發(fā)可替代的再生資源.

微生物油脂(microbial oils)，又稱(chēng)為單細(xì)胞油脂 (single cell oil，SCO)，即酵母菌、霉菌、細(xì)菌和藻類(lèi)等油脂微生物在一定培養(yǎng)條件下，利用碳水化合物、碳?xì)浠衔锖桶被岬葼I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分別作為碳源和氮源，輔以無(wú)機(jī)鹽，在菌體內(nèi)產(chǎn)生的大量油脂[1].利用油脂微生物生產(chǎn)油脂的優(yōu)勢(shì)[2～4]：①微生物生長(zhǎng)周期短、適應(yīng)性強(qiáng)、代謝旺盛、培養(yǎng)條件和操作簡(jiǎn)單.②微生物易于遺傳物質(zhì)的改良，能大幅度提高產(chǎn)量的同時(shí)，還能得到符合人類(lèi)需要的功能性脂肪酸.③微生物可利用農(nóng)副產(chǎn)品、食品加工的廢棄物作為培養(yǎng)基原料，有利于廢棄物的再利用和環(huán)境保護(hù).④微生物油脂生物安全性好，不易被氧化，毒副作用小.⑤微生物生產(chǎn)油脂不受場(chǎng)地和季節(jié)限制，能夠連續(xù)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn).⑥微生物比高等植物更能有效地積累油脂.⑦利用微生物生產(chǎn)油脂所需的勞動(dòng)力比動(dòng)植物生產(chǎn)油脂少.

微生物油脂不僅能作為功能性脂肪酸添加到食品中，具有抗高血壓、抗粥樣動(dòng)脈硬化、預(yù)防心血管和腫瘤的發(fā)生，同時(shí)還具有健腦明目和延緩衰老等功能[5～8]，且其主要成分與植物油脂相似，還能作為生物柴油和生物汽油的理想原料[9].因此，微生物油脂作為綠色環(huán)保的新型可再生資源，具有良好的應(yīng)用前景.

本研究以實(shí)驗(yàn)室保存的油脂酵母菌株為出發(fā)菌，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件，進(jìn)一步提高油脂產(chǎn)量，為該菌株的綜合利用提供參考.

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

EAM-AC16為粘性絲孢酵母，實(shí)驗(yàn)室保存菌種.

1.1.2培養(yǎng)基

麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基(g/L)：葡萄糖1，酵母浸粉2.5，醋酸鈉8，氯化鉀1.8，pH自然.

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，酵母浸粉10，蛋白胨10，pH自然.

發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖80，酵母浸粉5，蛋白胨2，磷酸二氫鉀5，硫酸鎂1，pH自然.

1.1.3試劑

葡萄糖、酵母浸粉和蛋白胨為生物試劑；正己烷、氫氧化鉀和甲醇為色譜純；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.2方法

1.2.1菌種的活化

將實(shí)驗(yàn)室保存的油脂酵母菌株EAM-AC16接種到麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基，35 ℃培養(yǎng)36 h，活化待用.

1.2.2菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)

將活化后的菌株以5%的接種量接種至種子培養(yǎng)基，35 ℃，120 r/min培養(yǎng)36 h.

1.2.3影響油脂酵母發(fā)酵產(chǎn)油的單因素試驗(yàn)

分別考察培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、初始pH、接種量、空氣量、葡萄糖濃度和硫酸銨濃度對(duì)油脂酵母的生物量和油脂產(chǎn)量的影響.

1.2.4響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)條件

從單因素中選取對(duì)生物量和油脂產(chǎn)量影響較大的因素，進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn).

1.3分析方法

1.3.1生物量的測(cè)定

采用干重法測(cè)定生物量[10].

1.3.2油脂提取及脂肪酸成分分析

采用索氏抽提法提取菌體內(nèi)的油脂[11].參照文獻(xiàn)方法[12]，油脂進(jìn)行堿法甲酯化后進(jìn)氣相色譜分析.

1.3.3數(shù)據(jù)處理與分析

每組試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，用EXCEL、SPSS和Design-Expect軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.

2　結(jié)果與分析

2.1生長(zhǎng)曲線(xiàn)

酵母菌的生長(zhǎng)一般會(huì)經(jīng)過(guò)4個(gè)時(shí)期，即遲緩期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和衰亡期.由圖1所示，0～8 h時(shí)，菌株EAM-AC16剛接種到發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基，需要適應(yīng)新培養(yǎng)基，如果菌體數(shù)量維持恒定，說(shuō)明細(xì)胞正處于遲緩期.8～60 h時(shí)，菌體濃度急劇增加，說(shuō)明菌株EAM-AC16處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期.到60 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)減慢，逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期，此時(shí)油脂開(kāi)始大量積累.在180 h時(shí)進(jìn)入衰亡期，菌體逐漸衰亡.選擇合適的接種時(shí)間，可以保證種子液的濃度和活性，因此確定菌株EAM-AC16在種子培養(yǎng)基中的發(fā)酵周期為36 h.

圖1　菌株EAM-AC16的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

2.2發(fā)酵條件優(yōu)化——單因素試驗(yàn)

2.2.1培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株EAM-AC16產(chǎn)油的影響

圖2培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株EAM-AC16發(fā)酵結(jié)果的影響

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株EAM-AC16生物量和油脂產(chǎn)量的影響較大(圖2).培養(yǎng)時(shí)間從96 h增加到144 h.隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，其生物量和油脂產(chǎn)量顯著增加(P<0.05).在培養(yǎng)時(shí)間為144 h時(shí)，生物量和油脂產(chǎn)量均達(dá)到最大值；培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)144 h時(shí)，生物量和油脂產(chǎn)量隨培養(yǎng)時(shí)間增加而顯著下降.因此，菌株EAM-AC16的最佳培養(yǎng)時(shí)間為144 h.

2.2.2培養(yǎng)溫度對(duì)菌株EAM-AC16產(chǎn)油的影響

圖3培養(yǎng)溫度對(duì)菌株EAM-AC16發(fā)酵結(jié)果的影響

溫度通過(guò)酶的活性影響微生物的生長(zhǎng)和油脂積累[13～14].不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌株EAM-AC16生物量和油脂產(chǎn)量的影響較大(圖3).隨著溫度增加，生物量和油脂產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì).在30 ℃，EAM-AC16生物量和油脂產(chǎn)量顯著高于其他處理水平(P<0.05).因此，選擇30 ℃作為菌株EAM-AC16生長(zhǎng)和油脂積累的最適溫度.

2.2.3初始pH對(duì)菌株EAM-AC16產(chǎn)油的影響

圖4pH對(duì)菌株EAM-AC16發(fā)酵結(jié)果的影響

初始pH通過(guò)改變酶的活性、細(xì)胞質(zhì)膜通透性、膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和物質(zhì)溶解性等方面來(lái)影響微生物的生長(zhǎng)和油脂積累[15].初始pH對(duì)生物量和油脂產(chǎn)量的影響較大(圖4).pH從5.22增加到6.0時(shí)，生物量和油脂產(chǎn)量沒(méi)有顯著變化.在pH大于6.0時(shí)，生物量和油脂產(chǎn)量均顯著下降(P<0.05).說(shuō)明菌株EAM-AC16適合在pH6.0的弱酸性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)和合成油脂.

2.2.4接種量對(duì)菌株EAM-AC16產(chǎn)油的影響

圖5接種量對(duì)菌株EAM-AC16發(fā)酵結(jié)果的影響

接種量過(guò)少，遲緩期較長(zhǎng)；接種量過(guò)高，種內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)增加，因此，合適的接種量有利于油脂合成[16].隨著接種量的增加，菌株EAM-AC16的生物量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而油脂產(chǎn)量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)(圖5).當(dāng)接種量為10%時(shí)，其生物量相對(duì)低于接種量為20%的生物量，但油脂產(chǎn)量遠(yuǎn)高于接種量為20%的油脂產(chǎn)量.綜合考慮，確定菌株EAM-AC16的最佳接種量為10%.

2.2.5空氣量(裝液量mL/三角瓶mL)對(duì)菌株EAM-AC16產(chǎn)油的影響

圖6空氣量對(duì)菌株EAM-AC16發(fā)酵結(jié)果的影響

酵母菌利用糖類(lèi)生長(zhǎng)和合成油脂的過(guò)程是好氧發(fā)酵[17]，且酵母菌厭氧發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有一定毒害作用[18]，因此選擇合適的空氣量對(duì)油脂酵母的生長(zhǎng)和油脂合成具有重要的作用.空氣量對(duì)菌株EAM-AC16生物量的影響較大，而對(duì)油脂產(chǎn)量的影響不明顯(圖6).當(dāng)空氣量為70mL/250mL時(shí)，其生物量和油脂產(chǎn)量與空氣量為70mL/300mL相比，差異不顯著(P>0.05)，但隨著空氣量的減少，其生物量和油脂產(chǎn)量均呈下降趨勢(shì).綜合考慮，選擇空氣量70mL/250mL作為EAM-AC16生長(zhǎng)和發(fā)酵的最佳空氣量.

2.2.6葡萄糖濃度對(duì)菌株EAM-AC16產(chǎn)油的影響

圖7葡萄糖濃度對(duì)EAM-AC16發(fā)酵結(jié)果的影響

碳源不僅為微生物生長(zhǎng)提供碳源，維持滲透壓，而且還可以為合成油脂提供碳骨架[19].葡萄糖濃度對(duì)生物量和油脂產(chǎn)量的影響較顯著(圖7).隨著葡萄糖濃度的增加，生物量和油脂產(chǎn)量逐漸增加，葡萄糖濃度80 g/L時(shí)，生物量和油脂產(chǎn)量顯著大于其他水平(P<0.05)；葡萄糖濃度超過(guò)80 g/L時(shí)，其生物量和油脂產(chǎn)量都顯著下降.因此，菌株EAM-AC16生長(zhǎng)和油脂積累的最適葡萄糖濃度為80 g/L.

2.2.7 (NH4)2SO4對(duì)菌株EAM-AC16產(chǎn)油的影響

圖8(NH4)2SO4濃度對(duì)菌株NU-Y004-2發(fā)酵結(jié)果的影響

無(wú)機(jī)氮源能促進(jìn)菌體增殖[20]，且合適的C/N比更有利于油脂酵母的生長(zhǎng)和油脂積累[21].(NH4)2SO4濃度對(duì)菌株EAM-AC16生物量和油脂產(chǎn)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)(圖8).當(dāng)(NH4)2SO4濃度為1 g/L時(shí)，生物量和油脂產(chǎn)量均顯著高于其他處理水平(P<0.05).因此，在培養(yǎng)基中添加1 g/L的(NH4)2SO4為菌株生長(zhǎng)和油脂積累的最適無(wú)機(jī)氮源.

2.3發(fā)酵條件優(yōu)化——響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表1試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平

表2　響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)中，碳源、接種量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)生物量和油脂產(chǎn)量的影響較顯著，因此，采用Design-Expert8.0軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)，考察葡萄糖濃度、接種量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株EAM-AC16發(fā)酵產(chǎn)油的影響.以這3個(gè)因素作為變量，每個(gè)變量按低、中、高3個(gè)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼，試驗(yàn)因素及水平表見(jiàn)表1.以A、B、C為自變量，油脂產(chǎn)量(g/L)作為響應(yīng)值，分析方案及結(jié)果見(jiàn)表2.

利用Design-Expert 8.0軟件，對(duì)表2的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，獲得油脂產(chǎn)量R對(duì)自變量葡萄糖濃度(A)、接種量(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)多元二次擬合回歸方程，其方程為：Y=5.20+0.14A-0.11B+0.017C+0.074AB-0.053AC-0.021BC-0.56A2-0.45B2-0.39C2.方程中的系數(shù)具有正值和負(fù)值，說(shuō)明存在極大點(diǎn)，且響應(yīng)面最高點(diǎn)對(duì)應(yīng)等高線(xiàn)的最小橢圓的中心點(diǎn)為極值點(diǎn).

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析的結(jié)果見(jiàn)表3，其中A、B、C、A2、B2和C2呈極顯著影響(P<0.01)，AB呈顯著影響(P<0.05)，AC和BC為不顯著影響.失擬項(xiàng)α=0.05水平上不顯著，殘差由隨機(jī)誤差引起.模型的F檢驗(yàn)為極顯著(P<0.01).說(shuō)明該擬合方程與實(shí)際情況相符合，模型顯著，具有實(shí)際意義.該模型的決定系數(shù)R2為0.992 2，變異系數(shù)為1.36%，由此可以確定該模型的精確性和可信性.因此，該模型可以用于分析和預(yù)測(cè)UN-Y004-2的發(fā)酵條件.

表3方差分析

2.3.2三維圖和等高線(xiàn)圖

根據(jù)回歸方程，用Design-Expert8.0軟件做出擬合三維圖，考察三維圖的形狀.三維圖和等高線(xiàn)的顏色和形狀變化能夠反映兩個(gè)因素之間的交互作用，即等高線(xiàn)的形狀如果為橢圓形表示交互作用顯著，圓形則表示交互作用不顯著.顏色對(duì)比越強(qiáng)烈，交互作用越顯著[22].由圖9、10和11可知，葡萄糖濃度和接種量、葡萄糖濃度和培養(yǎng)時(shí)間以及接種量和培養(yǎng)時(shí)間之間的交互作用顯著.

圖9　(A) 葡萄糖濃度和接種量的三維圖　　　　　　圖9　(B) 葡萄糖濃度和接種量的等高線(xiàn)圖

圖10　(A) 葡萄糖濃度和培養(yǎng)時(shí)間的三維圖　　　　圖10　(B) 葡萄糖濃度和培養(yǎng)時(shí)間的等高線(xiàn)圖

圖11　(A) 接種量和培養(yǎng)時(shí)間的三維圖　　　　　　　圖11　(B)接種量和培養(yǎng)時(shí)間的等高線(xiàn)圖

2.3.3試驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證

利用響應(yīng)面法得出最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)為：在葡萄糖濃度82.37 g/L，接種量9.45%，培養(yǎng)時(shí)間為146.4 h，pH6.0，培養(yǎng)溫度為30 ℃，空氣量為70mL/250mL和(NH4)2SO4濃度為1 g/L時(shí)，預(yù)測(cè)油脂產(chǎn)量為5.219 39 g/L.

采用上述最佳發(fā)酵工藝參數(shù)驗(yàn)證響應(yīng)面分析的可靠性，經(jīng)過(guò)3次平行試驗(yàn)，得到實(shí)際油脂產(chǎn)量為5.204 g/L.說(shuō)明響應(yīng)面法提供的模型較真實(shí)地?cái)M合了實(shí)際情況，可以用于菌株EAM-AC16發(fā)酵條件的預(yù)測(cè).

2.4氣相色譜分析

利用索氏抽提法提取菌株EAM-AC16的油脂，氣相色譜結(jié)果如圖12所示.結(jié)果顯示菌株EAM-AC16油脂的主要成分為棕櫚酸(C16:0)、亞油酸(C18:2)、γ-亞麻酸(C18:3)和反油酸(C18:3).

注：1-棕櫚酸甲酯；2-亞油酸甲酯；3-γ-亞麻酸甲酯；4-反油酸甲酯.

圖12以葡萄糖為碳源的微生物油脂的脂肪酸甲酯氣相色譜

3　結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)，確定較優(yōu)的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)時(shí)間144 h、培養(yǎng)溫度30 ℃、初始pH6.0、接種量為10%、空氣量(裝液量mL/三角瓶mL)為70mL/250mL、葡萄糖濃度80 g/L和(NH4)2SO4濃度1 g/L.選取影響較大的影響因子，即葡萄糖濃度、接種量和發(fā)酵時(shí)間為自變量，利用響應(yīng)面法確定最優(yōu)發(fā)酵條件為：葡萄糖濃度82.37 g/L，接種量9.45%，培養(yǎng)時(shí)間146.4 h，培養(yǎng)溫度為30 ℃，初始pH6.0，空氣量70mL/250mL 和(NH4)2SO4濃度1 g/L時(shí)，菌株EAM-AC16的油脂產(chǎn)量達(dá)5.204 g/L.氣相色譜結(jié)果顯示菌株EAM-AC16脂肪酸的主要成分為：棕櫚酸(C16:0)、亞油酸(C18:2)、γ-亞麻酸(C18:3)和反油酸(C18:3)等.

在后續(xù)的研究中，可以建立簡(jiǎn)單高效的微生物油脂提取技術(shù)和高效的下游分離技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn).同時(shí)，在發(fā)酵工藝學(xué)方面，可以嘗試補(bǔ)料分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵等工藝方法，進(jìn)一步提高油脂產(chǎn)量、縮短發(fā)酵時(shí)間和節(jié)約成本.

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2016-05-10

西北民族大學(xué)研究生科研(實(shí)踐)創(chuàng)新項(xiàng)目(Ymx2014180).

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鐘琦(1990—)，女(白族)，湖南桑植縣人，碩士研究生，主要從事油脂微生物方面的研究.

TQ641

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1009-2102(2016)02-0057-08