胡紅珍　王麗娟　李麗萍　羅麗婭

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·臨床研究論著·

復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病的菌種及藥物敏感度研究

胡紅珍王麗娟李麗萍羅麗婭

目的分析復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病(RVVC)患者陰道分泌物假絲酵母菌菌種和菌株基因型以及其對臨床抗真菌藥物的敏感度，為臨床診治提供依據(jù)。方法選擇50例RVVC患者(RVVC組)及50例外陰陰道假絲酵母菌病(VVC)患者(VVC組)，采集患者的陰道分泌物標本進行菌種鑒定，使用微衛(wèi)星CAI位點單鏈構(gòu)象多態(tài)性(CAI-SSCP)及基因掃描相結(jié)合的方法對菌種進行基因型鑒定，用紙片法對菌種進行藥物敏感度試驗。結(jié)果2組患者陰道分泌物共培養(yǎng)出155株假絲酵母菌，其中白假絲酵母菌占83.2%，非白假絲酵母菌占16.8%；RVVC組中白假絲酵母菌占78.4%；VVC 組中白假絲酵母菌占92.5%，RVVC組白假絲酵母菌比例低于VVC組(P<0.05)。2組患者陰道分泌物培養(yǎng)的白假絲酵母菌CAI區(qū)序列分析中共獲得32種CAI基因型，其中CAI 30-45和CAI 32-46為最常見的基因型，2組患者白假絲酵母菌優(yōu)勢基因型菌株比例差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。RVVC對抗真菌藥物的敏感度依次為伊曲康唑(96.2%)、制霉菌素(91.2%)、酮康唑(82.5%)、氟康唑(76.5%)、克霉唑(59.8%)、咪康唑(53.9%)。結(jié)論RVVC患者陰道分泌物中假絲酵母菌的菌種分布與VVC患者不一致。RVVC患者陰道來源的白假絲酵母菌基因型呈現(xiàn)優(yōu)勢基因型分布。假絲酵母菌對臨床常用抗真菌藥物存在一定的耐藥性，治療RVVC應(yīng)該根據(jù)藥物敏感度試驗結(jié)果實施個體化治療方案。

假絲酵母菌；菌種鑒定；基因型；單鏈構(gòu)型多態(tài)性；耐藥性

Drug resistance

根據(jù)流行病學研究數(shù)據(jù)，全球約75%的已婚婦女一生中至少患有1次外陰陰道假絲酵母菌病(VVC)，其中約半數(shù)患者發(fā)作2次或以上，而這些患者中約5%發(fā)展成復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病(RVVC)[1]。RVVC指VVC經(jīng)過治療后雖然臨床癥狀和體征消失，且真菌學檢查為陰性，但隨后癥狀復(fù)發(fā)及真菌學檢查又呈陽性，1年中反復(fù)4次或以上者，該病由于具有反復(fù)發(fā)作又頑固不愈的特點，成為臨床治療的障礙，是一種嚴重干擾女性身心健康的常見婦科病[2]。本研究采用微衛(wèi)星CAI位點單鏈構(gòu)象多態(tài)性(CAI-SSCP)與基因掃描相結(jié)合分別對RVVC和VVC患者陰道來源的酵母菌株進行基因型鑒定，研究菌株基因型和RVVC發(fā)病之間的相互關(guān)系，并且分析RVVC患者菌株的藥敏特點，旨在為臨床診治和合理用藥提供直接依據(jù)。

對象與方法

一、研究對象

連續(xù)納入2013年6月至2014年12月在深圳福田區(qū)婦幼保健院門診就診的50例RVVC患者(RVVC組)以及50例VVC患者，患者年齡(32.5±6.5)歲。RVVC指1年中癥狀發(fā)作次數(shù)超過4次，就診時陰道分泌物涂片假絲酵母菌陽性；VVC 組為具有典型的臨床癥狀，且為初發(fā)者，近期內(nèi)未進行任何藥物治療，直接鏡檢見假菌絲和芽生孢子，培養(yǎng)分離出假絲酵母菌[3]。所有納入研究的患者在就診前1個月內(nèi)均未使用過激素、免疫抑制劑、抗生素，排除伴有導(dǎo)致自身免疫力下降的疾病及糖尿病患者、孕婦、性工作者、吸毒者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均對研究知情，并同意留取標本。

二、主要試劑及儀器

主要試劑：ROSCO Neo-Sensitab抗真菌藥敏紙片(深圳優(yōu)康生物技術(shù)有限公司)，蛋白胨、葡萄糖、丙稀酷胺和巰基乙醇(北京鼎國生物技術(shù)有限公司)，甘油、過硫酸銨、乙醇、冰醋酸、甲醛、醋酸鉀、氯仿、醋酸鈉、異戊醇和異丙醇(北京現(xiàn)代東方精細化學品有限公司)，DNA聚合酶MgCl2緩沖液(上海申能博彩生物技術(shù)有限公司)。主要儀器：電子天平(浙江溫州醫(yī)療器械三廠)，生物安全柜(ESCO公司,美國)，智能生化培養(yǎng)箱(浙江寧波海曙賽福實驗儀器廠)，振蕩培養(yǎng)箱(SHAKER公司，德國)，離心機(TIACHI公司，日本)，水浴鍋(上海森信實驗儀器有限公司)，酸堿度調(diào)節(jié)儀(HANNA公司，意大利)，PCR儀(Eppendorf公司，德國)，DCodeTM突變檢測電泳儀、瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)，培養(yǎng)皿、試管(北京中創(chuàng)先鋒科技有限公司)。

三、研究方法

1. 菌落培養(yǎng)

采集并分離上述2組患者在患病急性期陰道分泌物中的假絲酵母菌。采集方法見文獻[2]：用消毒棉簽取患者的陰道側(cè)壁分泌物，將分泌物涂片，置于高倍鏡下鏡檢，可觀察到菌絲或孢子。將新鮮標本直接接種于添加了氯霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂(YPD)富集液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至液體培養(yǎng)基呈渾濁狀態(tài)，后將渾濁的菌液均勻涂布于平板培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h后取出觀察，肉眼可見乳酪樣菌落生長，挑取單菌落劃線接種于平板培養(yǎng)基，經(jīng)過3次反復(fù)分離和純化后，最終挑選單個菌落接種于液體培養(yǎng)基進行活化后備用。

2. 菌種鑒定

根據(jù)文獻[4]報告的方法提取假絲酵母菌的總DNA， PCR擴增內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔1(ITS l)區(qū)。根據(jù)ITS1區(qū)SSCP電泳圖譜，將具有代表性的假絲酵母菌株進行D1/D2序列分析，PCR產(chǎn)物由深圳華大基因技術(shù)有限公司完成測序，根據(jù)Blast對比測序的序列并與EMBL/DDBJ/GenBank基因數(shù)據(jù)庫中已有的各假絲酵母菌原始序列之間的差異，確定菌株種屬。

3. 白假絲酵母菌基因型分析

先用DCodeTM突變檢測電泳儀進行SSCP電泳檢測，然后根據(jù)電泳圖的結(jié)果進行歸類，并選出具有代表性泳道所對應(yīng)的菌株，用6-梭基突光素標記上游引物C1，并加入下游引物C2，以菌株的DNA為擴增模板，PCR法擴增得到相應(yīng)的序列，行瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見到明亮條帶。擴增產(chǎn)物于ABI370DNA測序儀上樣電泳，用Genescan3.7軟件自動分析擴增片段的大小以及其中重復(fù)片段的數(shù)目。以標準菌株CC90028的CAI中2個等位基因位點重復(fù)片段數(shù)(27-38)為標準，確定待測菌株的CAI基因型(具體操作由深圳華大基因技術(shù)有限公司完成)[5]。

4. 藥物敏感度試驗

應(yīng)用ROSCO Neo-Sensitab抗真菌藥敏紙片，對酮康唑、制霉菌素、氟康唑、伊曲康唑、咪康唑和克霉唑等6種藥物進行抑菌試驗，按廠家說明書步驟操作，根據(jù)抑菌圈直徑判為敏感、中度敏感和耐藥[6]。以ATCC90028白假絲酵母菌為質(zhì)控菌株。

四、統(tǒng)計學處理

使用SPSS 16.0軟件處理和分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)　　果

一、菌種的分類鑒定

RVVC組和VVC組患者的陰道分泌物均養(yǎng)出假絲酵母菌。標本經(jīng)過分離、純化、培養(yǎng)后，共獲得155株較固定的單一菌落。對從樣本中獲得的菌株進行ITS l區(qū)PCR擴增，并對擴增的ITS1區(qū)序列進行SSCP電泳圖分析后，基本確定的菌株種類可分為5種類型，從各類型菌株中再選取2～4株代表菌株進行ITS全段序列的PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)測序分析，結(jié)果共獲得5種菌株，包括白假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌和季也蒙畢赤假絲酵母菌。155株假絲酵母菌中，白假絲酵母菌129株(83.2%)，非白假絲酵母菌26株(16.8%)。RVVC組102株中，白假絲酵母菌80株(78.4%)，光滑假絲酵母菌20

株(19.6%)，近平滑假絲酵母菌1株(1.0%)和季也蒙畢赤假絲酵母菌1株(1.0%)，見圖1。VVC組53株中，白假絲酵母菌49株(92.5%)，光滑假絲酵母菌3株(5.7%)，熱帶假絲酵母菌1株(1.9%)。RVVC組和患者陰道分泌物中白假絲酵母菌比例差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.912，P=0.027)。

圖1　RVVC及VVC患者陰道分泌物培養(yǎng)

泳道1：熱帶假絲酵母菌；泳道2：近平滑假絲酵母菌；泳道3、4：白假絲酵母菌；泳道5、6：光滑假絲酵母菌；泳道7：季也蒙畢赤假絲酵母菌

二、白假絲酵母菌的基因型鑒定

白假絲酵母菌CAI區(qū)SSCP結(jié)果見圖2A，CAI區(qū)基因掃描結(jié)果見圖2B。147株白假絲酵母菌CAI區(qū)分析共獲得32種基因型，最常見2種基因型分別為CAI 30-45(50株，占34.0%)和CAI 32-46 (30株，占20.4%)，這2種基因型在CAI片段上僅相差2個三堿基的重復(fù)片段，即基因型為30～32和43～47，為優(yōu)勢基因型。VVC組優(yōu)勢基因型所占比例為71.7% (38/53株)，而RVVC組優(yōu)勢基因型菌株所占比例為73.5%(75/102)，2組患者中白假絲酵母菌優(yōu)勢基因型菌株比例差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.059，P=0.808)。

圖2　RVVC患者白假絲酵母菌的基因型鑒定結(jié)果

A：隨機選取的33株RVVC白假絲酵母菌CAI區(qū)SSCP結(jié)果；B：RVVC白假絲酵母菌CAI區(qū)基因掃描結(jié)果(右邊的序號27-38、30-45、32-46代表基因型)

三、RVVC的抗真菌藥物藥敏試驗結(jié)果

RVVC組102株假絲酵母菌對6種抗真菌藥物的敏感度試驗中，敏感度由高至低依次為伊曲康唑(96.2%)、制霉菌素(91.2%)、酮康唑(82.5%)、氟康唑(76.5%)、克霉唑(59.8%)、咪康唑(53.9%)，見圖3。

圖3　RVVC患者白假絲酵母菌的抗真菌藥物敏感度試驗結(jié)果

討　　論

RVVC的發(fā)病機制與多種因素有關(guān)，但其病因可歸因于兩方面因素，即宿主和致病菌。對于引起RVVC反復(fù)發(fā)作的致病菌源尚有爭議，主要是假絲酵母菌不僅在生殖系統(tǒng)，而且在人體其他多器官廣泛分布，故造成其感染源的復(fù)雜性[7]。因此，致病假絲酵母菌菌株的基因鑒定對明確傳染源、協(xié)助診治具有非?，F(xiàn)實的臨床意義。國外研究顯示，陰道假絲酵母菌病主要由白假絲酵母菌引起(占70%～90%)，光滑假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌只占較少比例，國內(nèi)報道白假絲酵母菌比例約為60%～80%。本研究顯示，白假絲酵母菌是RVVC及VVC的主要致病菌，RVVC中白假絲酵母菌所占比例低于VVC，所分離的非白假絲酵母菌以光滑假絲酵母菌居多，這也與既往報道一致[8]。國外學者報道，復(fù)發(fā)感染的假絲酵母菌菌株的基因型基本保持穩(wěn)定，僅不到60%菌株發(fā)生少量遺傳變異，且已建立克隆的菌株亞種在反復(fù)感染中發(fā)生的重組并非呈漸進式變化[2]。

近年來，分子生物學技術(shù)的突飛猛進，白假絲酵母菌基因的鑒定分型方法不斷取得質(zhì)的進展[9]。白假絲酵母菌4號染色體的非編碼區(qū)的微衛(wèi)星序列CAI有高度多態(tài)性，進行基因掃描后可以獲得單位點分析所能達到的最大分辨率，且CAI區(qū)有很高的特異性和重復(fù)性。文獻報道，SSCP為基因突變分析中靈敏度較高的方法。本研究對VVC及RVVC患者陰道分泌物培養(yǎng)的白假絲酵母菌采用CAI-SSCP和基因掃描相結(jié)合進行基因型鑒定，結(jié)果顯示白假絲酵母菌基因型中存在優(yōu)勢基因，分別為基因型CAI 30-45(32.3%)和CAI 32-46(19.4%)，這與國外近期研究結(jié)果大致相同[10]。本研究RVVC組102株白假絲酵母菌中，優(yōu)勢基因型占73.5%，由此推測優(yōu)勢基因型菌株在RVVC中具有更強的致病力。

目前臨床對RVVC的治療主要依靠經(jīng)驗給藥，造成不同菌源感染均使用同樣的藥量和療程，既影響治療效果也易誘導(dǎo)致病菌基因突變，增加其對常用抗真菌藥物的耐藥性。近年有報道RVVC發(fā)病率持續(xù)上升，其病原學表現(xiàn)為致病菌譜發(fā)生變化并出現(xiàn)了對常用抗真菌藥物的耐藥現(xiàn)象，從而導(dǎo)致臨床治療的困難和復(fù)雜。本研究顯示，RVVC組102株假絲酵母菌對伊曲康唑和制霉菌素的敏感度最高，其次為酮康唑和氟康唑，而克霉唑和咪康唑敏感度較低，但在6種抗真菌藥物的敏感度試驗中均出現(xiàn)耐藥株。因此，在RVVC臨床診治中應(yīng)強調(diào)真菌培養(yǎng)和藥物敏感度試驗的重要性，建議臨床治療RVVC必須規(guī)范化使用抗真菌藥物，根據(jù)藥物敏感度試驗結(jié)果選用敏感的抗真菌藥物進行強化治療，并且要求治療須足量、足療程，必要時采用聯(lián)合用藥。

綜上所述，本研究從基因水平研究RVVC的致病菌類型和鑒定其基因型，了解引起RVVC反復(fù)發(fā)作的病源學原因；臨床診治RVVC時應(yīng)首先進行真菌培養(yǎng)，根據(jù)藥物敏感度試驗進行個體化規(guī)范治療，避免耐藥菌的產(chǎn)生，以提高RVVC的治愈率。

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(本文編輯:林燕薇)

Strain identification and drug susceptibility of vaginal isolates from patients with recurrent vulvovaginal candidasis

HuHongzhen,WangLijuan,LiLiping,LuoLiya.

DepartmentofObstetricsandGynecology,MaternalandChildrenCareHospitalofFutianDistrict,Shenzhen518019,China

Correspondingauthor,HuHongzhen,E-mail:huhongzhen929@163.com

ObjectiveTo investigate the strain identification, genotyping and drug susceptibility ofCandidafrom the vaginal isolates from patients with recurrent vulvovaginal candidiasis(RVVC), aiming to provide evidence for diagnosis and treatment of RVVC. MethodsVaginal isolates were obtained from 50 RVVC patients and 50 with vulva vagina candidiasis(VVC)for strain identification. Strain genotyping was carried out using combined methods of CAI-single strand conformation polymorphism(CAI-SSCP)and Genescan analysis. Drug susceptibility test was performed by disk diffusion method. ResultsIn total, 155Candidastrains were obtained from the vaginal isolates in two groups, consisting ofCandidaalbicans(83.2%)and non-Candidaalbicans(16.8%). In the RVVC group, the proportion ofCandidaalbicanswas 78.4%, significantly lower compared with 92.5% in the VVC group (P<0.05). Thirty two CAI genotypes of theCandidaalbicanswere identified from the vaginal isolated between two groups, CAI 30-45 and CAI 32-46 as the dominant genotypes. The proportion ofCandidaalbicansstrains with dominant genotypes did not significantly differ between two groups (P>0.05). The antifungal drug susceptibility of RVVA for Itraconazole was 96.2%, 91.2% for Nystatin, 82.5% for Ketoconazole, 76.5% for Fluconazol, 59.8% for Clotrimazole and 53.9% for Miconazol, respectively. ConclusionsThe distribution of vaginalCandidaspecies in RVVC patients is differed from VVC patients. In the vaginal isolates from RVVC patients, dominant genotype is distributed in theCandidaalbicansstrain.Candidaalbicansyields certain drug resistance to antifungal agents commonly used in clinical practice. Individualized therapy should be implemented based upon the outcomes of drug susceptibility testing.

Candida; Strain identification; Genotype; Single strand conformation polymorphism;

10.3969/j.issn.0253-9802.2016.09.007

深圳市福田區(qū)衛(wèi)生公益性科研項目(FTWS201340)

518019 深圳，深圳福田區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科(胡紅珍，李麗萍，羅麗婭)；510120 廣州，中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院婦科(王麗娟)

，胡紅珍，E-mail: huhongzhen929@163.com

2016-07-06)