何豐　葉進(jìn)

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·臨床研究論著·

皮質(zhì)醇和11βHSD mRNA在OSAHS中表達(dá)的研究

何豐葉進(jìn)

目的探討OSAHS患者外周血皮質(zhì)醇和單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中11β類固醇羥化脫氫酶(11βHSD)mRNA的表達(dá)及其意義。方法采用ELISA法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測30例中重度男性O(shè)SAHS患者和27名正常男性外周血中皮質(zhì)醇濃度和PBMC中11βHSD mRNA的表達(dá)，分析它們與OSAHS患者臨床參數(shù)間的關(guān)系。結(jié)果OSAHS組和對照組外周血皮質(zhì)醇濃度無顯著差異(t=-0.69，P=0.50)。OSAHS組的PBMC中11βHSD1 mRNA相對表達(dá)水平較對照組低(t=2.35，P=0.02)；11βHSD2 mRNA在2組人群中均無表達(dá)。在OSAHS組中并未發(fā)現(xiàn)11βHSD1 mRNA的表達(dá)與外周血皮質(zhì)醇、TNF-α和其他臨床參數(shù)之間存在相關(guān)性。結(jié)論中重度男性O(shè)SAHS患者PBMC中11βHSD1 mRNA的表達(dá)水平較對照組低，這種改變的機(jī)制目前尚不清楚；但外周血皮質(zhì)醇濃度較正常人并無明顯改變。

睡眠呼吸暫停，阻塞性；單個(gè)核細(xì)胞；11β類固醇羥化脫氫酶

11β-hydroxysteroid dehydrogenase

OSAHS是一種最常見的睡眠呼吸障礙疾病，它可能引起體內(nèi)的炎癥狀態(tài)改變[1]。糖皮質(zhì)激素(GC)具有抗炎及調(diào)節(jié)免疫的作用[2]。OSAHS患者體內(nèi)是否存在下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸興奮狀態(tài)及內(nèi)源性皮質(zhì)醇濃度的改變目前仍存在爭議[3-5]。組織細(xì)胞內(nèi)活性皮質(zhì)醇的水平受到11β類固醇羥化脫氫酶(11βHSD)的調(diào)節(jié)。11βHSD 酶主要有11βHSD1和11βHSD2兩種類型，其中11βHSD1可以使無活性的皮質(zhì)醇轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘钠べ|(zhì)醇，而11βHSD2的作用則相反[6-7]。而炎癥因子TNF-α可以調(diào)節(jié)11βHSD酶的表達(dá)和活性[8]。OSAHS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中是否存在11βHSD酶的改變目前不清楚。為此我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測中重度男性O(shè)SAHS患者外周血中皮質(zhì)醇、TNF-α的水平和PBMC中11βHSD mRNA的表達(dá)，并分析它們與OSAHS患者臨床參數(shù)之間的關(guān)系。

對象與方法

一、研究對象

1. OSAHS組

2013年11月至2015年5月在我院睡眠中心，經(jīng)夜間至少7 h多導(dǎo)睡眠監(jiān)測確診為中重度OSAHS的男性患者30例。入選標(biāo)準(zhǔn)參照2011年中華醫(yī)學(xué)會耳鼻咽喉科學(xué)會頒布的《阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診療指南2011修訂版》。以呼吸暫停低通氣指數(shù)(AHI)<5次/小時(shí)為正常，5～15次/小時(shí)為輕度，15～30次/小時(shí)為中度，≥30次/小時(shí)為重度。入選患者年齡均大于18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：①合并可能影響GC水平的疾病，如庫欣綜合征、糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)和甲狀腺功能減低等內(nèi)分泌疾??；②服用影響GC分泌的藥物；③嚴(yán)重心腦血管疾??；④其他全身炎癥性疾病、感染性疾病、自身免疫性疾??；⑤從事工作為晝夜顛倒性質(zhì)；⑥正在或已經(jīng)進(jìn)行持續(xù)正壓通氣或其他治療；⑦腫瘤；⑧精神神經(jīng)性疾病等。OSAHS組包含中度患者12例和重度患者18例，年齡20～63歲。

2.對照組

選取體檢合格的正常男性27名作為對照組，并經(jīng)多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(PSG)檢查，AHI<5次/小時(shí)，年齡18～62歲。

二、臨床資料收集

1.測量空腹時(shí)身高、體質(zhì)量、腰圍、和頸圍

BMI是由體質(zhì)量/身高2(kg/m2)計(jì)算(BMI≥28 kg/m2即為肥胖患者)。測量時(shí)，被測量者立正，腰圍在肚臍水平進(jìn)行的測量，頸圍在環(huán)甲膜上緣水平進(jìn)行測量。所有測量均由同一人進(jìn)行的，數(shù)據(jù)精確到cm。

2.觀察指標(biāo)

采用Monet32導(dǎo)聯(lián)多導(dǎo)睡眠呼吸監(jiān)測系統(tǒng)進(jìn)行整夜PSG檢查。檢查前1天內(nèi)，受試者禁止飲酒、茶和咖啡及服用安眠藥等。整晚監(jiān)測不少于7 h。記錄AHI、夜間最低血氧飽和度(LSaO2)、SaO2等指標(biāo)。血壓等均在PSG結(jié)束當(dāng)天清晨的8點(diǎn)(未進(jìn)食)進(jìn)行測量。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.樣本收集

經(jīng)所有參與者同意后，所有參與者均在行PSG結(jié)束后8點(diǎn)左右使用EDTA抗凝管抽取空腹靜脈血4 ml，暫存于4℃冰箱中，并于2 h內(nèi)完成血漿和PBMC的分離，血漿置于1.5 ml EP管中，立即放入-80℃冰箱中保存；每5×106～8×106個(gè)細(xì)胞加入1 ml Trizol(美國invitrogen公司)裂解細(xì)胞，也放入-80℃冰箱中保存。

2.血漿中皮質(zhì)醇和TNF-α濃度的ELISA測定

皮質(zhì)醇按照美國Cayman公司的試劑盒說明進(jìn)行；TNF-α按照美國BD的試劑盒進(jìn)行。之后均在酶標(biāo)儀中進(jìn)行讀數(shù)。

3.提取總RNA及逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA

按照Trizol試劑說明書提取PBMC中的總RNA。將已加入Trizol裂解細(xì)胞的EP管從-80℃冰箱中取出放置室溫，然后以等體積的氯仿萃取總RNA并以異丙醇將總RNA析出后，加入DEPC水溶解。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。

4. RT-PCR反應(yīng)

目的基因11βHSD1 mRNA和11βHSD2 mRNA及內(nèi)參基因β-actin的引物序列分別如下：11βHSD1 mRNA的上游引物序列為5′-GCTCTGTAGGTTCTCTCTGTG-3′，下游引物序列為5′- GTCTGAATTCCTGTTTGCAG-3′；11βHSD2 mRNA的上游引物序列為5′-TCGCGCGGTGCTCATCAC-3′，下游引物序列為5′-GTACGCAGCTCGATGGCACC-3′；β-actin的上游引物序列為5′-GCCGATCCACACGGAGTACTT-3′，下游引物序列為5′-TTGCCGACAGGATGCAGAA-3′。PCR反應(yīng)體系20 μl，反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 15 s，變性95℃ 3 s，退火及延伸60℃ 1 min，共45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品均平行做3個(gè)復(fù)孔。應(yīng)用ABI 7500 fast RT-PCR儀實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程。

5. 結(jié)果分析

PCR產(chǎn)物的特異性根據(jù)熔解曲線來判定，基因的相對表達(dá)量采用2-ΔCt法進(jìn)行分析。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)　　果

一、OSAHS組和對照組的臨床資料比較

OSAHS組和對照組中AHI、BMI、頸圍、腰圍、LSaO2、SaO2、收縮壓、舒張壓比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，而2組年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 OSAHS組和對照組一般資料的比較

注：1 mm Hg=0.133 kPa

二、OSAHS組和對照組皮質(zhì)醇、TNF-α和11βHSD1 mRNA的比較

皮質(zhì)醇在OSAHS組和對照組中分別為(142.94±30.25)ng/ml和(133.80±63.07)ng/ml，2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.69，P=0.50，圖1A)；TNF-α在OSAHS組和對照組中分別為(4.92±0.92)ng/ml和(4.44±0.52)ng/ml，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.44，P=0.02，圖1B)；11βHSD1 mRNA在OSAHS組和對照組中的相對表達(dá)量分別為(1.03±0.21)×10-4和(1.33±0.15)×10-4，2組比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.35，P=0.02，圖1C)；11βHSD2 mRNA在2組中均無表達(dá)。

三、OSAHS組中11βHSD1 mRNA與皮質(zhì)醇、TNF-α和臨床資料之間的相關(guān)性分析結(jié)果

11βHSD1 mRNA并未發(fā)現(xiàn)與皮質(zhì)醇和TNF-α之間存在顯著相關(guān)性；11βHSD1 mRNA也并未發(fā)現(xiàn)與AHI、BMI、LSaO2、SaO2、收縮壓、舒張壓等臨床參數(shù)間存在顯著相關(guān)性，見表2。

表2 11βHSD1 mRNA與各參數(shù)之間

四、OSAHS組中根據(jù)BMI分組情況的各參數(shù)間的比較

OSAHS組中有20例非肥胖伴OSAHS患者(BMI<28 kg/m2)和10例肥胖OSAHS患者(BMI≥28 kg/m2)。2組的皮質(zhì)醇、TNF-α和11βHSD1 mRNA等參數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

圖1　OSAHS組和對照組皮質(zhì)醇、TNF-α、11βHSD1 mRNA的比較

表3 OSAHS組中非肥胖組患者和肥胖患者的各參數(shù)比較

討　　論

皮質(zhì)醇作為HPA軸的終末產(chǎn)物之一，具有晝夜生物節(jié)律，表現(xiàn)為在午夜12點(diǎn)左右水平最低、而晨起8點(diǎn)左右水平最高[9-10]。血漿中皮質(zhì)醇濃度可作為評價(jià)HPA軸興奮性的指標(biāo)。OSAHS患者夜間睡眠片段化、微覺醒、間歇性缺氧及炎癥反應(yīng)等病理狀態(tài)可作為應(yīng)激源，并刺激機(jī)體，可能使HPA軸興奮和外周血皮質(zhì)醇濃度分泌增加。關(guān)于OSAHS患者體內(nèi)是否有HPA軸興奮性改變的研究存在爭議。Vgontzas等[ 3]和Bratel等[ 11]通過測定OSAHS患者體內(nèi)皮質(zhì)醇的水平后認(rèn)為HPA軸的興奮性是升高的。但是仍然有一些研究結(jié)果與之相悖，如Lanfranco等[ 12]、Panaree等[ 13]和Grunstein等[14]認(rèn)為OSAHS患者體內(nèi)不存在皮質(zhì)醇水平的升高。Karaca等[15]的結(jié)果甚至認(rèn)為OSAHS患者體內(nèi)的皮質(zhì)醇水平是降低的。出現(xiàn)這樣不一致的研究結(jié)果可能與標(biāo)本采集時(shí)間點(diǎn)、方法不同，以及所選取的實(shí)驗(yàn)對象納入標(biāo)準(zhǔn)不一致等因素有關(guān)。

我們通過測定外周靜脈血中皮質(zhì)醇的水平后發(fā)現(xiàn)OSAHS患者在早上8點(diǎn)左右皮質(zhì)醇的濃度較正常組并無升高，這與Lanfranco等[12]的結(jié)論相同。但是由于人體內(nèi)的皮質(zhì)醇分泌是連續(xù)的，并不能排除其他時(shí)間點(diǎn)或(段)存在皮質(zhì)醇水平升高的可能。盡管OSAHS組和對照組中BMI并不匹配，但通過BMI將OSAHS組分為OSAHS伴肥胖組和OSAHS伴非肥胖組后，發(fā)現(xiàn)2組皮質(zhì)醇水平并無不同，這可能由于選取的實(shí)驗(yàn)對象并非屬于變態(tài)肥胖患者，因此他們的體質(zhì)量對體內(nèi)皮質(zhì)醇水平并無明顯影響。

細(xì)胞內(nèi)11βHSD酶的表達(dá)對細(xì)胞內(nèi)活性皮質(zhì)醇的水平有重要調(diào)節(jié)作用。免疫細(xì)胞也具有調(diào)節(jié)內(nèi)源性活性皮質(zhì)醇水平的能力[6]。已有文獻(xiàn)認(rèn)為在單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞中存在11βHSD1酶的表達(dá)，但是卻并無11βHSD2酶的表達(dá)；并且認(rèn)為可以通過作用11βHSD1酶來影響細(xì)胞內(nèi)活性皮質(zhì)醇的水平進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫[6, 16-17]。D′Attilio等[16]對結(jié)核性胸膜炎患者PBMC中11βHSD1 mRNA和11βHSD2 mRNA進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)11βHSD1 mRNA有表達(dá)，而11βHSD2 mRNA無表達(dá)，認(rèn)為這是由于11βHSD2主要表達(dá)于鹽皮質(zhì)激素靶器官中，而PBMC不屬于這類組織細(xì)胞[16, 18]。我們發(fā)現(xiàn)11βHSD1 mRNA在2組中均有表達(dá)，表達(dá)率為100%，而11βHSD2 mRNA并沒發(fā)現(xiàn)表達(dá)，與D′Attilio等[16]的研究結(jié)果一致。Thieringer等[17]關(guān)于單核細(xì)胞的研究中也同樣發(fā)現(xiàn)存在11βHSD 1 mRNA的表達(dá)而無11βHSD2 mRNA的表達(dá)。另外，Zhang等[6]也在小鼠CD4+、CD8+和B220+等淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)存在11βHSD1 mRNA的表達(dá)，而無11βHSD2的表達(dá)。

有研究發(fā)現(xiàn)超重或肥胖患者的脂肪組織或者肝臟中11βHSD1含量表達(dá)升高；并且認(rèn)為在成骨細(xì)胞中，TNF-α能增強(qiáng)11βHSD1的活性及使其mRNA的表達(dá)增加[7-8]。盡管我們的實(shí)驗(yàn)對象中重度OSAHS患者較正常對照組有較高的BMI，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)中重度OSAHS患者體內(nèi)存在炎癥因子TNF-α的升高，但在中重度OSAHS患者PBMC中11βHSD1 mRNA的表達(dá)是降低的，并且11βHSD1 mRNA的表達(dá)降低與TNF-α之間并不存在顯著相關(guān)性。這或許是由于我們研究的組織細(xì)胞不一樣所導(dǎo)致的；脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞和成骨細(xì)胞等都不屬于免疫細(xì)胞，而PBMC由單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞組成，它們屬于免疫細(xì)胞。PBMC中11βHSD1 mRNA表達(dá)的降低使細(xì)胞內(nèi)的活性皮質(zhì)醇水平降低，從而降低皮質(zhì)醇對免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)及抗炎作用。

OSAHS的病理機(jī)制較為復(fù)雜，目前還不是非常清楚，可能是由多種機(jī)制作用的結(jié)果。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)OSAHS患者PBMC中11βHSD mRNA的表達(dá)水平存在著改變，但這種改變的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1]Steiropoulos P, Papanas N, Nena E, Antoniadou M, Serasli E, Papoti S, Hatzizisi O, Kyriazis G, Tzouvelekis A, Maltezos E, Tsara V, Bouros D. Inflammatory markers in middle-aged obese subjects: does obstructive sleep apnea syndrome play a role? Mediators Inflamm，2010, 2010: 675320.

[2]Baxter JD. Glucocorticoid hormone action. Pharmacol Ther B，1976, 2(3): 605-669.

[3]Vgontzas AN, Pejovic S, Zoumakis E, Lin HM, Bentley CM, Bixler EO, Sarrigiannidis A, Basta M, Chrousos GP. Hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity in obese men with and without sleep apnea: effects of continuous positive airway pressure therapy. J Clin Endocrinol Metab，2007, 92(11): 4199-4207.

[4]Edwards KM, Kamat R, Tomfohr LM, Ancoli-Israel S, Dimsdale JE. Obstructive sleep apnea and neurocognitive performance: the role of cortisol. Sleep Med，2014, 15(1): 27-32.

[5]Parlapiano C, Borgia MC, Minni A, Alessandri N, Basal I, Saponara M. Cortisol circadian rhythm and 24-hour Holter arterial pressure in OSAS patients. Endocr Res， 2005, 31(4): 371-374.

[6]Zhang TY, Ding X, Daynes RA. The expression of 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase type I by lymphocytes provides a novel means for intracrine regulation of glucocorticoid activities. J Immunol，2005, 174(2): 879-889.

[7]Asensio C, Muzzin P, Rohner-Jeanrenaud F. Role of glucocorticoids in the physiopathology of excessive fat deposition and insulin resistance. Int J Obes Relat Metab Disord，2004, 28 Suppl 4: S45-S52.

[8]Cooper MS, Bujalska I, Rabbitt E, Walker EA, Bland R, Sheppard MC, Hewison M, Stewart PM. Modulation of 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase isozymes by proinflammatory cytokines in osteoblasts: an autocrine switch from glucocorticoid inactivation to activation. J Bone Miner Res，2001, 16(6): 1037-1044.

[9]Chrousos GP. The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation. N Engl J Med，1995, 332(20): 1351-1362.

[10]Kino T, Chrousos GP. Acetylation-mediated epigenetic regulation of glucocorticoid receptor activity: circadian rhythm-associated alterations of glucocorticoid actions in target tissues. Mol Cell Endocrinol，2011, 336(1-2): 23-30.

[11]Bratel T, Wennlund A, Carlstr?m K. Pituitary reactivity, androgens and catecholamines in obstructive sleep apnoea. Effects of continuous positive airway pressure treatment (CPAP). Respir Med，1999, 93(1): 1-7.

[12]Lanfranco F, Gianotti L, Pivetti S, Navone F, Rossetto R, Tassone F, Gai V, Ghigo E, Maccario M. Obese patients with obstructive sleep apnoea syndrome show a peculiar alteration of the corticotroph but not of the thyrotroph and lactotroph function. Clin Endocrinol (Oxf)，2004, 60(1): 41-48.

[13]Panaree B, Chantana M, Wasana S, Chairat N. Effects of obstructive sleep apnea on serum brain-derived neurotrophic factor protein, cortisol, and lipid levels. Sleep Breath，2011, 15(4): 649-656.

[14]Grunstein RR, Handelsman DJ, Lawrence SJ, Blackwell C, Caterson ID, Sullivan CE. Neuroendocrine dysfunction in sleep apnea: reversal by continuous positive airways pressure therapy. J Clin Endocrinol Metab，1989, 68(2): 352-358.

[15]Karaca Z, Ismailogullari S, Korkmaz S, Cakir I, Aksu M, Baydemir R, Tanriverdi F, Bayram F. Obstructive sleep apnoea syndrome is associated with relative hypocortisolemia and decreased hypothalamo-pituitary-adrenal axis response to 1 and 250mug ACTH and glucagon stimulation tests. Sleep Med，2013, 14(2): 160-164.

[16]D'Attilio L, Díaz A, Santucci N, Bongiovanni B, Gardeez W, Marchesini M, Bogué C, Dídoli G, Bottasso O, Bay ML. Levels of inflammatory cytokines, adrenal steroids, and mRNA for GRalpha, GRbeta and 11betaHSD1 in TB pleurisy. Tuberculosis (Edinb)，2013, 93(6): 635-641.

[17]Thieringer R, Le Grand CB, Carbin L, Cai TQ, Wong B, Wright SD, Hermanowski-Vosatka A. 11 Beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 is induced in human monocytes upon differentiation to macrophages. J Immunol，2001, 167(1): 30-35.

[18]Draper N, Stewart PM. 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase and the pre-receptor regulation of corticosteroid hormone action. J Endocrinol，2005, 186(2): 251-271.

Study of expression levels of cortisol and 11βHSD mRNA in patients with obstructive sleep apnea hypopnea syndrome

HeFeng,YeJin.

DepartmentofOtolaryngology-HeadandNeckSurgery,theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China

Correspondingauthor,YeJin,E-mail：yejin_sums@aliyun.com

ObjectiveTo investigate the expression and significance of cortisol in the peripheral blood and 11 β-hydroxy steroid dehydrogenase(11βHSD) mRNA in the peripheral blood mononuclear cell(PBMC) in patients with obstructive sleep apnea hypopnea syndrome (OSAHS). MethodsEnzyme-linked immunoadsordent assay (ELISA) and real-time fluorescent quantitative PCR (RT-PCR) were utilized to detect the concentration of cortisol in the peripheral blood and the expression level of 11βHSD mRNA in the PBMC from 30 patients with moderate and severe OSAHS and 27 healthy male individuals. The relationship between the levels of cortisol and 11Βhsd mRNA, and clinical parameters was analyzed. ResultsThe concentration of cortisol in the peripheral blood did not significantly differ between two groups (t=-0.69,P=0.50). Compared with the control group, the expression level of 11βHSD1 mRNA in the OSAHS group was significantly down-regulated (t=2.35，P=0.02). However, 11βHSD2 mRNA was not expressed in either group. In the OSAHS group, no significant correlation was observed between the expression of 11βHSD1 mRNA and clinical parameters such as peripheral blood cortisol, TNF-α, et al. ConclusionsThe expression of 11βHSD1 mRNA in the PBMC from male patients with moderate to severe OSAHS was significantly down-regulated compared with that in their healthy counterparts. The underlying mechanism remains unclear. Nevertheless, the concentration of cortisol in OSAHS patients did not significantly differ from that in the healthy controls.

Sleep apnea，Obstructive; Peripheral blood mononuclear cell;

10.3969/j.issn.0253-9802.2016.09.008

510630 廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

，葉進(jìn)，E-mail：yejin_sums@aliyun.com

2016-04-06)(本文編輯：楊江瑜)