環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)及其在豬細(xì)菌病病原檢測中的應(yīng)用

文/山東綠都生物科技有限公司　李天芝　于新友

山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院　沈志強(qiáng)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)及其在豬細(xì)菌病病原檢測中的應(yīng)用

文/山東綠都生物科技有限公司李天芝于新友

山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院沈志強(qiáng)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)是一門新興的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，因其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、準(zhǔn)確、操作簡便和成本低等特點(diǎn)，越來越受到獸醫(yī)相關(guān)工作者的關(guān)注。目前，該方法己被廣泛應(yīng)用于各種豬病病原的檢測。文章綜述了LAMP技術(shù)在豬細(xì)菌病病原檢測中的應(yīng)用研究進(jìn)展，以期為今后豬細(xì)菌病的診斷和防控工作提供參考。

LAMP；豬細(xì)菌??；病原；檢測；應(yīng)用

豬細(xì)菌病對當(dāng)今養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的威脅，目前養(yǎng)殖場主要是將病料送到專業(yè)檢測實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原分離鑒定或PCR檢測，病原分離鑒定需要的時(shí)間相對較長，PCR檢測又需要特殊的儀器設(shè)備，不適合基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，一旦出現(xiàn)疫情，由于條件所限，很難實(shí)現(xiàn)對疫病的快速檢測。日本學(xué)者Notomi等［1］開發(fā)了一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)，該技術(shù)不需要模板的熱變性［2］、長時(shí)間溫度循環(huán)、繁瑣的電泳和紫外觀察等過程，整個(gè)反應(yīng)在恒溫條件下進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后，結(jié)果可用肉眼直接觀察［3］，在疫病診斷領(lǐng)域顯示了廣闊的應(yīng)用前景。本文就LAMP技術(shù)及其在豬病病原檢測中的應(yīng)用研究進(jìn)展綜述如下。

1　LAMP技術(shù)

1.1LAMP擴(kuò)增原理

LAMP技術(shù)是針對靶基因6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特殊引物，利用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶，在65℃左右溫度下，啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)，完成對目標(biāo)DNA的大量擴(kuò)增。在LAMP反應(yīng)中，內(nèi)引物雜交在目標(biāo)DNA區(qū)，啟動(dòng)互補(bǔ)鏈合成，導(dǎo)致啞鈴狀DNA產(chǎn)生。這種結(jié)構(gòu)很快以自身為板，進(jìn)行DNA合成延伸，形成莖-環(huán)DNA結(jié)構(gòu)，然后以此結(jié)構(gòu)作為LAMP循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。由于內(nèi)引物雜交在莖-環(huán)的環(huán)上，引物鏈置換合成的DNA產(chǎn)生一個(gè)有缺口的莖-環(huán)DNA中間媒介，在莖上附有目標(biāo)序列。再通過外引物，在莖的末端形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，結(jié)果在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成具有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖-環(huán)DNA混合物。

1.2LAMP引物設(shè)計(jì)

首先在靶基因的3'末端設(shè)定F3c、F2c、F1c 3個(gè)區(qū)段，在5'末端設(shè)定B1、B2、B3 3個(gè)區(qū)段。針對這6個(gè)區(qū)段設(shè)計(jì)4條引物，包括1對內(nèi)部引物和1對外部引物。上游內(nèi)部引物FIP：在3'末端含有與F2c互補(bǔ)的F2區(qū)段，在5'末端含有與F1c相同序列的區(qū)段下游內(nèi)部引物BIP：在3'末端含有與B2c互補(bǔ)的B2區(qū)段，在5'末端含有與B1c相同序列的區(qū)段。上游外部引物F3：含有與目標(biāo)DNA上的F3序列相同的區(qū)段。下游外部引物B3：含有與目標(biāo)DNA的B3相同序列的區(qū)段，各引物組成及對應(yīng)區(qū)域如下圖1所示。引物的設(shè)計(jì)要注意以下幾個(gè)問題：①擴(kuò)增領(lǐng)域?yàn)镕2～B2區(qū)段間，應(yīng)該在200bp以內(nèi)；②包含F(xiàn)2/B2在內(nèi)的環(huán)狀部分的長度在40～60bp范圍內(nèi)；③各區(qū)段的Tm值應(yīng)該在60～65℃之間；④若只是為了鑒定靶基因存在與否，F(xiàn)1～B1的間距可以為0；⑤引物應(yīng)避免二次結(jié)構(gòu)發(fā)生；⑥各引物的3'端不可含有與其他引物互補(bǔ)的序列。

1.3LAMP技術(shù)特點(diǎn)

LAMP技術(shù)具有以下特點(diǎn)：①操作簡便、耗時(shí)短、成本低，擴(kuò)增反應(yīng)在等溫下持續(xù)進(jìn)行，只需在恒溫水浴鍋中幾十分鐘即可完成，不需要特殊試劑，不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變性，適合在基層養(yǎng)殖場推廣應(yīng)用；②擴(kuò)增的效率高，沒有PCR反應(yīng)中溫模板的退火、復(fù)性過程，在15～60min內(nèi)可擴(kuò)增109～1010倍，能滿足臨床病料樣本快速檢測的需要；③特異性高，由于是針對靶序列6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)的4種特異性引物，6個(gè)區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進(jìn)行核酸擴(kuò)增，故其特異性極高。針對6個(gè)區(qū)段使用4種不同的引物，可特異性擴(kuò)增靶基因序列；④靈敏度高，檢測的敏感性是常規(guī)PCR的10倍，擴(kuò)增模板可達(dá)10拷貝或更少；⑤僅使用一種鏈置換型BstDNA聚合酶，因BstDNA聚合酶是一種不耐熱的DNA聚合酶，因此必須在模板預(yù)變性以后再加樣；⑥擴(kuò)增產(chǎn)物是在同一條DNA鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成大小不一的結(jié)構(gòu)；⑦當(dāng)模板是RNA時(shí)，僅需加入逆轉(zhuǎn)錄酶即可與DNA一樣進(jìn)行擴(kuò)增。

圖1　LAMP的引物組成及對應(yīng)區(qū)域

1.4反應(yīng)產(chǎn)物的檢測

LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的檢測方法主要有5種：①以2%的瓊脂糖凝膠電泳觀察是否有典型的梯狀條帶泳判定結(jié)果；②以擴(kuò)增產(chǎn)生的副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀的產(chǎn)生用肉眼直接判斷擴(kuò)增反應(yīng)是否進(jìn)行；③反應(yīng)體系中加入溴化乙錠、SYBR Green Ⅰ等染料，通過觀察擴(kuò)增結(jié)果是否產(chǎn)生相應(yīng)顏色來判定是否有目的片段擴(kuò)增；④通過恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片實(shí)時(shí)觀察反應(yīng)結(jié)果；⑤運(yùn)用實(shí)時(shí)濁度儀監(jiān)測反應(yīng)結(jié)果。

2　在豬細(xì)菌病檢測中的應(yīng)用

2.1豬霍亂沙門氏菌檢測

豬霍亂沙門氏菌是引起豬沙門氏菌病的主要血清型，主要感染斷奶期仔豬，引發(fā)仔豬副傷寒，臨床上以急性敗血癥、慢性壞死性腸炎、頑固性下痢等為特征，如果并發(fā)或繼發(fā)感染其他疾病或治療不及時(shí)，死亡率較高，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重困擾著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。時(shí)建立等［4］根據(jù)豬霍亂沙門氏菌lacZ基因設(shè)計(jì)特異性引物，通過優(yōu)化各種反應(yīng)條件，建立了檢測豬霍亂沙門氏菌的LAMP快速檢測方法，該法特異性好，靈敏度高，將細(xì)菌DNA稀釋到10-8仍可檢出，是PCR方法的1,000倍。

2.2豬鏈球菌血清2型檢測

豬鏈球菌2型（SS2）是一種重要的人獸共患病病原菌，它能引起豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥、肺炎和突然死亡，各年齡段豬均可感染豬鏈球菌病，但以3～12周齡豬，尤其斷奶仔豬最易感［5］，該病已成為嚴(yán)重影響各國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的一種重要疫?。?］。張九州等［7］根據(jù)GenBank登錄的豬鏈球菌2型特異的莢膜多糖（cps2 H）基因序列作為檢測靶標(biāo)，在其序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)LAMP引物，利用參考菌株S735基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，優(yōu)化了LAMP的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，并進(jìn)行了敏感性、特異性和重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，該法對SS2進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物顯色呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，電泳出現(xiàn)階梯狀條帶，最低檢測量為0.186fg/μL模板DNA，比常規(guī)PCR高1,000倍，且與其他常見的細(xì)菌無交叉反應(yīng)。

2.3副豬嗜血桿菌檢測

副豬嗜血桿菌（Hps）可引起豬的副豬嗜血桿菌病，該病以纖維素性漿膜炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征。近幾年來，世界各地均有發(fā)生副豬嗜血桿菌病的報(bào)道，并且發(fā)病率呈上升的趨勢，已經(jīng)成為一個(gè)全球性的重要豬?。?］。隨著我國規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的不斷發(fā)展，該病發(fā)作呈加速流行趨勢并成為多病原呼吸道疾病綜合征中的重要一員，危害日漸嚴(yán)重，對養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。車勇良等［9］建立了Hps可視化LAMP檢測方法，在55℃水浴1h即可對Hps核酸進(jìn)行高效擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后加入SYBR Green Ⅰ即可通過肉眼觀察對結(jié)果進(jìn)行判斷。該方法具有很強(qiáng)的特異性，其對DNA核酸的最低檢測限為40fg，是常規(guī)PCR檢測最低限的100倍，顯示出較高的敏感性。

2.4豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌檢測

豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌（APP）作為豬傳染性胸膜肺炎的病原菌，可引起嚴(yán)重的傳染性呼吸道疾病，該病具有高發(fā)病率和致死率，廣泛分布于各國，主要感染生長育肥豬，可引起發(fā)燒、腹瀉以及嚴(yán)重的呼吸窘迫。劉亞娟等［10］根據(jù)APP ApxIVA基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)6條-LAMP引物，建立了APP的LAMP方法。結(jié)果顯示，該法在64℃下反應(yīng)15min，DNA即可出現(xiàn)擴(kuò)增，擴(kuò)增后2～3min內(nèi)即可判定結(jié)果，最低檢測限為0.307ng/L，具有良好的重復(fù)性及穩(wěn)定性，與其他病原菌無交叉反應(yīng)，同時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果可實(shí)現(xiàn)肉眼可視化觀察。

2.5豬多殺性巴氏桿菌檢測

豬多殺性巴氏桿菌（Pm）為豬呼吸道綜合征的主要病原之一，可原發(fā)或繼發(fā)豬呼吸道綜合征，降低飼料利用率，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。孫建華等［11］根據(jù)豬多殺性巴氏桿菌Plp B基因序列為靶基因設(shè)計(jì)特異性引物，建立了豬Pm特異性的LAMP快速檢測方法。經(jīng)反應(yīng)條件優(yōu)化，確定反應(yīng)條件為63℃、20min。檢測結(jié)果顯示，建立的LAMP檢測方法具有良好的特異性，靈敏度為25cfu/mL，與大腸桿菌、Hps、APP、沙門氏菌無任何交叉反應(yīng)。

2.6金黃色葡萄球菌檢測

金黃色葡萄球菌感染可造成豬的急性、亞急性或慢性乳腺炎，壞死性葡萄球菌皮炎及乳房的膿皰病。蔡克周等［12］以金黃色葡萄球菌（CMCC10201）的femA基因作為靶序列，設(shè)計(jì)LAMP和PCR引物，通過凝膠電泳，判斷檢測結(jié)果。對8株常見致病菌進(jìn)行LAMP特異性試驗(yàn)，表明對金黃色葡萄球菌的檢測具有很高的特異性，LAMP檢測金黃色葡萄球菌的靈敏度為8.7cfu/mL，直接檢測豬血中金黃色葡萄球菌的檢出限為8.7×102cfu/mL，PCR法的檢出限為8.7×103cfu/mL。

3　小結(jié)

LAMP技術(shù)作為一種快速基因擴(kuò)增技術(shù)，自發(fā)明以來，在國內(nèi)外疾病、衛(wèi)生、食品及環(huán)境等多個(gè)領(lǐng)域都取得了重大成就，近年來受到了越來越多的關(guān)注，LAMP的整個(gè)過程均在恒溫條件下進(jìn)行，不需要昂貴的儀器設(shè)備，而易在基層部門普及的檢測技術(shù)，避免了常規(guī)PCR對于溫度循環(huán)的特殊要求所帶來的各種不便，可快速、準(zhǔn)確地做出傳染性疾病病原學(xué)診斷，從而及時(shí)有效控制疫情，使養(yǎng)殖場損失降到最低。但LAMP檢測技術(shù)同樣存在一些不足：①LAMP對于引物設(shè)計(jì)要求很高，需要設(shè)計(jì)的引物數(shù)目多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜。②檢測靈敏度太高，易因空氣中的氣溶膠污染而產(chǎn)生假陽性結(jié)果。③在LAMP擴(kuò)增結(jié)果判定方面也存在一定的問題，當(dāng)以瓊脂糖凝膠電泳法法判定結(jié)果時(shí)，結(jié)果為梯形條帶，不易鑒別非特異性擴(kuò)增。當(dāng)焦磷酸鎂白色沉淀和體系中添加染料法判定結(jié)果時(shí)，可能存在因結(jié)果顏色不明顯而造成肉眼觀察不便捷及誤判。另外，當(dāng)有非特異擴(kuò)增時(shí)，染料也可結(jié)合，影響結(jié)果判定。當(dāng)微流控芯片和實(shí)時(shí)濁度儀法判定結(jié)果時(shí)，則需要購置昂貴的分析儀器，隨著研究的不斷深入，研究人員還將其原位雜交、免疫捕獲、核酸雜交等技術(shù)進(jìn)行聯(lián)合，開發(fā)了很多有效的檢測方法，尤其是將環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增與橫向流動(dòng)試紙條技術(shù)結(jié)合，將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）與橫向流動(dòng)試紙條（LFD）聯(lián)合應(yīng)用，建立一種新的病原快速檢測技術(shù)，即LAMP-LFD技術(shù)，使得LAMP現(xiàn)場檢測結(jié)果的觀察更加方便、直觀和準(zhǔn)確。并解決了擴(kuò)增產(chǎn)物形成氣溶膠污染環(huán)境，導(dǎo)致樣品間交叉污染的問題，開啟了基因檢測技術(shù)步入基層養(yǎng)殖場的應(yīng)用新時(shí)代，極具推廣前景。目前已經(jīng)有科研人員在CSFV的檢測方面［13］進(jìn)行了一些探索，并取得了一定的成績，筆者認(rèn)為，LAMP-LFD技術(shù)將是未來LAMP檢測技術(shù)將來的發(fā)展方向，在一些基層實(shí)驗(yàn)室和流行病學(xué)調(diào)查等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。■

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山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-06-011-14）；

山東省自然科學(xué)基金（ZR2012CQ012）；山東省技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目（201220916006）。