王曉波，鄭　欣，陳一心，邱旭升，朱彥丞，桂雪洋，王駿飛，施鴻飛，熊　進

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·論著·

金黃色葡萄球菌植入總量對兔橈骨骨髓炎模型的影響

王曉波，鄭欣，陳一心，邱旭升，朱彥丞，桂雪洋，王駿飛，施鴻飛，熊進

目的通過不同量金黃色葡萄球菌植入兔橈骨，觀察影像學及組織學變化，探討兔橈骨骨髓炎動物模型中金黃色葡萄球菌的合適劑量。方法35只成年雄性新西蘭兔雙側(cè)橈骨制造骨窗，注入不同量(1×104～1×109CFU)的金黃色葡萄球菌作為實驗組(A～F組)，對照組注入0.1mL生理鹽水，每組5只。分別于術(shù)后當日、術(shù)后2周、4周行X線及CT掃描檢查。術(shù)后4周完成影像學評分后，處死兔取出橈骨完成肉眼觀察評分，再作細菌培養(yǎng)、組織病理學檢查并完成組織學評分。結(jié)果F組兔因感染過重死亡2只；C、D、E、F組術(shù)后4周體重明顯減輕，平均減輕量分別為(75.6±24.9)g、(119.0±42.7)g、(184.1±51.7)g、(194.9±63.2)g，體重改變組間無明顯差異(P>0.05)，切口滲出較多，可見竇道形成。術(shù)前術(shù)后體重變化、肉眼觀察評分、影像學評分和組織學評分LSD法比較，P<0.05。術(shù)后4周影像學、肉眼觀察及組織學檢查D組只可見少量的骨感染表現(xiàn)，而E、F組可見嚴重的骨感染表現(xiàn)；E組及F組的肉眼觀察評分[(2.6±0.2)和(2.8±0.1)]、影像學評分[(17.6±0.3)和(19.4±0.2)]和組織學評分[(7.2±1.1)和(8.4±0.2)]明顯高于其他五組(P<0.05)；細菌學檢查僅D、E、F三組培養(yǎng)出細菌。結(jié)論兔橈骨急性骨髓炎動物模型制作的最佳細菌量為1×108CFU，本實驗的方法簡單易行，適用于建立骨髓炎動物模型。

橈骨； 骨髓炎； 骨感染； 細菌； 模型； 兔

隨著交通事故的頻繁發(fā)生，各種開放性骨折日益增加，并通常伴有感染和骨缺損而導致骨不愈合，其治療是骨科臨床中的一大難題[1-2]。感染性骨缺損動物模型的建立為其研究提供了思路和方向，目前常用先建立骨髓炎再清創(chuàng)制造骨缺損的方法來建立感染性骨缺損動物模型[3]。不同實驗動物不同部位所需的細菌用量不同，實驗中若細菌用量過多則易導致實驗動物嚴重感染而死亡，而用量不足則實驗動物無法感染致建模失敗。由于兔橈骨有其獨特的優(yōu)勢常用于骨髓炎模型的制作，但其細菌用量目前文獻報道各有差異[4-5]。本實驗通過對兔橈骨注射不同量細菌后評價其是否感染，以確定兔橈骨骨髓炎動物模型中金黃色葡萄球菌的最佳細菌用量，為骨感染的研究提供依據(jù)。

材料與方法

1材料

雄性新西蘭兔35只(6月齡，體重2.0～2.5kg,南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院動物實驗中心提供)，已排除先天性畸形、營養(yǎng)不良等疾?。唤瘘S色葡萄球菌ATCC25923(杭州天和微生物有限公司，來自美國模式培養(yǎng)物集存庫)；戊巴比妥鈉、氯胺酮；常規(guī)手術(shù)器械1套，牙科鉆(STRONG 90磨鉆)，游標卡尺、直尺；CT(Discovery CT 750HD，美國GE公司)，X 射線攝片機(Digital Diagnost，荷蘭PHILIPS 公司)；比濁儀(DENSIMAT，法國BIOMERIEUX公司)。

2實驗分組及模型制作

利用比濁儀對金黃色葡萄球菌進行定量后濃縮制成濃度為1×1010CFU/mL的菌液，再分別稀釋制成每0.1mL有1×109CFU 、1×108CFU、1×107CFU、1×106CFU、1×105CFU、1×104CFU細菌濃度的細菌液。選用35只6月齡雄性健康新西蘭兔隨機分為7組，每組5只，分別為對照組(0.1mL生理鹽水)、A組(1×104CFU)、B組(1×105CFU)、C組(1×106CFU)、D組(1×107CFU)、E組(1×108CFU)和F組(1×109CFU)，雙側(cè)手術(shù)共計70側(cè)。

采用氯胺酮50mg/kg肌肉注射后，3%戊巴比妥鈉20mg/kg耳緣靜脈麻醉，雙側(cè)前臂備皮，取仰臥位固定于兔板，手術(shù)區(qū)消毒，鋪無菌單。于前臂橈側(cè)中下段切開皮膚、皮下組織及筋膜，分離肌肉以顯露橈骨骨膜，在橈骨中下段用高轉(zhuǎn)速牙科鉆鉆取直徑3mm的孔后吸出橈骨中上段的骨髓(圖1)；將兔橈骨遠端抬起，分別注入0.1mL生理鹽水作為對照或不同量的金黃色葡萄球菌后用骨蠟封閉骨窗(圖1)。依次縫合肌膜及皮下組織、皮膚，碘伏消毒切口并仔細包扎，單籠飼養(yǎng)。

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圖1造模實驗術(shù)中照片。a.術(shù)中兔橈骨鉆孔并清除橈骨近端骨髓腔骨髓注入細菌；b.注入細菌后利用骨蠟封閉骨窗，防止菌液外溢

3肉眼、影像學觀察

術(shù)后觀察動物的進食、活動等一般情況，記錄兔切口部位的滲出情況、有無膿液流出、有無竇道形成等，記錄死亡情況。術(shù)前及術(shù)后4周分別稱量各新西蘭兔的體重，計算體重變化。術(shù)后4周處死動物，并再次沿原切口進入暴露橈骨，觀察骨形態(tài)及周圍軟組織情況。采用唐輝和徐永清[6]的方法，雙盲完成肉眼觀察評分，包括0～3分：0分，無感染征象；1分，皮膚表面僅有少量紅斑；2分，紅斑合并橈骨干增粗及竇道形成，或合并膿液滲出；3分，嚴重骨質(zhì)吸收、膿腫。術(shù)后當日、術(shù)后2、4周分別行X線及CT掃描檢查，觀察橈骨的變化及術(shù)中所作缺損孔的大小變化，并借鑒Ambrose等[3]的方法，完成影像學評分：骨膜厚度、骨小梁結(jié)構(gòu)變形、骨干拓寬、新骨形成、軟組織結(jié)構(gòu)變形，每個參數(shù)評分為0～4分；孔大小評分，術(shù)后分別測量每只實驗兔橈骨孔的最大直徑(mm)，孔完全閉合記為0分、最大直徑0～1mm為1分、1～2mm為2分、2～3mm為3分、≥3mm記為4分，分別計算每只實驗兔的放射學參數(shù)總分。

4細菌學及組織學檢查

術(shù)后4周處死實驗動物并沿原切口暴露取橈骨骨髓腔內(nèi)容物及周圍軟組織涂于血瓊脂培養(yǎng)板上，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，分別作細菌學培養(yǎng)。同時將取出的橈骨用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后所有標本在體積分數(shù)3%的甲醛溶液中固定24h，10%的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液脫鈣，每3d更換一次脫鈣液。脫鈣完全后，行石蠟包埋，組織切片的厚度為5μm，用蘇木精-伊紅染色觀察作組織學檢查，并參照Ambrose等[3]的方法，完成組織學評分。細菌情況：顯著膿腫形成3分，中等量膿腫形成2分，少量膿腫形成1分，無膿腫形成0分；骨內(nèi)炎癥情況：嚴重炎癥、纖維化、膿腫3分，中等炎癥、纖維化2分，少量炎癥、纖維化1分，無炎癥、僅纖維化 0分；新骨形成比例：<25%3分，25%～50% 2分，50%～75%1分，75%～100%0分。

5統(tǒng)計學分析

結(jié)　果

1一般情況

所有兔術(shù)后均出現(xiàn)精神萎靡，但對照組及A、B、C三組實驗兔術(shù)后一周精神緩慢恢復，切口無明顯滲出。D、E、F組實驗兔術(shù)后觀察期內(nèi)精神狀態(tài)一直欠佳，飲食較少，體重明顯減輕，切口有大量滲出，并有竇道形成(圖2)，F(xiàn)組因感染過重于術(shù)后5、8d分別死亡1只。各組體重變化情況如表1，對照組及A、B三組術(shù)后4周體重較術(shù)前明顯增加，C、D、E、F四組術(shù)后4周體重明顯減輕。各組LSD法比較P<0.05，具體組間比較如下：對照組與A、B組體重增加無顯著差異(P>0.05)，而與其余組相比差異顯著(P<0.05)；A組與B組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而A、B組與C、D、E、F組均有顯著差異(P<0.05)；C、D、E、F組之間體重變化差異不顯著(P>0.05)。術(shù)后4周處死實驗兔暴露橈骨后可見D、E組橈骨周圍軟組織大量壞死、液化并機化包裹形成膿腫(圖2)。肉眼觀察評分分布如表2，各組LSD法比較P<0.05，具體組間比較如下：對照組與A組間無顯著差異(P>0.05)，與其余各組差異顯著(P<0.05)，A組與B組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與C、D、E、F組差異具有顯著性(P<0.05)；B組與C組差異不顯著(P>0.05)，與D、E、F三組差異顯著(P<0.05)；C組與D組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而與E、F組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；D、E、F組之間有顯著差異(P<0.05)；相鄰組間肉眼觀察評分比較從D組與E組開始出現(xiàn)統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

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圖2造模術(shù)后4周外觀及切開暴露后照片。a.術(shù)后4周E組兔橈骨皮膚表面仍存在竇道，并有少量膿性分泌物滲出； b.術(shù)后4周沿原切口切開皮膚暴露橈骨可見骨缺損仍存在，與術(shù)中相比并無縮小，周圍軟組織大量液化、壞死并存在大量機化包裹形成的膿腫

2影像學檢查

A、B、C三組術(shù)后4周CT三維重建顯示術(shù)中所鉆孔已經(jīng)完全愈合(圖3)，X線攝片未見明顯的骨質(zhì)破壞及骨密度降低，而D、E、F三組孔大小術(shù)后4周與術(shù)前無明顯變化(圖3)，其中D組只可見少量的骨組織破壞，而E、F組可見明顯的骨皮質(zhì)反應(yīng)及骨密度減低，骨溶解，呈蟲蝕樣破壞，輕度到廣泛的新骨形成，骨干畸形，橈骨遠端有死骨形成(圖3)。影像學評分均值如表2，各組LSD法比較P<0.05，具體組間比較如下：對照組與A組差異不顯著(P>0.05)，其余各組間差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；相鄰組間影像學評分比較從A組與B組開始出現(xiàn)顯著統(tǒng)計學差異(P<0.05)，其中B組和C組的影像學評分改變幅度較大。

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圖3術(shù)后4周兔橈骨X線及CT三維重建圖。a.術(shù)后4周E組X線，箭頭處可見骨密度減低，骨溶解，呈蟲蝕樣破壞，廣泛的新骨形成，骨干畸形，橈骨遠端有死骨形成；b.術(shù)后4周C組尺橈骨CT三維重建圖，箭頭處可見術(shù)中所鉆孔變小，CT軟件測量直徑約為2mm；c.術(shù)后4周C組尺橈骨CT三維重建圖，箭頭處可見術(shù)中所鉆孔依然較大，CT軟件測量直徑約為3mm

3細菌學檢查

A、B、C三組術(shù)后4周骨髓腔內(nèi)容物及周圍軟組織均未檢查出細菌；而D、E、F三組均培養(yǎng)出細菌，為金黃色葡萄球菌。

4組織學檢查

(1)大體病理：對照組及A、B、C三組無明顯的膿腫形成，D、E兩組可見少量的膿腫形成，F(xiàn)組可見明顯的軟組織腫脹，切開后可見黃白色膿液、較黏稠，符合金黃色葡萄球菌膿液的特點。D、E、F三組骨組織上可見死骨的外觀發(fā)暗，與正常的骨組織有明顯區(qū)別(圖4)。(2)顯微病理：鏡下觀察可見明顯急慢性炎癥表現(xiàn)，大量漿細胞和淋巴細胞集中，骨小梁結(jié)構(gòu)破壞溶解，死骨可見大量的骨小梁結(jié)構(gòu)破壞松散，骨細胞消失，形成大片嗜伊紅組織即膿腫。(3)組織學觀察評分見表2，各組LSD法比較P<0.05，具體組間比較如下，對照組與A組均無顯著差異(P>0.05)，與其余組均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；A組與除對照組外的組別差異均具有顯著性(P<0.05)；B組與C組無明顯差異(P>0.05)，與C、D、E、F組具有顯著性差異(P<0.05)；C組與除B組外的組別差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；D組與其余組均具有顯著差異(P<0.05)；E組及F組顯著高于對照組和A、B、C、D組(P<0.05)，同時，E組與F組之間也有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

表1　術(shù)前與術(shù)后4周兔體重變化表

表2　肉眼觀察、影像學及組織學評分表

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圖4兔橈骨標本大體及鏡下圖。a.術(shù)后4周E組取出的兔橈骨大體標本圖，黑色框內(nèi)為術(shù)中所鉆注入細菌的孔，紅色框內(nèi)為死骨，可見骨組織明顯發(fā)暗；b.E組橈骨病理切片圖(40×)，可見骨小梁溶解破壞，骨組織大量破壞，骨連續(xù)性不完整；c.E組橈骨病理切片圖(100×)，可見大量的中性粒細胞及淋巴細胞聚集，形成骨膿腫

討　論

近年來骨組織工程學不斷發(fā)展，利用組織工程的方法來治療骨感染已成為目前研究的熱點[7]，而建立實驗動物的骨感染模型是其研究的基礎(chǔ)。本研究制作的為急性骨感染模型，可在后續(xù)研究中用于藥物、植入物相關(guān)感染等研究。同時，早期的骨髓炎模型與患者發(fā)病后的就醫(yī)時間較為相近，更好地為臨床骨髓炎或骨感染治療的研究提供參考依據(jù)。新西蘭兔在常用的實驗動物中較易感染且實驗成本較小而被用于各種骨組織工程研究。兔前臂橈骨和尺骨解剖學融合在一起，可在后續(xù)實驗中比較完整地進行截骨手術(shù)，建立節(jié)段性感染性骨缺損模型，而不需要內(nèi)固定或外固定。因此本研究中筆者選擇兔橈骨制作急性骨髓炎模型[8]。眾多實驗表明[8-10]，在兔骨髓腔內(nèi)注入細菌后4周，兔橈骨急性骨髓炎即可確診，因此本研究以術(shù)后4周作為觀察期。

建立兔骨感染模型時既要保證骨成功感染的比例又需要控制感染的嚴重程度，所以確定合適的細菌量尤為必要，然而，對于細菌的用量一直存在爭議。本研究對此進行探討發(fā)現(xiàn)，若要出現(xiàn)明顯的骨感染征象如大體觀察、影像學和組織學的改變，需至少注入金黃色葡萄球菌1×108CFU，但當注入1×109CFU的金黃色葡萄球菌時，實驗兔死亡率較高，筆者的研究中5只即出現(xiàn)2只死亡。而Gillaspy等[9]研究表明，當植入兔橈骨細菌量低于2×105CFU時，1個月后6只實驗兔中僅有1只確定骨感染。Smeltzer等[5]兔橈骨感染模型研究中也發(fā)現(xiàn)，當在橈骨中段截取1cm骨缺損時，至少需植入1×105CFU金黃色葡萄球菌才能保證實驗的成功率在95%以上，但植入1×103CFU時仍可保持75%的感染率：當植入2×105CFU金黃色葡萄球菌時，所有兔骨和軟組織均有骨感染表現(xiàn)；當植入2×103CFU金黃色葡萄球菌時，橈骨感染率約為75%，軟組織感染率僅為50%。Nelson等[11]在52只兔橈骨截取1cm骨缺損后注入1×106CFU的金黃色葡萄球菌建立感染性骨缺損模型也觀察到，12周后所有兔均有紅腫、發(fā)熱、膿腫及竇道形成。上述兩位學者的研究在術(shù)中制造了1cm的大段骨缺損，其大段骨缺損的存在可能促進了兔橈骨的感染，且骨缺損在注入細菌后未用骨蠟封閉，細菌可從骨缺損部位溢出，到達周圍軟組織內(nèi)，周圍軟組織內(nèi)因手術(shù)大量瘀血、肌肉組織壞死等營養(yǎng)豐富，為細菌大量增殖提供營養(yǎng)基礎(chǔ)。因此，所用金黃色葡萄球菌量分別與本研究B組和C組相當即成功建模。以上研究均未加入其他因素促進骨感染率，如硬化劑、異體骨移植、熱損傷、骨破壞等。Evans等[10]為研究不同骨損傷環(huán)境對于急性骨髓炎的影響，在兔橈骨骨髓腔中注入1×108CFU的金黃色葡萄球菌ATCC25923，12只實驗兔僅有2只出現(xiàn)急性骨髓炎表現(xiàn)，即感染率僅有17%；而當植入死骨后，植入相同量的細菌28只實驗兔有26只出現(xiàn)骨感染表現(xiàn)，感染率達到93%，本研究由于使用高轉(zhuǎn)速牙科鉆，在制造骨窗中可導致骨窗周圍溫度過高而形成死骨，因此與Evans等[10]植入死骨組的細菌量相仿。而李云飛等[12]利用骨髓穿刺的方法，用12號注射針頭由兔脛骨結(jié)節(jié)刺入兔脛骨骨髓腔中，注入1×108CFU的金黃色葡萄球菌，術(shù)后40只實驗兔中有37只有明顯的脛骨骨髓炎表現(xiàn)。該模型的建模中未用骨蠟封閉骨缺損部位，且術(shù)中以干棉簽按壓止血，菌液因被棉簽吸附而致實際注入菌液量較少，因此其雖未加入死骨，但結(jié)果仍與本實驗相當。

本實驗具有以下不足：(1)研究每組樣本量較少，需進一步擴充樣本量獲得可靠的數(shù)據(jù)；(2)為確定急性骨髓炎模型的制作成功，本研究采用的觀察時間為4周，未對4周后的結(jié)果進行觀察，但鑒于后兩組感染的嚴重性，可以預見，在8周后，仍可觀察到兔橈骨較重的骨感染癥狀。

綜上所述，本研究表明，當使用高速牙科鉆鉆孔注入細菌并封閉骨窗的方法，制作兔橈骨急性骨髓炎動物模型時，注射細菌量達到1×108CFU為最佳劑量，可達到明顯的放射學、細菌學和組織學改變，適用于急慢性骨髓炎研究中的模型制備。

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(本文編輯： 郭衛(wèi))

Effect of the total implantation amount of Staphylococcus aureus in rabbit model of bone osteomyelitis

WANGXiao-bo,ZHENGXin,CHENYi-xin,QIUXu-sheng,ZHUYan-cheng,GUIXue-yang,WANGJun-fei,SHIHong-fei,XIONGJin

(Department of Orthopaedics,Nanjin Drum Tower Hospital the Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School, Nanjing210008,China)

ObjectiveThrough implantation of different doses of Staphylococcus aureus into radial bone in rabbits,to observe the radiographic and microbial changes and to discuss an appropriate dose of Staphylococcus aureus in rabbit model of bone osteomyelitis. MethodsBone defects were made bilaterally in the radius of 35 male New Zealand rabbits. Different doses of staphylococcus aureus were inoculated as the experimental group A-F(1×104CFU for group A, 1×105CFU for group B,1×106CFU for group C,1×107CFU for group D,1×108CFU for group E,and 1×109CFU for group F). 0.1mL saline solution was injected into each rabbit in the control group(n=5). X-ray and CT were taken immediately after surgery,2-week,and 4-week postoperatively. The radiographic score,visual inspective score and histological score were estimated four weeks postoperatively. The rabbits were sacrificed four weeks after surgery and the specimens were harvested for pathologic analysis and bacterial cultivation. ResultsAnorexia and lassitude were observed in all rabbits. In group F,two rabbits died from infection and thus were excluded from analysis. Body weight loss was observed in group C[(75.6±24.9)g],group D[(119.0±42.7)g],group E[(184.1±51.7)g],and group F[(194.9±63.2)g],but there was no significant statistical difference in body weight change in these groups(P>0.05). LSD comparison showed that there were statistical differences in body weight,radiographic score,visual inspection score and histological score between preoperatively and postoperatively(P<0.05). The radiographic,visual inspective and histological appearance of osteomyelitis were evident in group E and F,but mild in group D. The radiographic score,visual inspection score and histological score were significantly higher in group E(2.6±0.2,17.6±0.3 and 7.2±1.1) and group F(2.8±0.1,19.4±0.2 and 8.4±0.2) than those of other groups(P<0.05). Bacteria culture showed positive in group D,E and F,but negative in other groups. ConclusionThe suitable dose of staphylococcus aureus should be 1×108CFU. The method of this investigation is convenient and satisfactory,which may be considered as an alternative to establish the radius osteomyelitis model in rabbits.

radius; ostemyelitis; bone infection; bacteria; model; rabbit

1009-4237(2016)07-0415-05

國家自然科學基金項目(81401793)； 江蘇省六大人才高峰項目(2012-WS-092)； 南京市衛(wèi)生局項目(ZKX12026、YKK13079)； 江蘇省研究生科研創(chuàng)新項目(省助SJZZ_0030)

210008 江蘇，南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院骨科

陳一心，E-mail:chenyixin93@126.com

R 63

A【DOI】 10.3969/j.issn.1009-4237.2016.07.009

2015-03-12；

2016-04-12)