天津地區(qū)奶牛乳房炎葡萄球菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

文/馬騰宇　陳麗麗　汪　志　白娜仁吐雅

天津地區(qū)奶牛乳房炎葡萄球菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

文/馬騰宇1陳麗麗2汪志3白娜仁吐雅3

（1天津食品集團(tuán)有限公司；2天津市奶牛發(fā)展中心；3天津嘉立荷畜牧有限公司）

通過血平板培養(yǎng)、革蘭氏染色、生化鑒定試驗(yàn)，對(duì)天津地區(qū)由葡萄球菌引起的奶牛乳房炎進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)其進(jìn)行耐藥性分析。結(jié)果顯示，采集199 份奶樣中共檢出葡萄球菌53 株，其中金黃色葡萄球菌40 株、表皮葡萄球菌13 株；檢出的葡萄球菌對(duì)頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、丁胺卡那霉素高度敏感，可以用以上4 種抗生素對(duì)由葡萄球菌引起的奶牛乳房炎進(jìn)行治療。

奶牛；乳房炎；葡萄球菌；藥敏試驗(yàn)

奶牛乳房炎與子宮炎、肢蹄病被稱為奶牛三大難治愈的疾病，是奶牛的一種常見病與多發(fā)病，只要飼養(yǎng)奶牛的地方，就有乳房炎發(fā)生。乳房炎是奶牛乳腺組織受到病原體的侵襲及物理、化學(xué)因素刺激所發(fā)生的一種炎癥反應(yīng)，該病的發(fā)生給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了非常大的損失［1］。奶牛乳房炎可由多種病原微生物引起，包括細(xì)菌、霉形體、真菌和病毒等，一般以細(xì)菌感染為主，其中葡萄球菌是導(dǎo)致奶牛乳房炎的最主要病原菌，鏈球菌和大腸桿菌也比較常見［2～4］。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界范圍內(nèi)，每年因奶?；既榉垦讓?dǎo)致的奶產(chǎn)量下降可達(dá)380 萬噸［5］。因此對(duì)奶牛乳房炎采取適當(dāng)治療、對(duì)癥用藥，減少產(chǎn)奶量損失，對(duì)國(guó)際奶業(yè)的發(fā)展具有重要意義。奶牛乳房炎一般采用抗生素治療，殺滅侵入組織的病原體，并消除炎癥反應(yīng)。常用的抗菌藥物有青霉素、鏈霉素、卡那霉素、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、磺胺類及喹諾酮類藥物等［6］。本研究對(duì)天津地區(qū)引起奶牛乳房炎的葡萄球菌進(jìn)行分離、鑒定，并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，為指導(dǎo)臨床科學(xué)用藥，有效降低乳房炎的發(fā)病率，促進(jìn)奶牛養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1奶樣采集

在天津周邊的大港區(qū)（位于天津的南部）、靜海區(qū)（位于天津的西部）、寶坻區(qū)（位于天津的北部）不同規(guī)模奶牛場(chǎng)選取患乳房炎病牛，其中在大港區(qū)3 個(gè)牛場(chǎng)中選取20 頭、靜海區(qū)2 個(gè)牛場(chǎng)中選取10 頭，寶坻區(qū)地理分布不同的4 個(gè)牛場(chǎng)中選取20 頭。一共采集了9 個(gè)牛場(chǎng)199 份奶樣，其中大港地區(qū)80 份奶樣，靜海地區(qū)38 份奶樣，寶坻地區(qū)81 份奶樣。

先用溫水清洗乳房，擦干后用浸有消毒藥液，如0.2%新潔爾滅溶液的濕毛巾擦拭乳房，待皮膚干燥后再以75%酒精棉消毒乳頭口及其周圍。清洗消毒后，每個(gè)乳頭擠出三把奶棄掉，以排除一些污染的雜菌，然后以無菌操作的方法，從奶牛的每個(gè)乳室中，現(xiàn)擠5～10 mL乳汁，裝入滅菌試管或無菌小瓶?jī)?nèi)，封好蓋，標(biāo)上牛號(hào)、乳室、日期等，保存于放有冰塊的保溫箱中，24 h內(nèi)檢驗(yàn)。

1.1.2試驗(yàn)用品

（1）血瓊脂平板

血瓊脂平板用于分離培養(yǎng)葡萄球菌。由天津嘉立荷畜牧有限公司提供的綿羊，頸部靜脈采血，用無菌方法分離血液中的纖維蛋白，再以5%的比例溶于50～60 ℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂中，冷卻后置4 ℃冰箱備用。

（2）卻甫曼瓊脂培養(yǎng)基

卻甫曼瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)含7.5%NaCl，以抑制葡萄球菌以外的其它細(xì)菌生長(zhǎng)，用于選擇分離葡萄球菌。

（3）營(yíng)養(yǎng)肉湯

營(yíng)養(yǎng)肉湯用于增菌培養(yǎng)。

（4）藥敏試紙片

丁胺卡那霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、青霉素、慶大霉素、氟哌酸、鏈霉素、恩諾沙星、四環(huán)素、氨芐西林、頭孢噻肟、克林霉素、復(fù)方新諾明12 種新藥敏紙片，均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)菌分離培養(yǎng)

將采取的乳樣置于無菌離心管中，2 000～3 000 r/min離心10 min，棄去管中上層液體，無菌吸取底部沉淀物1 mL，加入含5 mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯的玻璃管中，置于搖床上，增菌培養(yǎng)24 h；挑菌在卻甫曼瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，于37 ℃下培養(yǎng)12～24 h后，挑取典型單個(gè)菌落接種到綿羊鮮血瓊脂平板上再次培養(yǎng)12～24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，并進(jìn)行革蘭氏染色，配合顯微鏡檢查，觀察細(xì)菌形態(tài)、革蘭氏染色特點(diǎn)，挑選出單個(gè)菌落接種到卻甫曼瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)菌生化鑒定

純化培養(yǎng)后的細(xì)菌進(jìn)行觸酶試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、凝固酶試驗(yàn)、麥芽糖發(fā)酵、甘露醇以及七葉苷水解試驗(yàn)，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［7］進(jìn)行鑒定。

1.2.3藥敏試驗(yàn)

（1）在良好的光線下，以有黑字的白紙為背景，將培養(yǎng)液（菌懸液）與硫酸鋇標(biāo)準(zhǔn)管進(jìn)行比濁，調(diào)整渾濁度至硫酸鋇標(biāo)準(zhǔn)管相同濃度。如細(xì)菌濃度過高，用滅菌生理鹽水稀釋培養(yǎng)液。

（2）將溶化好的M-H瓊脂傾注直徑90 mm的平皿，制成厚3～4 mm的M-H瓊脂平板。

（3）用滅菌棉拭子蘸取上述濃度的菌懸液，在管內(nèi)壁將多余菌液擠去，在瓊脂平板表面涂布接種3 次，每次旋轉(zhuǎn)60°，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周，使菌液均勻涂滿整個(gè)瓊脂平板表面，蓋好平皿，在室溫下干燥5 min，待平板表面稍干即可放置藥敏片。

（4）用滅菌鑷子以無菌操作，夾住藥敏片邊緣取出，緊貼在涂有細(xì)菌的平板培養(yǎng)基表面。貼藥敏片時(shí)要輕輕按壓，以保證與培養(yǎng)基密切接觸。將平皿置于35～37 ℃溫箱中培養(yǎng)12～24 h，觀察結(jié)果。

圖1　葡萄球菌在血瓊脂平板上的菌落特征

圖2　葡萄球菌在卻甫曼瓊脂培養(yǎng)基上的菌落特征

圖3　葡萄球菌純培養(yǎng)物涂片革蘭氏染色陽性

2　結(jié)果

2.1葡萄球菌的分離與鑒定

葡萄球菌在普通營(yíng)養(yǎng)肉湯中迅速生長(zhǎng)，渾濁率高，管底部有沉淀；在血瓊脂平板上生長(zhǎng)良好，呈圓形或橢圓形，多成簇，也有成對(duì)和單個(gè)者，菌落直徑1.5～2.0 mm，有的菌落呈米黃或金黃色，有的菌落呈乳白或灰白色，均不透明，表面光滑，邊緣整齊（圖1）；在卻甫曼瓊脂培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)初期基本和在血瓊脂平板上的狀態(tài)一樣，3 天后，葡萄球菌呈圓形、黃玉米色、邊緣整齊的小菌落（圖2）。純化后的細(xì)菌革蘭氏染色后鏡檢顯陽性，呈圓形，以單個(gè)或短鏈狀、葡萄串狀排列（圖3）。

2.2葡萄球菌的生化鑒定

表1列出了2 種葡萄球菌的生化鑒定結(jié)果，觸酶試驗(yàn)呈陽性，β溶血，凝固酶陽性，麥芽糖陽性，甘露醇陽性，七葉苷水解試驗(yàn)陰性，判斷為金黃色葡萄球菌；觸酶試驗(yàn)呈陽性，γ溶血，凝固酶陰性，麥芽糖陰性，甘露醇陰性，七葉苷水解試驗(yàn)陰性，判斷為表皮葡萄球菌。

2.3天津地區(qū)葡萄球菌檢出率

天津市3 個(gè)區(qū)縣9 個(gè)奶牛場(chǎng)199份奶樣中共檢出葡萄球菌53 株，其中金黃色葡萄球菌40 株，表皮葡萄球菌13 株，具體檢出結(jié)果及檢出率見表2。

2.4藥敏試驗(yàn)

對(duì)分離鑒定出的2 種葡萄球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。從表3可以看出，頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、丁胺卡那霉素、氟哌酸、四環(huán)素對(duì)葡萄球菌均有高抑制性；氨卞西林、慶大霉素、克林霉素和復(fù)方新諾明對(duì)葡萄球菌有抑制作用；葡萄球菌對(duì)青霉素、鏈霉素以及紅霉素基本耐藥。

表1　葡萄球菌生化鑒定結(jié)果

表2　葡萄球菌檢出數(shù)量及檢出率

表3　葡萄球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果　　　　　　　　　　　　　單位：mm

3　討論

3.1葡萄球菌的分離鑒定

本試驗(yàn)中，采集的199 份奶樣中，共檢出葡萄球菌53 株，這與馬保臣報(bào)道的泌乳期臨床型乳腺炎病原菌以凝固酶陰性葡萄球菌為主［8］，周慶國(guó)報(bào)道的佛山地區(qū)4 個(gè)奶牛場(chǎng)中的奶牛臨床型乳房炎主要由鏈球菌、葡萄球菌和大腸桿菌感染而引起［9］基本相符。

從引起奶牛乳房炎病原菌的檢出率分析，本試驗(yàn)中金黃色葡萄球菌檢出率為20.10%，表皮葡萄球菌檢出率為6.53%，這與張中文報(bào)道的臨床型乳房炎北京部分地區(qū)葡萄球菌占23.81%［10］，殷波報(bào)道的四川某奶牛場(chǎng)臨床型乳房炎的病原菌檢出率金黃色葡萄球菌23.3%、表皮葡萄球菌3.3%［11］，袁永隆報(bào)道的臨床型乳房炎中葡萄球菌占17.14%［12］基本一致，但不同地區(qū)學(xué)者們檢測(cè)出引起奶牛乳房炎的葡萄球菌的檢出率存在細(xì)微差別。

3.2葡萄球菌的藥敏試驗(yàn)

從上述試驗(yàn)結(jié)果可知，引起天津地區(qū)奶牛乳房炎的葡萄球菌對(duì)頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、丁胺卡那霉素高度敏感，為了有效控制此種病原菌引起的奶牛乳房炎，以上4 種抗生素為首選藥物。本試驗(yàn)研究結(jié)果與王登輝報(bào)道的乳樣中分離出的金黃色葡萄球菌對(duì)頭孢和環(huán)丙沙星敏感［13］相一致，與馬曉艷等研究金黃色葡萄球菌對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星高度敏感結(jié)果［14］也相吻合，但與李飛等研究表明金黃色葡萄球菌對(duì)復(fù)方新諾明耐藥率在80%以上的結(jié)果［15］稍有差異。

4　結(jié)論

天津地區(qū)采集的199 份奶牛乳房炎樣品中共檢出葡萄球菌53株，其中金黃色葡萄球菌40 株、表皮葡萄球菌13 株；藥敏試驗(yàn)表明葡萄球菌對(duì)頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、丁胺卡那霉素高度敏感。C

［1］ 齊長(zhǎng)明，奶牛疾病學(xué).北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2006.

［2］ 丁恩雨，陳世荃，廖延雄. 葡萄球菌、鏈球菌與奶牛乳房炎的關(guān)系及對(duì)抗菌素敏感性研究.中國(guó)獸醫(yī)科技，1992，22（12）：11-13.

［3］ 袁永隆，張永欣，侯奕昭. 奶牛乳房炎乳汁的細(xì)菌分離和鑒定程序. 中國(guó)獸醫(yī)科技，1991，12（2）：7-10.

［4］ 劉德義，陳永生. 某奶牛場(chǎng)爆發(fā)乳房炎的病因研究. 畜牧與獸醫(yī)，1998，30（6）：263.

［5］ Dijkhuizen A A，Renkema J A. Economic aspects of mastitis control in the Netherlands. 29th Annu meet of EAAP，1978.

［6］ 孫雷，賈偉新，梁梓森. 防治奶牛乳房炎的用藥探討. 中國(guó)奶牛，2002（6）：39-41.

［7］ 東秀珠，蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)（第2版）. 北京：科學(xué)出版社，2001.

［8］ 馬保臣，牛家華，高玉君，等. 奶牛乳腺炎的細(xì)菌學(xué)研究. 家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2005，26（6）：37-39.

［9］ 周慶國(guó)，黎杰虹，陳晉城，等. 佛山地區(qū)奶牛臨床型乳房炎發(fā)病情況調(diào)查及病原分離與鑒定. 中國(guó)奶牛，2002（3）：33-35.

［10］ 張中文，吳國(guó)娟，劉鳳華，等. 北京地區(qū)奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn). 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，17（4）：42-47.

［11］ 殷波，熊焰，高新山，等. 臨床型奶牛乳房炎病原菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn). 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2006（2）：61-62.

［12］ 袁永隆，張禮華，劉純傳，等. 我國(guó)奶牛乳房炎常見病原菌的區(qū)系調(diào)查. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1992，25（4）：70.

［13］ 王登峰，李建軍，段新華，等. 我國(guó)牛源金黃色葡萄球菌耐藥現(xiàn)狀及藥敏檢測(cè)方法探討.中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2011，19（1）：31-38.

［14］ 馬曉艷，姚剛，黃燕，等. 新疆某地奶牛隱性乳房炎病原分離鑒定及藥敏試驗(yàn). 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30（1）：64-67.

［15］ 李飛，王禮偉，屈勇剛，等. 新疆石河子地區(qū)奶牛乳房炎源金黃色葡萄球菌的分離鑒定及耐藥性分析. 中國(guó)奶牛，2014（16）：26-28.

馬騰宇（1984-），男，碩士研究生，獸醫(yī)師，研究方向?yàn)榛A(chǔ)獸醫(yī)學(xué)。

2016-05-16）