康玉軍，楊姣姣，茍彥龍，鄭登杰，林光祿，張雪

（甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，甘肅蘭州 730070）

鰻弧菌滅活疫苗對雜交鱘的免疫效果初探

康玉軍，楊姣姣，茍彥龍，鄭登杰，林光祿，張雪

（甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，甘肅蘭州 730070）

以0.5%的甲醛溶液為滅活劑，制備鰻弧菌滅活疫苗，經(jīng)過無菌和安全試驗后，按照2 mL/尾的劑量，通過腹腔注射途徑注射濃度為1.78×108cfu/mL的鰻弧菌滅活疫苗對雜交鱘進行免疫；對照組用同等劑量生理鹽水處理。免疫7 d后，對試驗魚進行鰻弧菌活菌攻毒。攻毒試驗7 d后，計算疫苗的免疫保護率。結(jié)果表明，在實驗室條件下，0.5%甲醛滅活的鰻弧菌疫苗對雜交鱘安全，免疫保護率為80%。

鰻弧菌；滅活疫苗；雜交鱘；免疫效果

鱘魚，隸屬于硬骨魚綱（Osteichthyes）輻鰭亞綱（Actinopterygii）軟骨硬鱗總目（Chondrostei）鱘形目（Acipenseriformes），是現(xiàn)存的古老生物種群，廣泛分布于北半球。鱘魚肉味鮮美營養(yǎng)價值極高，肉和卵的蛋白含量高達18%和29%。鱘魚子醬作為高級營養(yǎng)品，更是素有水中“黑黃金”之稱。

隨著集約化、高密度養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，鱘魚養(yǎng)殖生產(chǎn)中細菌性病害問題日益突出，為鱘魚的養(yǎng)殖造成巨大的經(jīng)濟損失，嚴重影響了鱘魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。針對魚類細菌性疾病，長期以來，生產(chǎn)實踐中多采用廣譜抗生素和化學藥物進行防治，致使病原菌的抗藥性增加，且藥物殘留對養(yǎng)殖水域生態(tài)環(huán)境的污染日益嚴重，另外，水產(chǎn)品中藥物殘留還會對人體構(gòu)成潛在的威脅。隨著人們對抗菌素等藥物使用的安全性日益重視，認識已從以前的“靶動物安全”到“人類食品安全”和“環(huán)境安全”。因此開發(fā)預(yù)防水產(chǎn)病害的相關(guān)疫苗，對于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和水產(chǎn)品安全具有十分重要的意義。鰻弧菌（Vibrioanguillarum）是一種對水產(chǎn)魚類危害嚴重的細菌病原，其流行區(qū)域廣泛，能引起世界范圍內(nèi)的淡、海水魚類及其他養(yǎng)殖動物發(fā)生弧菌病，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。目前，已有學者研究報道了鰻弧菌疫苗接種牙鲆、大菱鲆及鱸魚等的免疫效果研究，而鰻弧菌疫苗免疫鱘魚方面的研究和應(yīng)用則未見報道。

本研究以雜交鱘為免疫對象采用鰻弧菌甲醛滅活全菌疫苗，通過腹腔注射進行免疫接種，對其免疫安全性進行了評價，并考察了疫苗接種后的免疫保護率，為鰻弧菌滅活疫苗在鱘魚養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗用魚試驗用雜交鱘購自甘肅省蘭州市綠色市場，平均體長30 cm，平均體重500 g。實驗開始前在甘肅農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)實驗室循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)暫養(yǎng)7 d。

1.1.2試驗用水曝氣3 d的蘭州城市自來水。pH值為6.5～7，DO值為6～7 mg/L，水溫通過循環(huán)冷暖水機控制在18℃左右。

1.1.3試驗用菌株試驗用鰻弧菌（ATCC 43305）菌株取自西北農(nóng)林科技大學魚病學實驗室。

1.2試驗菌株對雜交鱘的致病性驗證

隨機取暫養(yǎng)的雜交鱘9尾，平均分為Z1、Z2、Z3三組。將鰻弧菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)24 h后測定菌液濃度并用無菌生理鹽水將菌液分別稀釋成107cfu/mL和108cfu/mL。對Z1、Z2、Z3三組的試驗用魚分別腹腔注射2 mL/尾的無菌生理鹽水、107cfu/mL的菌懸液和108cfu/mL的菌懸液。其他條件與暫養(yǎng)期間保持相同，連續(xù)飼養(yǎng)觀察7 d，每天觀察記錄試驗魚的發(fā)病及死亡情況。

1.3滅活疫苗的制備

1.3.1菌種的復(fù)壯和擴大培養(yǎng)細菌的復(fù)壯：先將固體培養(yǎng)基上的鰻弧菌接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，之后再于肉湯培養(yǎng)基中連續(xù)接種培養(yǎng)3次，達到復(fù)壯效果。

菌種擴大培養(yǎng)：將復(fù)壯的鰻弧菌接種到500 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在28℃恒溫培養(yǎng)24 h。之后，再于5 L營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)中繼續(xù)接種培養(yǎng)24 h，使其種群擴大以獲得一定數(shù)量的菌種，滅活疫苗制備做好準備工作。

1.3.2鰻弧菌滅活擴大培養(yǎng)的鰻弧菌菌懸液中接種在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24 h后加入終濃度0.5%的甲醛28℃滅活48 h，制得鰻弧菌滅活疫苗。4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3疫苗的無菌檢驗取上述已制備的0.1 mL鰻弧菌滅活疫苗在普通瓊脂平板上涂布，重復(fù)3個平板，在28℃條件下培養(yǎng)48 h后觀察是否有菌落生長。

1.4疫苗的安全性試驗

隨機取暫養(yǎng)雜交鱘6尾，平均分為A1、A2兩組。按照2 mL/尾的劑量，對A1、A2兩組試驗魚分別腹腔注射無菌生理鹽水和制備好的滅活疫苗，然后在保持正常飼養(yǎng)條件7 d，觀察記錄魚的活動及有無發(fā)病情況。

1.5疫苗的免疫效果試驗

隨機取暫養(yǎng)雜交鱘10尾，分為試驗組和對照組，每組5尾魚。對于試驗組，按照2 mL/尾的劑量，通過腹腔注射途徑注射濃度為1.78×108cfu/mL的鰻弧菌滅活疫苗對雜交鱘進行免疫；對照組用同等劑量生理鹽水處理。免疫7 d后，試驗組和對照組的試驗魚，按照2 mL/尾的劑量，同時腹腔注射1.56×108cfu/mL的鰻弧菌菌懸液進行攻毒。注射后7 d內(nèi)，統(tǒng)計實驗組和對照組的發(fā)病率，計算疫苗的免疫保護率。

免疫保護率=（對照組發(fā)病率-實驗組發(fā)病率）/對照組發(fā)病率×100%。

2　結(jié)果

2.1試驗用鰻弧菌對雜交鱘的致病性

由表1結(jié)果可知，鰻弧菌對雜交鱘成魚都表現(xiàn)出較強的致病性，試驗魚在人工感染后的3～4 d內(nèi)發(fā)?。ê笃诰劳觯◆~鰭條基部充血、尾鰭腐爛，內(nèi)部癥狀以肝臟壞死為主要特征，常見腹水。當感染劑量為1.78×107cfu/mL以上時，魚的致病率達到100%。

表1　鰻弧菌對雜交鱘的人工感染結(jié)果

表2　鰻弧菌滅活疫苗安全性試驗結(jié)果

2.2疫苗安全性試驗

制備好的0.5%的甲醛滅活疫苗鰻弧菌疫苗在普通瓊脂平板上涂布培養(yǎng)24 h后，3個平板上均無菌落生長，可認為細菌全部滅活。對雜交鱘進行腹腔注射滅活疫苗7 d后沒有出現(xiàn)發(fā)病情況，且活動正常，說明0.5%甲醛滅活的疫苗對試驗魚安全（見表2）。

2.3疫苗的免疫保護率

0.5%甲醛滅活鰻弧菌疫苗免疫試驗用雜交鱘的免疫效果結(jié)果如表3所示。疫苗免疫7 d后，以鰻弧菌菌懸液腹腔注射對供試魚進行攻毒。結(jié)果顯示，對照組試驗魚在攻毒后的3～4 d后發(fā)病或死亡，發(fā)病（死亡）率為100%，病魚鰭條基部充血、尾鰭腐爛，內(nèi)部癥狀以肝臟壞死為主要特征，多見腹水；而試驗組只有20%的發(fā)病率，免疫保護率為80%。試驗結(jié)果表明該疫苗具有較好的免疫效果。

表3　鰻弧菌滅活疫苗免疫效果

3　討論

本研究中，鰻弧菌滅活疫苗制備完成之后，采取了注射接種的方式對雜交鱘進行了免疫，結(jié)果顯示具有較好的免疫效果，而疫苗的浸泡免疫效果如何尚未在本研究中涉及。眾所周知，注射免疫是效果最好的接種方式，能有效地刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。注射免疫有用量少、免疫效果好等特點；但是，由于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物生活在水體環(huán)境中，對每一個對象逐一進行注射免疫，工作量大、操作要求高，尤其對于魚種的接種，可行性差。所以，在基于注射免疫效果顯著的前提下，下一步很有必要就鰻弧菌滅活疫苗在不同接種方式下對雜交鱘的免疫效果進行比較試驗，優(yōu)化免疫程序和方法，提高疫苗的適用性。

本研究在制備鰻弧菌滅活疫苗時，采用的滅活劑是0.5%的甲醛溶液。甲醛作為動物疫苗滅活劑在國內(nèi)使用較為普遍，也較為經(jīng)濟、易得，但同時也存在病原體蛋白的抗原性會遭到嚴重破壞，并可能有病原體存活的不足。β-丙內(nèi)酯在國外已廣泛用于各種疫苗的滅活，與甲醛相比，其價格較為昂貴，但β-丙內(nèi)酯主要作用于病原體DNA或RNA，通過改變病原體核酸結(jié)構(gòu)達到滅活目的，不直接作用于蛋白，不破壞病原體的免疫原性；同時，β-丙內(nèi)酯病原時間短，從而可以顯著縮短疫苗生產(chǎn)周期，提高經(jīng)濟效益。故而進一步的研究有必要對于不同滅活劑對疫苗免疫效果、經(jīng)濟效益等方面的影響進行綜合評價。

水產(chǎn)疫苗早已經(jīng)被業(yè)界公認為是水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的最佳防控措施之一，我國水產(chǎn)疫苗的研究開始于20世紀60年代，但是相對于我國水產(chǎn)養(yǎng)殖大國的地位來說其發(fā)展卻是非常緩慢的。一方面，由于養(yǎng)殖和疾病防治觀念落后，在魚病防治的生產(chǎn)實踐中，化學藥物的使用遠遠超過了疫苗；另一方面，我國水產(chǎn)疫苗研究相對滯后，到目前為止我國僅有草魚出血病活疫苗、草魚出血病細胞滅活疫苗、魚嗜水氣單胞菌敗血癥滅活疫苗和牙鲆溶藻弧菌/鰻弧菌/遲緩愛德華菌多聯(lián)抗獨特型抗體疫苗等4種疫苗獲得國家新獸藥證書，其中獲得生產(chǎn)批文的水產(chǎn)疫苗僅有草魚出血病活疫苗與嗜水氣單胞菌滅活疫苗兩種。而其他多數(shù)產(chǎn)品，仍處于中試或者區(qū)域性試驗階段。據(jù)不完全統(tǒng)計，目前國際上已有針對20多種水產(chǎn)病原的100多種魚類疫苗被批準上市，對比國外的情況，我國水產(chǎn)疫苗研發(fā)還有很大差距。此外，還需要指出的一點是，無論何種疫苗，從研發(fā)到推廣應(yīng)用，從實驗室階段到中試再到轉(zhuǎn)化投產(chǎn)，都需要經(jīng)過嚴格而科學地論證，切忌急功近利，匆匆上馬?？偟膩碇v，我國水產(chǎn)疫苗研發(fā)和推廣應(yīng)用工作都可謂任重而道遠。

（編輯：晏兵兵）

S943

B

1006-799X（2016）17-0126-03

甘肅農(nóng)業(yè)大學學生科研訓練計劃（SRTP）項目（20150416）

康玉軍（1988-），男，甘肅張掖人，助教，主要研究方向為水產(chǎn)養(yǎng)殖生物學與病害防治。