盛賢均，郭成華，賀永建

（1.重慶市榮昌區(qū)古昌鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，重慶榮昌 402460；

2.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶榮昌 402460）

犬腹瀉性疾病的細(xì)菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

盛賢均1，郭成華1，賀永建2

（1.重慶市榮昌區(qū)古昌鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，重慶榮昌 402460；

2.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶榮昌 402460）

通過(guò)對(duì)病犬不同類型腹瀉病糞便中細(xì)菌的分離、鑒定，并分別進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以健康犬作為對(duì)照，找出引起犬發(fā)生腹瀉的細(xì)菌性原因，針對(duì)不同類型腹瀉疾病篩選出最敏感的藥物。結(jié)果表明犬腹瀉性疾病的常見(jiàn)致病菌為大腸桿菌、沙門氏菌、耶爾森菌、變形桿菌，丙氟哌酸、頭孢氨噻肟、慶大霉素、鏈霉素對(duì)上述病菌的作用效果較好。

犬；腹瀉疾??；細(xì)菌；分離；鑒定；藥敏試驗(yàn)

隨著人民生活水平的提高，人們對(duì)寵物的飼養(yǎng)量也日益增加，而在眾多的寵物當(dāng)中，犬無(wú)疑是最受歡迎的。此外，因?yàn)楣啡鉅I(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美，并有強(qiáng)身祛病之功效，自古以來(lái)為廣大群眾所喜愛(ài)。近年來(lái)隨著肉用犬需求量的不斷增加，全國(guó)范圍內(nèi)的肉犬飼養(yǎng)熱持續(xù)不降，規(guī)模飼養(yǎng)前景看好。但是，一些犬類疾病尤其是犬腹瀉病，如寵物犬節(jié)日期間因暴飲暴食而引起的消化不良、胃腸炎的病例明顯增多，犬瘟熱、細(xì)小病毒、冠狀病毒等病毒性因素所引起的病犬腹瀉病，犬大腸桿菌、副傷寒桿菌等所致的細(xì)菌性腹瀉病等在養(yǎng)犬生產(chǎn)中頻繁發(fā)生，導(dǎo)致大量病犬死亡，嚴(yán)重威脅著我國(guó)養(yǎng)犬業(yè)的健康發(fā)展。

犬腹瀉是指病犬排糞時(shí)，出現(xiàn)排糞次數(shù)多，糞中水含量大，有時(shí)混有血液，糞便數(shù)量增多的一種疾病。它是犬發(fā)病過(guò)程中的一種常見(jiàn)癥狀，其病因復(fù)雜，臨床上很多疾病都會(huì)導(dǎo)致腹瀉。腹瀉對(duì)機(jī)體影響很大，可引起營(yíng)養(yǎng)不良，維生素缺乏，貧血，降低身體的抵抗力，引起脫水，喪失大量的電解質(zhì)，如鈉、鉀、鈣及鎂等，最終出現(xiàn)電解質(zhì)紊亂、酸堿中毒，甚至引起死亡［1］。這類病的發(fā)生不分季節(jié)、地區(qū)、年齡，但在養(yǎng)犬生產(chǎn)中犬腹瀉多發(fā)于幼年犬只。然而，在犬腹瀉病的臨床治療中出現(xiàn)了許多治療無(wú)效或效果很差的現(xiàn)象，主要原因可能與細(xì)菌的耐藥性產(chǎn)生有關(guān)。

本研究擬通過(guò)對(duì)患有不同類型腹瀉性疾病的犬糞便中細(xì)菌進(jìn)行分離、鑒定，并分別進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以健康犬作為對(duì)照，找出引起病犬發(fā)生腹瀉的細(xì)菌性原因，針對(duì)不同類型腹瀉疾病篩選出最敏感的藥物，以期為犬腹瀉性疾病的臨床用藥，提高臨床療效，避免臨床更多耐藥菌株的產(chǎn)生，提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1培養(yǎng)基SS瓊脂平板，普通瓊脂平板，麥康凱瓊脂平板，營(yíng)養(yǎng)肉湯，三糖鐵斜面培養(yǎng)基，半固體瓊脂培養(yǎng)基，葡萄糖蛋白胨水溶液，Dumham氏蛋白胨水溶液，各種培養(yǎng)基均為自制，均按文獻(xiàn)［2］方法配制。

1.1.2主要藥品及試劑葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖微量發(fā)酵管，Simmon氏枸櫞酸鈉微量發(fā)酵管，藥敏紙片（由杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)），吲哚試劑，甲基紅試劑。

1.1.3主要實(shí)驗(yàn)器材OLYMBUS顯微鏡（日本OLYMPUS），電子天平（上海海康電子儀器廠），超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司制造），可調(diào)式移液槍（熱電（上海）儀器有限公司），隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱（成都電熱儀器廠），Electrolux牌冰箱（上海伊萊克斯實(shí)業(yè)有限公司），天平，滅菌鍋，培養(yǎng)皿等。

1.1.4病料來(lái)源由榮昌地區(qū)獸醫(yī)門診提供。

1.1.5實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康50日齡本地犬25只，購(gòu)于重慶市榮昌區(qū)昌元街道附近農(nóng)戶。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1癥型分類及病料采集

1.2.1.1根據(jù)糞便性狀不同分類

出血性腹瀉型：病犬排糞次數(shù)增加，糞便呈泥狀，糞便呈黑色或黑綠色時(shí)為小腸出血，糞便表面有血絲或鮮血為大腸出血，有的糞便上有大量偽膜，呈醬油色（番茄汁狀）、帶有腥臭氣味，滿足此條件歸為出血性腹瀉型，此癥型共采10個(gè)樣。

非出血性腹瀉型：病犬排糞次數(shù)增多，糞便呈稀粥狀，呈黃色或黃綠色，常為急性水樣下痢，有時(shí)糞便中有氣泡，糞便中無(wú)出血現(xiàn)象，也不見(jiàn)未消化的食物成分，可見(jiàn)于多種病因，滿足此條件歸為非出血性腹瀉型，此癥型共采10個(gè)樣。

消化不良性腹瀉型疾?。喝募S便中會(huì)有少量的植物細(xì)胞、未消化的飼料顆粒、肌肉纖維，如果這些成分大量存在且排糞次數(shù)增多，糞便酸臭，說(shuō)明犬食量過(guò)多、消化不良、腸蠕動(dòng)過(guò)速，食物未被充分消化即被排出，滿足此條件歸為消化不良性腹瀉型，此癥型共采10個(gè)樣。

1.2.1.2病料的采集采取出現(xiàn)腹瀉性疾病病犬的糞便（稀糞、血便、含未消化的飼料顆粒的稀糞），先用酒精消毒肛門周圍，用無(wú)菌棉簽在直腸內(nèi)取適量病料置于無(wú)菌試管中，酒精燈灼燒試管口，封閉管口，立即用營(yíng)養(yǎng)肉湯增菌，放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，菌液備用。

1.2.2細(xì)菌分離、鑒別培養(yǎng)取出肉湯觀察管底有無(wú)沉淀，是否渾濁，有無(wú)菌環(huán)和菌膜。取菌液劃線接種于普通瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。取在普通瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較好的單個(gè)菌落接種到鑒別培養(yǎng)基（SS瓊脂培養(yǎng)基，麥康凱培養(yǎng)基）中37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落的顏色、形態(tài)特征，在鑒別培養(yǎng)基中鉤取生長(zhǎng)較好的單個(gè)菌落接種到普通無(wú)菌肉湯中37℃恒溫培養(yǎng)24 h，即純培養(yǎng)物增菌培養(yǎng)，菌液備用。

1.2.3染色鏡檢挑選上述培養(yǎng)基中的單個(gè)菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，然后用光學(xué)顯微鏡（10×100）觀察菌落形態(tài)［3］。

1.2.4生化鑒定

1.2.4.1三糖鐵培養(yǎng)基把純培養(yǎng)物接種到三糖鐵斜面培養(yǎng)基，接種時(shí)先涂布斜面再穿刺底層，37℃下恒溫培養(yǎng)24h，觀察培養(yǎng)基變化，觀察斜面和底層的顏色變化和產(chǎn)氣情況，凡培養(yǎng)基變?yōu)辄S色者，表示產(chǎn)酸；凡培養(yǎng)基變黃并含氣泡者，為產(chǎn)酸產(chǎn)氣；凡培養(yǎng)基變?yōu)榧t色者，表示產(chǎn)堿；凡培養(yǎng)基不變色者，表示該菌不發(fā)酵此培養(yǎng)基［4］。

1.2.4.2糖發(fā)酵把純培養(yǎng)物分別接種到葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖的微量發(fā)酵管中，37℃下恒溫培養(yǎng)24h，觀察產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況。凡培養(yǎng)基變?yōu)辄S色者，表示該菌發(fā)酵此糖產(chǎn)酸；凡培養(yǎng)基變黃并含氣泡者，為發(fā)酵此糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣；凡培養(yǎng)基變?yōu)榧t色者，表示該菌發(fā)酵此糖產(chǎn)堿；凡培養(yǎng)基不變色者，表示該菌不發(fā)酵此糖［5］。

1.2.4.3甲基紅（MR）試驗(yàn)取純培養(yǎng)物，接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)48～72 h，取出后加甲基紅試劑3～5滴，凡培養(yǎng)液呈紅色者為陽(yáng)性，以“+”表示；橙色者為可疑，以“±”表示；黃色者為陰性，以“-”表示。

1.2.4.4吲哚（靛基質(zhì)）試驗(yàn)以接種環(huán)將純培養(yǎng)物接種于Dunham氏蛋白胨水溶液中，置37℃培養(yǎng)24～48 h（可延長(zhǎng)4～5 d）；取蛋白胨水培養(yǎng)管先加乙醚少量，塞緊棉塞搖振試管，使乙醚與培養(yǎng)液充分混勻，靜置片刻，待乙醚浮于液面上層時(shí)，沿管壁加入吲哚試劑2～3滴。凡在乙醚層內(nèi)出現(xiàn)玫瑰紅者為陽(yáng)性反應(yīng)，不變色為陰性反應(yīng)［6］。

1.2.4.5枸櫞酸鹽利用取純培養(yǎng)物接種于枸櫞酸鈉微量發(fā)酵管中，置37℃培養(yǎng)48～72 h，觀察是否有細(xì)菌生長(zhǎng)，并觀察其顏色變化。凡有細(xì)菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)基變?yōu)樯钏{(lán)色者，為該菌利用枸櫞酸鹽，否則為陰性反應(yīng)。

1.2.4.6運(yùn)動(dòng)力把純培養(yǎng)物穿刺接種于半固體培養(yǎng)基，穿刺線應(yīng)在培養(yǎng)基中央，一直刺到管底，拔出穿刺針時(shí)應(yīng)順原穿刺線取出，切不可左右滑動(dòng)，以免影響觀察結(jié)果。37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察半固體瓊脂培養(yǎng)管，凡細(xì)菌有鞭毛能運(yùn)動(dòng)者，則部分或全部半固體瓊脂變混濁，凡不運(yùn)動(dòng)者細(xì)菌僅在穿刺線上生長(zhǎng)，穿刺線外圍培養(yǎng)基仍然透明。

1.2.5動(dòng)物復(fù)歸試驗(yàn)將25只健康50日齡本地犬隨機(jī)分為5組，每組5只，其中4個(gè)組為試驗(yàn)組，1個(gè)組為對(duì)照組。將所分離到的4種細(xì)菌制成含活菌菌液，活菌數(shù)為1.5×107。試驗(yàn)組每犬各皮下注射一種菌液2 mL，對(duì)照組各皮下注射無(wú)菌蒸餾水2 mL。注射菌液后，注意觀察犬只的臨床癥狀，每天為其測(cè)量體溫、呼吸、脈搏并記錄，出現(xiàn)腹瀉癥狀后注意觀察并記錄糞便性狀。

1.2.6藥敏試驗(yàn)采用藥敏試紙擴(kuò)散法，即將分離菌的純培養(yǎng)物分別均勻涂抹在普通瓊脂培養(yǎng)基上，靜置5 min后貼上藥敏試紙片。置37℃恒溫箱中培養(yǎng)反應(yīng)24 h，測(cè)量藥敏試紙片抑菌圈的直徑并判定其敏感性［7］。

2　試驗(yàn)結(jié)果

2.1細(xì)菌鑒別培養(yǎng)及鏡檢結(jié)果

圖1　大腸桿菌的麥康凱培養(yǎng)基

圖2　沙門氏菌的SS瓊脂培養(yǎng)基

圖3　大腸桿菌

圖4　沙門氏菌

2.2生化試驗(yàn)結(jié)果，見(jiàn)表1

表1　各菌種生化鑒別結(jié)果

由表1可知，分離出的細(xì)菌經(jīng)三糖鐵試驗(yàn)產(chǎn)酸，葡萄糖、乳糖、麥芽糖及甘露糖發(fā)酵試驗(yàn)呈陽(yáng)性，甲基紅、吲哚試驗(yàn)及運(yùn)動(dòng)力試驗(yàn)呈陽(yáng)性，說(shuō)明該菌為大腸桿菌；分離出的細(xì)菌經(jīng)三糖鐵試驗(yàn)斜面產(chǎn)堿、底面產(chǎn)酸，葡萄糖、麥芽糖及甘露糖發(fā)酵試驗(yàn)呈陽(yáng)性，甲基紅、枸櫞酸試驗(yàn)及運(yùn)動(dòng)力試驗(yàn)呈陽(yáng)性，說(shuō)明該菌為沙門氏菌；分離出的細(xì)菌經(jīng)三糖鐵試驗(yàn)產(chǎn)酸，硫化氫試驗(yàn)陽(yáng)性，麥芽糖及甘露糖發(fā)酵試驗(yàn)呈陽(yáng)性，甲基紅及運(yùn)動(dòng)力試驗(yàn)呈陽(yáng)性，說(shuō)明該菌為變形桿菌；分離出的細(xì)菌經(jīng)三糖鐵試驗(yàn)產(chǎn)酸，麥芽糖、蔗糖及甘露糖發(fā)酵試驗(yàn)呈陽(yáng)性，甲基紅試驗(yàn)呈陽(yáng)性，說(shuō)明該菌為耶爾森菌。

2.3不同癥型細(xì)菌分離

通過(guò)分離鑒別從30個(gè)樣本中一共分離出四個(gè)菌種，即大腸桿菌、沙門氏菌、變形桿菌、耶爾森菌，分離結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　不同癥型細(xì)菌分離結(jié)果

由上表可見(jiàn)，大腸桿菌在各種癥型中分離出的比例都很高，而在健康對(duì)照組中的比例較低，差異顯著，說(shuō)明大腸桿菌為腸道兼性致病菌之一。沙門氏菌在出血性腹瀉型和非出血性腹瀉型中所占比例較高，與健康對(duì)照組比較差異顯著，消化不良性腹瀉型與健康對(duì)照組差異不顯著，說(shuō)明沙門氏菌為原發(fā)性致病菌。變形桿菌在各種癥型和健康對(duì)照組中分離出的比例相當(dāng)，無(wú)顯著差異，說(shuō)明變形桿菌為腸道正常菌之一。耶爾森菌在出血性腹瀉型和非出血性腹瀉型中所占比例較高，與健康對(duì)照組差異顯著，消化不良性腹瀉型與健康對(duì)照組都沒(méi)有分離出此菌，說(shuō)明耶爾森菌為原發(fā)性致病菌。

2.4動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果觀察

試驗(yàn)組犬只36 h內(nèi)相繼出現(xiàn)相應(yīng)腹瀉癥狀，但是接種大腸桿菌和變形桿菌的試驗(yàn)組中分別有2只和1只犬未出現(xiàn)腹瀉癥狀，其余接種大腸桿菌、沙門氏菌、變形桿菌菌液試驗(yàn)組犬只出現(xiàn)不同程度腹瀉，犬只排糞次數(shù)增多，糞便呈稀粥狀，呈黃綠色，糞便中有少量氣泡，糞便中無(wú)出血現(xiàn)象，也不見(jiàn)未消化的食物成分。接種耶爾森菌菌液試驗(yàn)組犬只均出現(xiàn)腹瀉癥狀，排糞次數(shù)增加，糞便呈泥狀，糞便呈黑綠色，糞便中有少量偽膜，呈醬油色、帶有腥臭氣味。對(duì)照組的五只犬均未出現(xiàn)腹瀉癥狀。

2.5藥敏試驗(yàn)結(jié)果觀察

表3　各菌種藥敏試驗(yàn)結(jié)果

判定標(biāo)準(zhǔn)［8］：抑菌圈大于20 mm為極敏，15～20 mm為高敏，10～15 mm為中敏，小于10 mm為耐藥

圖5　耶爾森菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖6　變形桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

從表3可見(jiàn)，藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明丙氟哌酸、頭孢氨噻肟、慶大霉素、先鋒必素效果明顯，對(duì)所分離的四種病原菌均有較好的抗菌能力。阿莫西林、卡那霉素可能由于廣泛性的使用，病原菌已經(jīng)對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，故而其抗菌效果較差。

3　分析與討論

3.1腹瀉原因

腹瀉是臨床中最常見(jiàn)的犬病，也是養(yǎng)犬生產(chǎn)中犬發(fā)病后最為常見(jiàn)的癥狀之一。引起犬腹瀉的原因主要有：

3.1.1感染常由細(xì)菌感染（如致病性大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等）、病毒感染（如細(xì)小病毒、犬瘟熱病毒、冠狀病毒等）、真菌感染（如白色念珠菌、組織胞漿菌）、寄生蟲感染（如弓形體、蛔蟲等）造成［8］。當(dāng)感染時(shí)，病原體吸附于腸黏膜表面，不侵入腸黏膜。通過(guò)產(chǎn)生毒素引起腸黏膜上皮細(xì)胞變性壞死，蛋白質(zhì)、黏液滲出，同時(shí)炎癥刺激腸運(yùn)動(dòng)加快，造成腹瀉；有些病原體吸附侵入腸黏膜，并繁殖和產(chǎn)生毒素，引起腸黏膜的變性壞死，大量滲出。如痢疾桿菌、大腸桿菌等。有些病毒感染侵入小腸上皮細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)繁殖，引起上皮細(xì)胞受損脫落，導(dǎo)致吸收功能障礙，產(chǎn)生腹瀉，如細(xì)小病毒感染、冠狀病毒感染等。病原體在侵入腸黏膜細(xì)胞時(shí)還引起炎性浸潤(rùn)，這些炎性細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)［9］。引起腸黏膜的變性壞死和滲出，從而導(dǎo)致腹瀉。

3.1.2消化機(jī)能不全或吸收不良消化機(jī)能不全多見(jiàn)于斷奶仔犬。由于斷奶仔犬胃腸功能不健全，消化酶分泌不足，從吃母乳變成了以飼料為主，加上斷奶應(yīng)激，體內(nèi)酶的水平下降，影響營(yíng)養(yǎng)成分的消化和吸收，從而導(dǎo)致腹瀉。

3.1.3過(guò)食過(guò)多的食物在還未來(lái)得及消化分解就排出體外，這樣的腹瀉物中含有大量的消化不全的顆粒飼料和食糜。

3.1.4胃腸道菌群失調(diào)性腹瀉正常情況下，胃腸道處于有益菌和有害菌相對(duì)平衡的狀態(tài)之中。長(zhǎng)期大量使用抗生素，造成機(jī)體菌群失調(diào)，平衡被打破，容易發(fā)生腹瀉［10］。

3.2引起腹瀉常見(jiàn)菌種分析

本研究通過(guò)對(duì)3種不同類型的腹瀉病犬糞便中的細(xì)菌進(jìn)行分離、染色鏡檢、培養(yǎng)特性鑒定及生化試驗(yàn)分析，結(jié)果分離到的細(xì)菌有大腸桿菌、沙門氏菌、變形桿菌、耶爾森菌。其中沙門氏菌、耶爾森菌為原發(fā)性致病菌，大腸桿菌、變形桿菌為犬消化道正常菌群中常在菌。原發(fā)性致病菌毒力較強(qiáng)，發(fā)生消化道感染時(shí)多以原發(fā)性致病菌為主；當(dāng)犬機(jī)體某些條件發(fā)生改變時(shí)，也可引起正常菌群中的條件性致病菌感染消化道［11-13］。試驗(yàn)組分離到的這4種細(xì)菌，均為革蘭氏陰性菌。據(jù)此可知，引起犬消化道感染的病原菌中以革蘭氏陰性菌為主。

當(dāng)然，引起犬腹瀉的病原菌還比較多，比較常見(jiàn)的還有金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌等，但在本次實(shí)驗(yàn)中均未曾分離到。其原因有待進(jìn)一步探討。

動(dòng)物復(fù)歸試驗(yàn)結(jié)果表明：由于大腸桿菌和變形桿菌均為腸道正常菌之一，但此次分離出的大腸桿菌和變形桿菌使試驗(yàn)組中大部分犬只出現(xiàn)腹瀉癥狀，說(shuō)明此次分離出的大腸桿菌和變形桿菌均有致病性，為腸道兼性致病菌之一；接種沙門氏菌和耶爾森菌菌液的試驗(yàn)組中的犬只均出現(xiàn)腹瀉癥狀，說(shuō)明沙門氏菌和耶爾森菌為原發(fā)性致病菌。

3.3藥敏試驗(yàn)分析

藥敏試驗(yàn)中，丙氟哌酸、頭孢氨噻肟、慶大霉素、先鋒必素效果明顯，對(duì)所分離的五種病原菌均有較好的抗菌能力。阿莫西林、卡那霉素可能由于廣泛性的使用，病原菌已經(jīng)對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，故而其抗菌效果較差。大腸桿菌感染，可能是原發(fā)病因，也可能是由其他病因繼發(fā)大腸桿菌感染［14］。在選用抗生素時(shí)不但要考慮其抗菌效果，而且還應(yīng)考慮其副作用。若其中1種抗生素可以達(dá)到治療效果，應(yīng)避免同時(shí)使用2種或2種以上抗生素。

4　結(jié)論

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，大腸桿菌和變形桿菌均為犬腹瀉性疾病的兼性致病菌，沙門氏菌和耶爾森菌均為犬腹瀉性疾病的原發(fā)性致病菌。丙氟哌酸、頭孢氨噻肟、慶大霉素、先鋒必素對(duì)所分離的四種病原菌均有較好的抗菌能力。阿莫西林、卡那霉素對(duì)上述4菌的抗菌效果較差。

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（編輯：高真貞）

S858.292

B

1006-799X（2016）17-0083-05

盛賢均（1970-），男，重慶榮昌人，獸醫(yī)師，主要從事畜牧獸醫(yī)工作。