張燕琴，王世鄂

(1.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 人體解剖學(xué)教研室，福建 泉州　362010；2.福建醫(yī)科大學(xué) 解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系，福建 福州　350100)

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

ERα特異性抑制劑對KM小鼠植入前胚體外發(fā)育的影響*

張燕琴1，王世鄂2

(1.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 人體解剖學(xué)教研室，福建 泉州362010；2.福建醫(yī)科大學(xué) 解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系，福建 福州350100)

目的 探討ERα在KM小鼠植入前胚體外發(fā)育中的作用。方法 以空白M16培養(yǎng)液為對照組，觀察不同濃度的ER抑制劑(ICI182780)、ERα特異性抑制劑(MPP)、ERβ特異性抑制劑(PHTPP)和ERα特異性抗體對KM小鼠1-細(xì)胞胚體外發(fā)育至4-細(xì)胞胚和囊胚的影響。結(jié)果 與M16對照組比較，0.5和1 μmol/L 的ICI182780、10 μmol/L的MPP明顯降低4-細(xì)胞胚的發(fā)育率，導(dǎo)致囊胚發(fā)育失敗(P<0.01)；25和50 μmol/L的MPP、1 μg/mL的ERα特異性抗體將1-細(xì)胞胚阻滯在2-細(xì)胞階段，并且50 μmol/L的MPP對細(xì)胞有毒性作用(P<0.01)；0.5 μg/mL的ERα特異性抗體使細(xì)胞喪失發(fā)育至囊胚的能力(P<0.01)；各濃度的PHTPP均未被觀察到有上述作用(P>0.05)。結(jié)論 ER抑制劑、ERα特異性抑制劑和ERα特異性抗體均能抑制小鼠1-細(xì)胞胚的體外發(fā)育。

雌激素受體α；昆明小鼠；MPP；植入前胚；發(fā)育阻滯

雌激素受體α(estrogen receptor alpha，ERα)，是類固醇激素受體的一類轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞核中有賴于配體的激活, 對雌激素誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、分化和發(fā)育具有調(diào)節(jié)作用，對與生長、發(fā)育和穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境相關(guān)基因的表達(dá)有調(diào)控作用[1-3]。

不管是在生殖系統(tǒng)中還是在非生殖系統(tǒng)中或者是在非雌激素作用的組織細(xì)胞中，ERα對目的組織的增殖、分化作用均表現(xiàn)為調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)[4]。在植入前胚中，ERα mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)呈階段特異性，2-細(xì)胞期、4-細(xì)胞期和囊胚期均可被檢出，8-細(xì)胞期卻未能檢查到[5]。課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)一定劑量的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(-)(epigallo catechin gallate，EGCG)能夠提高胚胎在體外的發(fā)育能力，同時(shí)使2-細(xì)胞胚中ERα的表達(dá)增強(qiáng)[6]，可見，在小鼠胚胎發(fā)育過程中，ERα具有一定功能，但其具體作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)以昆明(kunming，KM)小鼠植入前胚為研究對象，觀測雌激素受體(estrogen receptor，ER)抑制劑(ICI182780)、ERα特異性抑制劑(MPP)、ERβ特異性抑制劑(PHTPP)以及ERα特異性抗體在小鼠2-細(xì)胞胚至4-細(xì)胞胚體外發(fā)育過程中的作用，為深入探討ERα在植入前胚中的作用機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物KM雌鼠4～6 周，KM雄鼠8 周以上，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供。

1.2主要藥品及試劑人絨毛膜促性腺激素(hCG，美國Sigma公司)，孕馬血清促性腺激素(PMSG，以色列ProSpec TechnoGene公司)，M2培養(yǎng)液、M16培養(yǎng)液(北京邁晨公司)，ER抑制劑(ICI 182780)、ERα特異性抑制劑(MPP)、ERβ特異性抑制劑(PHTPP)(英國Tocris Bioscience公司)，ERα特異性抗體(美國Santa cruz公司)。

1.3主要儀器倒置顯微鏡(日本Nikon公司，型號：C-DS)，水套式二氧化碳培養(yǎng)箱(力康公司，型號：HF160W)。

1.4胚胎培養(yǎng)采用腹腔注射給藥法，雌鼠給予6IU PMSG后46～48 h再給予6IU hCG進(jìn)行促排卵，然后一對一跟雄鼠配對；第2天早晨查看雌鼠陰道是否有陰栓，有陰栓者判斷為受精成功。于hCG注射后27～28 h，從有陰栓雌鼠輸卵管中收集1-細(xì)胞胚，經(jīng)M2洗滌，M16漂洗3次，將形態(tài)完好的1-細(xì)胞胚分別移至預(yù)孵育好的M16培養(yǎng)液(對照組)以及培養(yǎng)液滴中含有不同濃度ICI 182780(0.5和1 μmol/L)、MPP (0.1、1、10、25和50 μmol/L)、PHTPP (10、25和50 μmol/L)和ERα特異性抗體(0.25、0.5和1 μg/mL)中進(jìn)行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)條件設(shè)置為37 ℃、5% CO2、飽和濕度；觀察并記錄2-細(xì)胞胚、4-細(xì)胞胚和囊胚的發(fā)育狀況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

1.5數(shù)據(jù)分析及處理因卵母細(xì)胞未受精會導(dǎo)致發(fā)育差異，所以均選用2-細(xì)胞胚作基數(shù)，統(tǒng)計(jì)4-細(xì)胞胚及囊胚的發(fā)育率，所有數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，以P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1ICI182780阻滯1-細(xì)胞胚的體外發(fā)育KM小鼠1-細(xì)胞胚在0.5和1 μmol/L的ICI182780培養(yǎng)液滴中發(fā)育至4-細(xì)胞胚和囊胚的比率均低于M16對照組(P<0.01，見表1，圖1B和2B)。

表11-細(xì)胞胚在不同濃度抑制劑(ICI、MPP和PHTPP)中的發(fā)育情況

抑制劑濃度(μmol/L)1-細(xì)胞胚(個(gè))2-細(xì)胞胚(個(gè))≥4-細(xì)胞胚[個(gè)(%)]囊胚[個(gè)(%)]0(M16對照組)17016196(59.63)14(8.70)ER抑制劑(ICI182780)0.516115158(38.41)*2(1.32)*1.016916014(8.75)*0(0)*0(M16對照組)12111668(58.62)13(11.20)0.112510771(66.36)10(9.30)112711880(67.80)20(16.90)ERα特異性抑制劑(MPP)1016215057(38.00)*0(0)*251631220(0)*0(0)*50150290(0)*#0(0)*#0(M16對照組)17116389(54.60)19(11.66)1016115789(56.69)15(9.55)ERβ特異性抑制劑(PHT-PP)2515214782(55.78)15(10.20)5018918194(51.93)12(6.63)

*：與M16對照組比較，P<0.01。#：對細(xì)胞具有毒性作用。

2.2MPP使1-細(xì)胞胚的體外發(fā)育受阻表1中MPP的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與M16對照組相比較，10 μmol/L的MPP顯著抑制小鼠2-細(xì)胞胚體外發(fā)育至4-細(xì)胞胚，同時(shí)使細(xì)胞失去發(fā)育至囊胚的能力(P<0.01)，當(dāng)培養(yǎng)液滴濃度為25 μmol/L時(shí)，1-細(xì)胞胚幾乎全部不能發(fā)育至4-細(xì)胞胚(P<0.01，見圖1C)，hCG后112 h，細(xì)胞已呈壞死狀態(tài)(見圖2C)。而50 μmol/L的培養(yǎng)液滴中，1-細(xì)胞胚至2-細(xì)胞胚的發(fā)育率極低，同時(shí)于4-細(xì)胞期(hCG后64 h)可觀測到細(xì)胞已表現(xiàn)為皺縮、發(fā)黑的壞死狀態(tài)(見圖1F)。

2.3PHTPP不影響1-細(xì)胞胚的體外發(fā)育與M16對照組比較，均未觀察到10、25和50 μmol/L的PHTPP在小鼠植入前胚體外發(fā)育過程中的影響作用(P>0.05，見表1，圖1D，2D)。

A: M16培養(yǎng)液(空白對照); B: ICI182780 1 μmol/L; C: MPP 25 μmol/L; D: PHTPP 50 μmol/L; E: ERα特異性抗體1 μg/mL; F: MPP 50 μmol/L。圖1　KM小鼠1-細(xì)胞胚在含不同試劑濃度的培養(yǎng)液滴中體外發(fā)育至4-細(xì)胞胚(hCG后64 h)的培養(yǎng)圖片

A: M16培養(yǎng)液(空白對照); B: ICI182780 1 μmol/L; C: MPP 25 μmol/L; D: PHTPP 50 μmol/L; E: ERα特異性抗體1 μg/mL。　　圖2　KM小鼠1-細(xì)胞胚在含不同試劑濃度的培養(yǎng)液滴中體外發(fā)育至囊胚(hCG后112 h)的培養(yǎng)圖片

2.4ERα特異性抗體抑制1-細(xì)胞胚的體外發(fā)育當(dāng)培養(yǎng)濃度為1 μg/mL時(shí)，1-細(xì)胞胚絕大部分被阻滯在2-細(xì)胞階段(P<0.01，見圖1E)，hCG后112 h，細(xì)胞已呈壞死狀態(tài)(見圖2E)。而0. 5 μg/mL的培養(yǎng)濃度則使細(xì)胞失去發(fā)育至囊胚的能力(P<0.01，見表2)。

表21-細(xì)胞胚在不同濃度的ERα特異性抗體中的發(fā)育情況

ERα特異性抗體濃度(μg/mL)1-細(xì)胞胚(個(gè))2-細(xì)胞胚(個(gè))≥4-細(xì)胞胚[個(gè)(%)]囊胚[個(gè)(%)]0(M16對照組)17817569(39.43)10(5.71)0.2519218373(39.89)14(7.65)0.5019819362(32.12)0*1.001841781(0.56)*0*

*：與M16對照組比較，P<0.01。

3　討論

胚胎的發(fā)育不僅對各種各樣的環(huán)境有害物質(zhì)敏感，同時(shí)對內(nèi)環(huán)境的各種刺激也是敏感的，任何影響因素都不利于胚胎發(fā)育成健康的、有活力的有機(jī)體甚至導(dǎo)致畸胎或死胎[7-9]。小鼠2-細(xì)胞中期之前，胚胎的生長有賴于母型調(diào)控，即其發(fā)育所需的mRNA和蛋白主要來自卵母細(xì)胞在其生長發(fā)育和成熟過程中所合成且累積的；但隨著胚胎的進(jìn)一步發(fā)育，母型mRNA和蛋白質(zhì)快速降解，胚胎的后續(xù)發(fā)育則轉(zhuǎn)為合子型調(diào)控，即其生長所需的mRNA和蛋白來源于合子基因組激活后所合成的；只有母型調(diào)控順利轉(zhuǎn)化為合子型調(diào)控，胚胎的生長發(fā)育才能得以繼續(xù)[10]。胚胎自身合成mRNA和蛋白開始于2-細(xì)胞中期，而4-細(xì)胞時(shí)期的ERα可能來自母型，也可能來自合子型[5]。2-細(xì)胞胚發(fā)育至4-細(xì)胞胚的過程可能也是母型ERα轉(zhuǎn)化為合子型ERα的過程，任何影響因素都可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)化失敗。本研究選用ER抑制劑(ICI182780)進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)ICI182780顯著阻滯1-細(xì)胞胚的體外發(fā)育，這一結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)[11]報(bào)道一致。ICI182780和雌激素受體的親和力很強(qiáng)，其利用改變受體的結(jié)構(gòu)使得基因發(fā)生異常轉(zhuǎn)錄從而發(fā)揮其抑制功能，存在劑量依賴，被認(rèn)為是“純雌激素對抗劑”[12]。ERα和ERβ為ER的2種亞型，這2種亞型在多種組織與細(xì)胞中均有表達(dá)，研究表明，ERα和ERβ與配體的結(jié)合方式各不相同，在不同組織中發(fā)揮著各自的主導(dǎo)作用[13-16]。為了鑒別這2種亞型在小鼠胚胎發(fā)育過程中的功能，本實(shí)驗(yàn)將KM小鼠1-細(xì)胞胚分別置于MPP與PHTPP的各種濃度中，培養(yǎng)觀測顯示，MPP抑制1-細(xì)胞胚的體外發(fā)育，并存在劑量依賴性，而PHTPP不影響1-細(xì)胞胚的體外發(fā)育能力，這一結(jié)果提示，與ERβ相比較，ERα在小鼠植入前胚體外發(fā)育中發(fā)揮著更為重要的作用。MPP是ERα特異性抑制劑，彼此的親和力很強(qiáng)，MPP通過影響ERα的不同基因調(diào)控位點(diǎn)，導(dǎo)致ERα激活基因轉(zhuǎn)錄的能力喪失[17]。進(jìn)一步的研究顯示，ERα特異性抗體同樣使1-細(xì)胞胚的體外發(fā)育出現(xiàn)“阻滯”現(xiàn)象，說明不管是屏蔽ERα結(jié)合位點(diǎn)或者是降低ERα活性，均可抑制植入前胚的體外發(fā)育。

綜上所述，ERα在KM小鼠植入前胚2-細(xì)胞胚至4-細(xì)胞胚體外發(fā)育的過程中具有重要作用，而ERβ未被觀察到有顯著作用，但ERα的具體影響機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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[收稿2016-04-14;修回2016-06-15]

(編輯：王靜)

The influence of ERα-specific antagonist on KM mouse preimplantation embryos development in vitro

ZhangYanqin1,WangShi’e2

(1.Department of Human Anatomy,Quanzhou Medical College, Quanzhou Fujian 362010,China;2.Department of Anatomy and Histology,Fujian Medical University, Fuzhou Fujian 350100,China)

Objective The objective of this study was to determine whether ERα plays a role in KM mouse preimplantation embryos development in vitro.Methods With blank M16 cultures as the control group, we observed the effects of different concentrations of antiestrogen ICI182780, ERα-specific antagonist MPP, ERβ-specific antagonist PHTPP and ERα specific antibody on the development of KM 1-cell embryos to 4-cell and blastocysts in vitro.Results Compared with blank M16 culture group, 0.5 and 1 μmol/l concentrations of ICI182780, as well as 10 μmol/l concentration of MPP,had significantly decreased the developmental rate of 4-cell embryos and lead to come to nothing of blastocysts (P<0.01). And, 25 and 50 μmol/l concentrations of MPP, as well as 1 μg/ml concentration of ERα specific antibody, had blocked 1-cell embryos at the 2-cell stage. Meanwhile, 50 μmol/l concentration of MPP had a toxic effect on embryos (P<0.01). 0.5 μg/ml concentration of ERα specific antibody had made the embryos lose the ability of development to the blastocysts (P<0.01). Finally, any concentration of PHTPP had been observed to have not any effect on the development of preimplantation embryos in vitro (P>0.05).Conclusion Antiestrogen and ERα-specific antagonist, as well as ERα specific antibody, could inhibit the development of 1-cell embryos in vitro.

ERα; KM mouse; MPP; preimplantation embryos; development block

泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校校級課題(NO：XJ1514)。

R321.2

A

1000-2715(2016)04-0353-05