吳貴英，祝　飛，沈　訪，儲士潤，李　林，鄭明輝

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 第一臨床學(xué)院，貴州 遵義　563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞生物學(xué)教研室，貴州 遵義　563099；3. 遵義醫(yī)學(xué)院 寄生蟲教研室，貴州 遵義　563099)

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

聚乙二醇誘導(dǎo)金釵石斛原生質(zhì)體融合條件的初步探索*

吳貴英1，祝飛1，沈訪1，儲士潤2，李林2，鄭明輝3

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 第一臨床學(xué)院，貴州 遵義563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞生物學(xué)教研室，貴州 遵義563099；3. 遵義醫(yī)學(xué)院 寄生蟲教研室，貴州 遵義563099)

目的 在原生質(zhì)體融合實驗中篩選PEG分子量、工作濃度及孵育時間的最佳水平，為系統(tǒng)建立起金釵石斛原生質(zhì)體融合技術(shù)體系奠定實驗基礎(chǔ)。方法 研究采用藥用品質(zhì)優(yōu)良的貴州赤水金釵石斛與莖粗生長快的云南瑞麗金釵石斛原生質(zhì)體為材料，采取單因素分析法，研究不同的聚乙二醇(PEG)分子量、濃度及孵育時間對原生質(zhì)體融合率的影響。結(jié)果 PEG的分子量對原生質(zhì)體融合率有顯著的影響。當(dāng)分子量為3 350 Da，原生質(zhì)體融合率最高，為18.32%；PEG濃度為40%時，原生質(zhì)體融合率最高，為18.81%；孵育時間為25 min時，原生質(zhì)體融合率最高，為18.62%。結(jié)論 采用分子量為3 350 Da的PEG在濃度為40%的條件下孵育25 min時，獲得的原生質(zhì)體融合率最高，為18.81%。

金釵石斛；原生質(zhì)體；聚乙二醇；融合率

金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.)是我國傳統(tǒng)名貴中藥，為蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)多年生附生草本植物[1]。其性微寒，味甘，用于熱病傷津、口干煩渴、病后虛熱、目暗不明、萎縮性胃炎、淺表性胃炎、慢性結(jié)腸炎等病癥，是石斛明目丸、石斛浸膏溶液、石斛清胃散等制劑的重要成分[2]。現(xiàn)代藥理研究證實金釵石斛具有治療白內(nèi)障、增強腸蠕動、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞等作用[3-5]。此外，金釵石斛花姿優(yōu)美，清香宜人，是著名的觀賞花卉[6]。然而由于自身的生物學(xué)特性、生態(tài)環(huán)境的破壞、過度采挖等原因，金釵石斛野生資源日漸枯竭，已被我國列為二類珍稀瀕危保護(hù)植物和珍稀瀕危的中藥品種，具有自然突變和優(yōu)良中藥性狀的株系更是稀缺。因此，金釵石斛的遺傳資源亟待開發(fā)利用和拓展，從拓展資源中篩選出藥性成分高、中藥性狀好、產(chǎn)業(yè)化潛力大的株系，不僅有助于藥性遺傳品質(zhì)的篩選、改良、基因工程等后續(xù)研究，還有望直接應(yīng)用于生產(chǎn)實踐，轉(zhuǎn)化成經(jīng)濟(jì)產(chǎn)值。

通過雜交和倍性育種方式，可以改良植物的遺傳性狀，拓展其遺傳資源。聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)細(xì)胞融合技術(shù)是常被用誘導(dǎo)植物細(xì)胞雜交和增加染色體組倍性最行之有效的技術(shù)方法之一。該方法具有試劑制備容易、細(xì)胞活性穩(wěn)定、不需特別的儀器設(shè)備、操作方便等優(yōu)點，現(xiàn)已成為研究細(xì)胞遺傳、基因定位和培育生物新品種的重要手段[5]，并普遍用于生物醫(yī)藥、遺傳等研究領(lǐng)域[7]。PEG的分子質(zhì)量、濃度及其孵育時間等因素是影響實驗結(jié)果的最重要因素[8]，本研究選用藥物性狀優(yōu)良、源自于貴州赤水的金釵石斛和莖粗生長快的云南瑞麗金釵石斛幼嫩葉片為材料，分別酶解純化獲得原生質(zhì)體后用PEG誘導(dǎo)這兩種基因型的金釵石斛原生質(zhì)體融合。比較分子量、濃度及孵育時間對PRG所誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合率的影響，以期篩選出PEG誘導(dǎo)金釵石斛原生質(zhì)體融合的最適條件，為系統(tǒng)建立金釵石斛的原生質(zhì)體融合技術(shù)體系奠定實驗基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實驗材料為本實驗室組培的貴州赤水金釵石斛與云南瑞麗金釵石斛幼苗的幼嫩葉片。

1.2實驗試劑纖維素酶(Cellulase R-10)、果膠酶(Pectolyase Y-23)、牛血清白蛋白(BSA)、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、熒光素雙醋酸酯(FDA)為Solarbio公司產(chǎn)品，離析酶(Macerozyme R-10)為日本Yakult產(chǎn)品，聚乙二醇(PEG)為Sigma產(chǎn)品，其它生化試劑為國產(chǎn)的分析純試劑。

1.3實驗器材BS-2E恒溫振蕩培養(yǎng)箱(常州冠軍儀器制造有限公司)，細(xì)胞計數(shù)板(上海萃華生物科技有限公司)，XD-203倒置熒光顯微鏡(南京江南永新光學(xué)有限公司)。

1.4實驗方法

1.4.1原生質(zhì)體分離

1.4.1.1預(yù)處理金釵石斛組培苗在黑暗條件下培養(yǎng)12 h后，取葉齡35 d的無菌苗第2～3片葉[9]，分別切除葉柄和葉邊緣，橫向?qū)⑷~片剪成1 mm左右的條，放置0.95 mol/L甘露醇溶液中，在4 ℃環(huán)境中暗處理1 h。

1.4.1.2酶液配備1 mL MES(200 mmol，pH5.7) +2.5 mL KCl(80 mmol)+5 mL甘露醇(0.8 mol) +100 mg纖維素酶+40 mg果膠酶+50 mg離析酶，無菌水定容成10 mL。55 ℃水浴10 min，冷卻至室溫后，再加入1 mL BSA(10 mg/mL)+400 μL CaCl2(250 mmol)，用0.45 μm濾器將混合液過濾至培養(yǎng)皿中。

1.4.1.3酶解將預(yù)處理好的葉片放入配好的酶解液中，在搖床上黑暗處理4 h即可釋放出原生質(zhì)體，期間可通過倒置顯微鏡觀察原生質(zhì)體解離情況。

1.4.1.4原生質(zhì)體純化將獲得的原生質(zhì)體溶液經(jīng)200目的細(xì)胞篩過濾，收集濾液，500 rpm離心5 min后，用洗液(5.94 g/L KCl+1.48 g/L CaCl2+1.1 g/L MES+100 g/L甘露醇)溶解沉淀物，反復(fù)離心3～5次可純化原生質(zhì)體。

1.4.1.5培養(yǎng)將純化的原生質(zhì)體置于培養(yǎng)液(1/2 MS+1.1 g/L MES+200 g/L土豆+30 g/L蔗糖+100 g/L葡萄糖+1.48 g/L CaCl2+100 g/L甘露醇+1.0 g/L BSA)中，室溫下100 rpm搖床中暗培養(yǎng)2 h，用FDA對純化的原生質(zhì)體進(jìn)行活力檢測。

1.4.1.6原生質(zhì)體活力率測定取20 μL純化后原生質(zhì)體滴在細(xì)胞計數(shù)板上，在明視野下觀察原生質(zhì)體總數(shù)。依據(jù)FDA和有活力的原生質(zhì)體中的酯酶作用可釋放出熒光素，并在藍(lán)光激發(fā)下能發(fā)出黃綠色的熒光的原理來鑒定有活力的原生質(zhì)體[10]，分別計數(shù)原生質(zhì)體總數(shù)和有活力的原生質(zhì)體數(shù)3次，取平均值。原生質(zhì)體的活力率=(被染色的原生質(zhì)體數(shù)/原生質(zhì)體總數(shù))×100%。

1.4.2原生質(zhì)體融合

1.4.2.1PEG溶液配置(以PEG濃度為40%為例)800 mg PEG-X +600 μL CaCl2(280 mmol)+ 600 μL葡萄糖(0.1%)，X為PEG的分子量。

1.4.2.2PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合將活力大于70%、濃度大于1.0×106個/g的貴州赤水和云南瑞麗金釵石斛兩種原生質(zhì)體按相同細(xì)胞數(shù)加入培養(yǎng)皿中，總原生質(zhì)體和PEG溶液按2∶1體積分別滴入上述配制的PEG溶液，室溫下進(jìn)行融合。

細(xì)胞融合PEG分子量選擇:在室溫下，分別用分子量為1 500、3 350、4 000、6 000 Da的PEG作促溶劑進(jìn)行融合，重復(fù)4次，分別在最適合的PEG濃度(40 %)和孵育時間(25 min)取融合后的細(xì)胞統(tǒng)計融合率。

細(xì)胞融合PEG濃度選擇：在室溫下，PEG濃度分別為36%、38%、40%、42%、44%，重復(fù)4次，分別在最適合的PEG分子量(3 350 Da)和孵育時間(25 min)取融合后的細(xì)胞統(tǒng)計融合率。

細(xì)胞融合孵育時間選擇在室溫下加入PEG，混勻后作用一定時間，本實驗設(shè)置了5個時間，即11、12、13、14、15 min，再滴加與PEG等體積的CaCl2(濃度為200 mmol)混勻后，各自靜置培養(yǎng)10、11、12、13、14 min(孵育時間為PEG作用時間+高鈣助融時間)，每個孵育時間重復(fù)4次，分別在最適合的PEG分子量(3 350 Da)和PEG濃度(40 %)取融合后的細(xì)胞統(tǒng)計融合率。

1.4.2.3洗滌將融合后的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)入離心管中，500 rpm離心5 min，倒掉上清后加入洗液(5.94 g/L KCl+1.48 g/L CaCl2+1.1 g/L MES+100 g/L甘露醇)洗滌沉淀，如此反復(fù)離心洗滌沉淀3～5次即可獲得去掉了PEG融合劑的原生質(zhì)體。

1.4.2.4融合細(xì)胞的鑒定與計數(shù)細(xì)胞觀察與計數(shù)同1.4.1.6。

2　結(jié)果

2.1不同分子量PEG對金釵石斛原生質(zhì)體融合的影響在PEG濃度為40%和融合時間為25 min的條件下，PEG不同分子量對金釵石斛原生質(zhì)體融合的影響(見表1)。隨著PEG分子量的增加，融合率從1 500 Da的8.04%增加到3 350 Da時的18.32%。但當(dāng)PEG的分子量增加到4 000或6 000 Da時，融合率均低于18.32%。說明3 350 Da是PEG誘導(dǎo)金釵石斛原生質(zhì)體融合最佳的PEG分子量。

2.2不同濃度PEG對金釵石斛原生質(zhì)體融合的影響在PEG分子量為3 350 Da和融合時間為25 min的條件下，PEG濃度為36%～40%時，原生質(zhì)體融合率從12.79%增加到18.81%。當(dāng)PEG濃度高于40%原生質(zhì)體融合率則降低，說明PEG40%濃度是PEG誘導(dǎo)金釵石斛原生質(zhì)體融合的最佳濃度(見表1)。

表1不同PEG分子量、濃度和孵育時間下的金釵石斛原生質(zhì)體融合率

PEG濃度40%,孵育時間25minPEG分子量(Da)融合率(%)PEG分子量3350Da,孵育時間25minPEG濃度(%)融合率(%)PEG濃度40%,分子量3350Da孵育時間(min)融合率(%)15008.04±2.83B3612.79±5.30A2117.72±7.22A335018.32±2.23A3816.93±4.95A2318.08±8.24A40009.93±4.28B4018.81±2.00A2518.62±2.06A600015.24±3.21A4217.49±3.21A2718.26±7.17A--4416.55±5.12A2918.09±7.06A

不同大寫英文字母表示同列數(shù)據(jù)在0.01水平有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3PEG不同孵育時間對金釵石斛原生質(zhì)體融合的影響在PEG濃度為40%和PEG分子量為3 350 Da的條件下，原生質(zhì)體融合率從孵育21 min的17.72%增到25 min的18.62%。當(dāng)孵育時間進(jìn)一步延長而原生質(zhì)體融合率又逐漸降低。說明孵育25 min是最佳孵育時間(見表1)。

3　討論

PEG可以破壞和干擾各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞相互接觸部位的膜脂雙層中磷脂分子發(fā)生疏散，進(jìn)而使其結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，再加上膜脂雙層的相互親合以及彼此間表面張力的作用，引起相鄰的重排質(zhì)膜在修復(fù)時相互合并在一起，進(jìn)而導(dǎo)致兩細(xì)胞的胞質(zhì)溝通、融合。PEG可與水分子借氫鍵結(jié)合，在高濃度的PEG溶液中自由水消失，導(dǎo)致細(xì)胞脫水而發(fā)生質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的變化，引起細(xì)胞融合，為了發(fā)揮PEG促進(jìn)細(xì)胞融合的效力，必須采用較高濃度的PEG溶液，但在高濃度PEG溶液下，細(xì)胞可能因脫水而受到顯著的破壞。

有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的融合率與PEG的相對分子質(zhì)量及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正比[11]，但PEG的分子量越小，融合率越低；PEG的分子量越大，對細(xì)胞的毒性就越大。然而本實驗用4種不同分子量的PEG(即1 500、3 350、4 000、6 000 Da)作為影響因素，選用4種不同分子量的PEG，其對應(yīng)的融合率差異顯著，證明PEG的分子量對金釵石斛的融合率有著顯著性的影響，是影響原生質(zhì)體融合的關(guān)鍵因素之一。綜上可以看出，選用適宜分子量的PEG能促進(jìn)金釵石斛原生質(zhì)體的融合效率。

前人的研究表明，PEG濃度對原生質(zhì)體融合起一定影響[12]。PEG濃度較低使原生質(zhì)體融合率較低，隨著濃度增加，雖然原生質(zhì)體的融合幾率增加，但濃度的增加也使得更多的融合子受到毒害，濃度過高會導(dǎo)致原生質(zhì)體皺縮甚至中毒，融合子的存活率降低[13]。本研究表明：PEG濃度對融合率無顯著影響。但當(dāng)PEG濃度增加到為40%時，原生質(zhì)體融合率最高，當(dāng)PEG濃度繼續(xù)增加，原生質(zhì)體融合率就逐漸降低。故40%是PEG誘導(dǎo)金釵石斛原生質(zhì)體融合的最佳濃度。

有研究報道隨著融合時間的延長，融合率反而有所下降，這可能是因為PEG作用時間過長，對細(xì)胞毒害太大，導(dǎo)致了更多融合細(xì)胞變形甚至破裂所致。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)孵育時間從21 min到25 min時原生質(zhì)體的融合率略有升高，25 min到29 min時略有下降，故此隨時間推移原生質(zhì)體的融合率未發(fā)生顯著變化，這與馬云等[5]、王惠等[14]、趙彥禹等[15]的研究結(jié)果一致。

本研究對PEG誘導(dǎo)金釵石斛原生質(zhì)體融合的研究，采用藥用品質(zhì)優(yōu)良的貴州赤水金釵與莖粗生長快的云南瑞麗金釵石斛幼苗的幼嫩葉為材料，采取單因素分析的方法，摸索不同分子量的PEG、不同PEG濃度及PEG不同孵育時間對原生質(zhì)體融合率的最佳條件。結(jié)果顯示PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合受很多因素的影響，只要控制好分子質(zhì)量、調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)臐舛群头跤龝r間范圍，就能獲得較高的細(xì)胞融合率。當(dāng)然，對于其他不同影響因素，其最適融合條件之間的差別還有待于進(jìn)一步研究探討。

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[收稿2016-04-20;修回2016-06-10]

(編輯：王靜)

The priminary study of screening the optimum condition during the protoplast fusion inDendrobiumnobilewithpolyethylene glycol

WuGuiying1，ZhuFei1，ShenFang1，ChuShirun2，LiLin2，ZhengMinghui3

(1.The First Clinical College of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 2.Department of Cell Biology of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 3. Department of Parasite of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

Objective To systemically construct the protocol of protoplast fusion inDendrobiumnobileLindl, the optimum levels both of molecular weight and concentration of polyethylene glycol (PEG)and of incubation time were screened during the fusion process.Methods In the current study, twoD.Nobilelandraces were applied as the material. One was originated from Chishui County of Guizhou Province with higher medical quality; another was from Ruili City of Yunnan Province with faster growing and larger stem diameter. The single factor analysis method was adopted as the experimental design and the protoplast fusion rate was selected as the criterion to screen the optimum levels of PEG molecular weight, PEG concentration and incubation time during the fusion experiment.Results The molecular weight of PEG significantly affected the protoplast fusion rate. The rate got the highest value as 18.32%, 18.81% 18.62%, when the molecular weight of PEG was 3 350 Da, PEG concentration was 40% and the incubation time was 25 min, individually.Conclusion The protoplast fusion rate could reach the highest value of 18.81% under the conditions of the PEG molecular weight was 3 350 Da, the concentration was 40% and the incubation time was 25 min.

Dendrobiumnobile; protoplast; polyethylene glycol; fusion rate

貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開發(fā)專項(NO：黔科合ZY字[2013]3002)；貴州省科技廳、遵義醫(yī)學(xué)院、遵義市科技局聯(lián)合基金重點項目(NO：黔科合LH字[2014]7549)；貴州省教育廳2014年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(NO：201410661007)；遵義醫(yī)學(xué)院2013年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(NO：院發(fā)[2013]6524)；遵義醫(yī)學(xué)院招標(biāo)項目(NO：F-611、F-551)。

鄭明輝，男，博士，副教授，研究方向：中藥材遺傳育種，E-mail:ivying0209@hotmail.com。

R394.2

A

1000-2715(2016)04-0362-04