黃 利,趙 翀
(國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作河南中心,河南 鄭州 450002)
植酸酶技術(shù)專利分析
黃 利,趙 翀
(國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作河南中心,河南 鄭州 450002)
植酸酶是飼料、食品等工業(yè)的重要用酶。目前,尚未有針對植酸酶專利布局的研究報告。從專利申請趨勢、國家分布、申請人分布等方面對國內(nèi)外植酸酶專利申請情況進(jìn)行分析,并對該領(lǐng)域的專利技術(shù)現(xiàn)狀進(jìn)行歸納和總結(jié),以期為我國相關(guān)企業(yè)和研究機(jī)構(gòu)提供參考。
植酸酶;飼料;專利分析
植酸(肌醇六磷酸)是谷物、豆類、油籽和堅果中磷的主要貯存形式,其含量為1%~5%。植酸具有強大的絡(luò)合力,通常與鈣、鎂、鋅、鉀等礦物質(zhì)元素結(jié)合,形成不溶性鹽類。飼料中總磷的1/3是可消化的無機(jī)磷,其余的2/3則以有機(jī)磷即植酸鹽的形式存在。由于植酸鹽對于人和豬、禽等單胃動物來說是難以利用的,因為人和單胃動物的腸道內(nèi)不分泌或只分泌少量的降解植酸的植酸酶,因此,植酸鹽的該種特性造成了食品和飼料中的磷及鈣、鎂、鋅、鉀等營養(yǎng)元素不能被充分利用。為了保持動物機(jī)體的營養(yǎng)均衡,需要額外添加無機(jī)磷和礦物質(zhì),這不僅造成了飼料加工成本的增加,而且不能利用的植酸鹽從糞便中排出,又給環(huán)境造成了污染[1-2]。
植酸酶(phytase),又稱肌醇六磷酸酶,屬于磷酸單脂水解酶,能水解植酸并最終釋放出無機(jī)磷。1907年,Suzuki等在玉米糠中首次發(fā)現(xiàn)植酸酶,之后長期由于植酸酶制劑的成本原因沒有在飼料工業(yè)中得到應(yīng)用[3]。近年來,隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展,植酸酶的生產(chǎn)成本日益下降,植酸酶飼料添加劑與食品添加劑受到人們的普遍關(guān)注,也成為酶制劑研究的一個熱點。
筆者利用德溫特世界專利索引數(shù)據(jù)庫(DWPI)進(jìn)行檢索,共獲得植酸酶相關(guān)全球?qū)@暾?548項(一系列同族專利申請視為1項申請,每個專利族中最早的優(yōu)先權(quán)日視為該申請的申請日),應(yīng)用中國專利檢索系統(tǒng)(CPRS)檢索得到我國植酸酶相關(guān)專利申請1529件 (以上數(shù)據(jù)均截至2016年6月20日),以此為研究基礎(chǔ),從專利申請趨勢、國家分布、申請人分布等方面,分析植酸酶技術(shù)的發(fā)展?fàn)顩r,以期為從事植酸酶制劑開發(fā)和生產(chǎn)的企業(yè)和科研機(jī)構(gòu)提供有益參考。
1.1 專利申請趨勢分析 全球植酸酶技術(shù)專利申請量的時間分布如圖1所示,其中2014、2015年的專利申請尚未全部公開,數(shù)據(jù)僅供參考。1964年,美 國 公 司 InternationalMinerals&Chemical Corporation首次申請了關(guān)于酸性植酸酶制備的專利(US3297548),之后專利申請數(shù)量長期維持在每年10件以下的較低水平。直到1996年,植酸酶技術(shù)的申請量開始逐漸攀升,從1996年的22項上升到2013年的438項。根據(jù)國際專利分類表的分類規(guī)則,C12N9/16和C12N15/55分別代表了植酸酶或其基因的專利申請。由此可知,植酸酶技術(shù)正處于快速發(fā)展階段,植酸酶制劑也越來越多地被應(yīng)用到各個相關(guān)領(lǐng)域。
圖1 全球植酸酶技術(shù)專利申請量的時間分布
1.2 專利申請技術(shù)來源地區(qū)分析 各國有關(guān)植酸酶技術(shù)專利申請數(shù)量的分布見圖2。由圖2可知,美國和中國的專利申請數(shù)量最大,分別占到了40%和44%。美國和中國長期占據(jù)著世界飼料生產(chǎn)量前2名的位置,而飼料工業(yè)是植酸酶應(yīng)用最多的領(lǐng)域,因此,這2個國家無論是在植酸酶的開發(fā)或是應(yīng)用方面,都有較多的研究和專利申請量。丹麥和歐洲其他國家也有較多的專利申請,這主要是由于這些地區(qū)有幾家較大的酶制劑公司,如諾維信、巴斯夫、帝斯曼等。
圖2 植酸酶技術(shù)來源國家或地區(qū)分布
2.1 專利申請趨勢分析 我國植酸酶技術(shù)專利申請量的時間分布狀況見圖3。由于專利申請一般是在申請日18個月后公開,因此,2015、2016年的申請數(shù)量僅供參考。由圖3可知,1985年中國專利局開始受理專利申請當(dāng)年即有植酸酶技術(shù)相關(guān)專利申請,然而在1985—1996年,專利申請量每年僅有1件或者沒有;1997年后,專利申請量緩慢增長,這與全球?qū)@暾堅鲩L的趨勢是一致的,但在2007年之前一直維持在較低水平;從2007年開始,該領(lǐng)域?qū)@暾垟?shù)量快速增加,從之前的20件左右的水平快速提高到50件以上。但是,快速增長的專利申請主要集中在飼料相關(guān)領(lǐng)域,這與我國飼料工業(yè)在該階段的快速發(fā)展有關(guān),如2012年我國飼料產(chǎn)量已經(jīng)超越美國位居世界首位。
圖3 我國植酸酶技術(shù)專利申請量的時間分布
2.2 專利申請人分布 我國植酸酶技術(shù)領(lǐng)域主要專利申請人的分布情況見表1。由表1可以看出,排名前15位的申請人有10家為飼料生產(chǎn)或養(yǎng)殖類企業(yè),其他幾家則為國內(nèi)外有關(guān)植酸酶研發(fā)的生物技術(shù)公司或研究所。如果僅關(guān)注植酸酶及酶制劑的開發(fā)、生產(chǎn)等技術(shù)(不包括應(yīng)用方面),則可以看出申請量最多的申請人主要以諾維信為代表的國外生物技術(shù)公司和以中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所為代表的國內(nèi)研究所為主,而青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司等國內(nèi)酶制劑企業(yè)也有較多申請。
3.1 研發(fā)技術(shù)領(lǐng)域分析 植酸酶研究的技術(shù)分布情況見表2。由表2可知,植酸酶的研究包括新酶的開發(fā)、酶的生產(chǎn)、酶制劑、酶的檢測及應(yīng)用等方面。植酸酶的開發(fā)包括新的植酸酶、新的產(chǎn)酶菌株、酶的突變體等方向。植酸酶的應(yīng)用則主要集中在飼料、肥料和土壤改良劑、食品加工等方面。
3.2 新的植酸酶開發(fā) 植酸酶廣泛存在于動物、植物、微生物中,其中微生物是植酸酶最重要的來源,篩選能夠表達(dá)具有特定生物學(xué)性質(zhì)的植酸酶的天然菌株仍是獲得新的植酸酶的重要手段。傳統(tǒng)的酶或基因的分離方法是基于微生物的分離培養(yǎng),根據(jù)所需特性篩選并克隆得到基因。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,采用基因突變等手段進(jìn)行高通量的篩選逐漸成為主流的技術(shù)手段。由于飼料生產(chǎn)中的制粒過程需要經(jīng)過高溫加熱(一般在75~80℃),進(jìn)一步篩選耐熱性能更好的植酸酶仍是研究的重點[4]。中性植酸酶更加適合于水產(chǎn)養(yǎng)殖,也是目前研究的一個重要方向[5]。此外,酶活性和抗蛋白酶水解性能的提高等也是研究的關(guān)注點。
表1 植酸酶技術(shù)領(lǐng)域主要專利申請人狀況
表2 植酸酶技術(shù)領(lǐng)域主要技術(shù)分支專利申請狀況
CN1051058A是首件有關(guān)新的植酸酶的中國專利申請,其公開了從無花果曲霉NRRL 3133克隆植酸酶基因并在黑曲霉中表達(dá)的技術(shù)。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所的專利申請CN1184156A,公開了從黑曲霉菌株A.niger 963克隆得到phyA2基因并對其進(jìn)行定點突變的技術(shù),利用該技術(shù)可使重組酵母中植酸酶的表達(dá)量達(dá)到50萬U/mL發(fā)酵液,這也是我國申請人首個有關(guān)新的植酸酶的申請。CN101426907A公開了從中間型耶爾森氏菌H-27分離的新型植酸酶,該酶在高溫下具有良好的熱穩(wěn)定性、廣泛的pH值作用范圍以及較強的胃蛋白酶和胰蛋白酶抗性,并且比活為3960 U/mg,是當(dāng)時已報道的比活最高的植酸酶。CN1688690A公開了對大腸桿菌來源的肌醇六磷酸酶基因APPA進(jìn)行隨機(jī)突變,并以枯草芽胞桿菌為宿主進(jìn)行篩選和表達(dá),得到了具有更高產(chǎn)量的突變體。CN101932703A公開了將枯草芽胞桿菌的中性植酸酶基因phyC的酶蛋白的N、C兩端相鏈接,得到環(huán)化的植酸酶,改良的植酸酶具有更好的熱穩(wěn)定性,對外肽酶的降解作用也較野生型有明顯的抗性。CN103468660A公開了以野生型淀粉液化芽胞桿菌DSM1061 phyC基因為基礎(chǔ),利用PCR技術(shù)對該基因進(jìn)行點突變,獲得了1種突變的中性植酸酶;突變的中性植酸酶與野生酶相比,在40~75℃范圍內(nèi),活性均有提高,尤其是在50~60℃下活性提高約1倍;在pH值=7.5的條件下,突變酶的活性約為野生酶的3.0倍。
3.3 植酸酶的生產(chǎn)研究
3.3.1 植酸酶的微生物表達(dá):野生型菌株直接發(fā)酵產(chǎn)酶量一般較少,如CN101024825A中以黃藍(lán)狀菌發(fā)酵,得到的植酸酶酶活僅為294 U/mL,因此,采用植酸酶基因工程菌提高酶產(chǎn)量,進(jìn)行大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)是現(xiàn)今植酸酶生產(chǎn)的主要手段。
作為基因工程菌株的宿主可以是大腸桿菌(CN103740672A)、 畢赤酵母菌(CN101935617A)、枯草芽胞桿菌 (CN1358845A)、曲霉、木霉(CN1268029A)、博伊丁氏假絲酵母菌(CN1224757A)等。通過對啟動子等載體元件的選擇、密碼子的優(yōu)化、菌株的篩選、發(fā)酵工藝的優(yōu)化,可以實現(xiàn)較高的酶表達(dá)量和較低的生產(chǎn)成本。如CN1749399A公開了對AOX1啟動子進(jìn)行改組,得到的畢赤酵母植酸酶表達(dá)系統(tǒng)可以利用葡萄糖作為碳源,在簡便的發(fā)酵條件獲得酸性植酸酶的高效表達(dá),從整體上降低生產(chǎn)成本。CN102115735A公開了通過對葡萄糖補料、甲醇誘導(dǎo)等工藝的優(yōu)化實現(xiàn)了轉(zhuǎn)植酸酶畢赤酵母菌的高密度發(fā)酵和植酸酶的高效表達(dá)。
轉(zhuǎn)基因菌株直接作為飼料添加劑是植酸酶利用的另一種策略。CN101463360A公開了一種植酸酶的乳酸菌表達(dá)體系,利用轉(zhuǎn)基因乳酸菌飼喂動物,可使其長期寄居在動物(主要指豬禽)胃腸道內(nèi)并分泌植酸酶,起到益生菌和酶制劑的雙重作用。CN104988174A公開了將植酸酶基因轉(zhuǎn)入蛹蟲草原生質(zhì)體,再生獲得轉(zhuǎn)基因蛹蟲草子實體后,以子實體為母種,培養(yǎng)制得轉(zhuǎn)基因蛹蟲草菌絲,收集菌體并烘干粉碎制得高表達(dá)植酸酶的真菌菌絲飼料添加劑,可直接添加于飼料中飼喂動物。
3.3.2 植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá):植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)有2個重要優(yōu)點:一是,轉(zhuǎn)基因植物可以直接表達(dá)足量的植酸酶以替代飼料和食品中額外添加的植酸酶;二是,植物生長過程中根系分泌的植酸酶可以對土壤進(jìn)行改良。
在國內(nèi),中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所擁有最多的轉(zhuǎn)植酸酶植物相關(guān)專利,早在2002年即提出了有關(guān)耐熱植酸酶編碼基因phyA3的高效植物表達(dá)載體pBINPLUSphy的申請(CN1473934A),并且該研究所培養(yǎng)的轉(zhuǎn)植酸酶玉米也已獲得我國的轉(zhuǎn)基因植物安全證書。浙江大學(xué)也于2008年申請了轉(zhuǎn)大腸桿菌植酸酶基因appA水稻的專利,該專利中使用了外分泌型的轉(zhuǎn)基因載體,得到的轉(zhuǎn)基因水稻能夠利用土壤中的有機(jī)磷。
3.3.3 植酸酶的轉(zhuǎn)基因動物表達(dá):轉(zhuǎn)基因動物表達(dá)的研究有以下3個方向。
①利用家蠶等昆蟲反應(yīng)器進(jìn)行植酸酶生產(chǎn)。CN1229135A公開了利用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)植酸酶的方法,表達(dá)植酸酶的蠶蛹可以直接作為飼料,從蠶蛹中提取的植酸酶可以作為食品添加劑。
②培育組織特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動物:CN1368843A公開了使用唾液蛋白啟動子/增強子序列調(diào)控植酸酶等外源基因的表達(dá),得到唾液腺特異表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動物。CN103695451A公開了唾液腺組織特異性表達(dá)β-葡聚糖酶基因—木聚糖酶基因—植酸酶基因融合基因的轉(zhuǎn)基因豬。
③培育可寄生于畜禽體內(nèi)的寄生生物。CN104673830A公開了能夠表達(dá)植酸酶的球蟲,通過口服的方式將該球蟲接種至畜禽體內(nèi),使其在腸道內(nèi)發(fā)育的同時表達(dá)并釋放出植酸酶,進(jìn)而降解植酸?;谇蛳x活疫苗在畜禽中的有效應(yīng)用,該種表達(dá)植酸酶的轉(zhuǎn)基因球蟲既可以作為疫苗預(yù)防畜禽球蟲病,而且也能在提高鈣磷利用效率的同時降低畜禽糞便中磷元素對環(huán)境的污染。
3.4 植酸酶制劑的研究 為了達(dá)到特定的使用目的并獲得較好的使用效果,一般需要多種酶聯(lián)合應(yīng)用,即復(fù)合酶。有較多的專利申請涉及各種用途的復(fù)合酶,例如CN101285058A公開了一種木薯渣工業(yè)用的復(fù)合酶制劑,該酶制劑含有復(fù)合纖維素酶、果膠酶、蛋白酶、葡聚糖酶、植酸酶、漆酶等,可以有效降低木薯渣含水量和物料黏度,還可以二次回收廢渣中的淀粉,增加淀粉收率。CN102492665A公開了由纖維素酶、果膠酶、多酚氧化酶等組成的普洱茶發(fā)酵復(fù)合酶制劑,能有效分解茶葉中的纖維素、半纖維素等多糖類及其他物質(zhì),從而使細(xì)胞內(nèi)各種理化物質(zhì)溶出。
酶制劑研究的另一個重點是增加酶的穩(wěn)定性和利用率。如CN1241634A公開了利用高碘酸鈉氧化肌醇六磷酸酶單體并且隨后加入己二酸二酰肼交聯(lián),加入己二酸二酰肼交聯(lián)與未交聯(lián)的肌醇六磷酸酶單體相比,其具有10~15℃的增加的熱穩(wěn)定性。CN101168734A公開了一種包衣微丸植酸酶,該產(chǎn)品在使用、儲存時可保持酶活性穩(wěn)定,抵抗外界高溫、高濕等不良環(huán)境的能力增強。
3.5 植酸酶的檢測研究 植酸酶的檢測研究主要集中于兩方面。一方面是對于飼料等樣品中植酸酶活性、耐溫性的檢測,如CN102854158A公開了一種快速測定植酸酶耐溫性能的方法;CN101493418A公開了飼料中植酸酶的微量測定方法,其首先使用乙酸緩沖液作為透析外液對樣品進(jìn)行透析處理,以降低飼料中無機(jī)磷含量,之后進(jìn)行酶活測定。另一方面的研究是對轉(zhuǎn)植酸酶基因植物或飼料產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因成分檢測的研究,如CN101914156A公開了基于植酸酶PHY單克隆抗體的蛋白質(zhì)芯片的轉(zhuǎn)基因作物檢測方法和試劑盒;CN102876800A公開了通過使用擴(kuò)增植酸酶基因的一對特異引物或者擴(kuò)增植酸酶基因表達(dá)框中構(gòu)建載體終止子與基因結(jié)合區(qū)域的一對特異引物進(jìn)行實時熒光定量PCR的定量檢測方法。
3.6 植酸酶的應(yīng)用研究 飼料工業(yè)是植酸酶最重要的應(yīng)用領(lǐng)域。在植酸酶相關(guān)的全部專利申請中,有關(guān)飼料的申請達(dá)1081件,其中,豬飼料相關(guān)專利申請為407件,雞飼料相關(guān)專利申請為312件,魚蝦等水產(chǎn)飼料相關(guān)專利申請為85件。植酸酶可以直接加入飼料中使用,如CN1293542A公開了含有植酸酶的動物飼料的制備方法,在飼料成分的團(tuán)聚前或團(tuán)聚期間加入熱穩(wěn)定性植酸酶;也可以用于對飼料原料的處理,如CN104904991A公開了使用產(chǎn)朊假絲酵母菌、枯草芽胞桿菌等菌液與植酸酶、纖維素酶等混合后對豆粕原料進(jìn)行發(fā)酵處理以生產(chǎn)蛋白飼料原料的技術(shù)。
食品工業(yè)也是植酸酶的重要應(yīng)用領(lǐng)域。植酸酶可用于生產(chǎn)低植酸的食品,增加食品中可利用的礦物質(zhì)含量,小麥、大米等谷物的處理以及大豆等蛋白原料的處理均可應(yīng)用。植酸酶也可用于酒類等發(fā)酵食品的生產(chǎn),例如CN105219593A公開了將植酸酶等酶類與釀酒酵母、根霉菌混合作為制酒專用曲釀造清爽型米酒的技術(shù)。
植酸酶可以作為肥料和土壤改良劑的成分,施入后可提高土壤的植酸酶活性,促進(jìn)土壤有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為無機(jī)磷,提高有機(jī)磷的生物有效性,與禽畜糞便等有機(jī)肥料共同使用能夠促進(jìn)其中的植酸分解釋放出無機(jī)磷。植酸酶可應(yīng)用于環(huán)保領(lǐng)域,作為除臭劑 (如 CN102107014A)、污水處理劑 (如CN103274484A)的有效成分。植酸酶應(yīng)用于洗滌劑,可以清除蔬果中殘留的有機(jī)磷農(nóng)藥 (如CN1760356A)。植酸酶也可用于植酸降解物的生產(chǎn),如CN85109110A公開了利用含有肌醇六磷酸的原料,在溫度為20~70℃、pH值為4~8的條件下制備肌醇三磷酸化合物的技術(shù);CN104561122A公開了利用植酸酶從長角豆中提取肌醇類分子的技術(shù)。
通過對植酸酶技術(shù)相關(guān)專利的分析可以看出,植酸酶技術(shù)的研究仍然處于快速發(fā)展時期。目前,植酸酶技術(shù)仍主要集中于國外知名的生物技術(shù)公司以及中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院等高水平科研機(jī)構(gòu),技術(shù)集中度比較高。我國企業(yè)雖然專利申請量大,但主要集中于酶的應(yīng)用,如飼料等產(chǎn)業(yè)下游領(lǐng)域,在技術(shù)上不占優(yōu)勢。
對植酸酶進(jìn)行改造,獲得具有耐高溫、pH值適合范圍廣等優(yōu)良特點的酶仍是研發(fā)的重點方向。現(xiàn)今,對植酸酶基因進(jìn)行突變并篩選的技術(shù)已經(jīng)比較成熟,國內(nèi)企業(yè)可以以此為著力點開展相關(guān)研究,如青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司已有多件專利申請。
此外,對于植酸酶的應(yīng)用目前仍然集中于飼料領(lǐng)域,而其他領(lǐng)域應(yīng)用相對較少。因此,有必要開發(fā)更加適合其他領(lǐng)域的酶,例如洗滌劑用酶必須要與洗滌劑的主成分如表面活性劑有良好的配伍性,如果能夠開發(fā)出與表面活性劑有較高相容性的植酸酶將可以提高植酸酶在洗滌劑領(lǐng)域的應(yīng)用。
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Patents Analysis on Phytase Technology
HUANG Li,ZHAO Chong
(Patent Examination Cooperation Center of Henan Province,The Patent Office,State Intellectual Property Office,Zhengzhou 450002,China)
Phytase is widely used in feed and food industry.However,there are no research reports on patents distribution of phytase technology.Here,we analyze patents application situation associated with phytase at home and abroad from the aspects of trends in patents application,nation and applicant distribution of phytase patents and we also introduce the current status of phytase patents technology,so as to provide some references for the relevant enterprises and research institutions in China.
phytase;feed;patent analysis
G306;S816.7
A文章順序編號:1672-5190(2016)08-0058-05
2016-07-10
黃利(1984—),男,助理研究員,碩士,主要從事發(fā)明專利實質(zhì)審查和專利分析工作。
(責(zé)任編輯:趙俊利)