陳晨輝，趙自葉，徐進(jìn)，曹雪松，郭尚敬，李軍，王皓，侯盛

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重組人心房利鈉肽(ANP) 的原核表達(dá)、純化及鑒定

陳晨輝1,4*，趙自葉2,6*，徐進(jìn)4,6，曹雪松2,6，郭尚敬3,6，李軍3,6，王皓5,6，侯盛5,6

1 同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 200092 2 聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東聊城 252000 3 聊城大學(xué)藥學(xué)院，山東聊城252000 4 上海張江生物技術(shù)有限公司，上海 201203 5 第二軍醫(yī)大學(xué)腫瘤研究所，上海 200433 6 抗體藥物與靶向治療國家重點實驗室，上海 201203

為提高重組人心房利鈉肽(Atrial natriuretic peptide，ANP) 的表達(dá)量，將3個ANP通過賴氨酸 (Lysine，K) 串聯(lián)，并構(gòu)建相對應(yīng)的重組表達(dá)載體pET28a(+)/ANP3。轉(zhuǎn)染大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，目的蛋白約占菌體總蛋白的60%。經(jīng)過包涵體變復(fù)性，賴氨酸酶 (Lys-C) 和羧肽酶 (CPB) 水解，以及一系列層析純化，每升培養(yǎng)液可獲得約16 mg的ANP蛋白。最終，純化后的ANP經(jīng)UPLC及Tricine SDS-PAGE鑒定，純度大于90%，LC-MS鑒定顯示其分子量為3 080 Da，且為二硫鍵正確形成的ANP單體，通過ELISA試劑盒檢測，其具有和參比品一致活性。本研究為ANP的大規(guī)模制備打下了基礎(chǔ)。同時，所采用的串聯(lián)表達(dá)技術(shù)也為其他多肽類藥物的重組表達(dá)提供了新的思路。

心房利鈉肽，串聯(lián)表達(dá)，多肽純化

人心房利鈉肽 (ANP) 是由人心房肌細(xì)胞分泌的一種小肽激素，由28個氨基酸組成，其中的17個氨基酸通過一對二硫鍵連接形成閉合環(huán)，而氨基端和羧基端分別有6個和5個氨基酸組成的短鏈 (圖1)。研究表明，ANP具有舒張血管、降低血壓、增加血管通透性以及利鈉、利尿等作用[1]，并能對抗腎素-血管緊張-醛固酮系統(tǒng)，在調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)[2-4]和鹽水代謝平衡中也發(fā)揮著重要的作用[5-6]。目前，重組人心房利鈉肽[7]，主要用于心力衰竭的治療[8-10]。

圖1 ANP的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)圖[1]

作為多肽類藥物，ANP因分子量較小，目前主要采用化學(xué)合成的方法和重組表達(dá)進(jìn)行大規(guī)模制備。然而，基因重組表達(dá)技術(shù)的發(fā)展，尤其是串聯(lián)表達(dá)技術(shù)開發(fā)為多肽的制備提供了另一種選擇方案[5-8]。為提高ANP的表達(dá)量，降低重組表達(dá)成本，本研究采用3個ANP基因進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)的模式，首次在大腸桿菌中重組表達(dá)融合蛋白His6-K-ANP-K-ANP-K-ANP(His6-ANP3)，其中在ANP與融合標(biāo)簽以及ANP之間均加入賴氨酸K。串聯(lián)融合蛋白在經(jīng)過變復(fù)性，Lys-C (Endoproteinase Lys-C) 和CPB (Carboxypeptidase B)酶切后，經(jīng)過層析純化，可得到正確形成二硫鍵內(nèi)肽環(huán)的單體ANP。經(jīng)Tricine-SDS-PAGE[15]和HPLC鑒定，蛋白純度大于90%，LC-MS結(jié)果顯示目的蛋白為單體ANP且無明顯氧化及脫氨基修飾。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒及菌株

大腸桿菌TG1、BL21 (DE3) 及質(zhì)粒pET28a(+)為本實驗室保存，pGEM-T vector購自Promega公司。

1.1.2 基因合成及引物設(shè)計

由Invitrogen公司全基因合成含3個通過賴氨酸K連接的串聯(lián)ANP基因序列 (每個片段 84 bp)，即pMD18-T/ANP3，并設(shè)計引物：正向引物(5′–3′)GACGACGACGACAAGTCT (含DDDDK，以利于復(fù)性后蛋白標(biāo)簽的酶切去除)，限制性酶切位點是Ⅰ；反向引物為(5′–3′)CTATCATTAGTAGCGAAAGGAGTTACAGC，限制性酶切位點是dⅢ。

1.1.3 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、DNA Marker 2000、λ-d III digest DNA Marker購自TaKaRa公司。T4 DNA 連接酶、Go-Green Master Mix購自Promega公司。ANP標(biāo)準(zhǔn)品購自Chinese Peptide Company。蛋白Marker購自Thermo Scientific公司。瓊脂糖購自Amresco公司。胰蛋白胨、酵母提取物購自O(shè)xoid公司。色譜級乙腈、質(zhì)譜級甲酸購自Sigma公司。色譜級三氟乙酸購自TEDIA公司。Ni2+層析填料購自美國GE Healthcare公司。Nuvia S層析填料購自美國Bio-Rad公司。ACQUITY UPLC BEH C18 Column (1.7 μm，2.1 mm×100 mm)、ACQUITY UPLC BEH300 C4 (1.7 μm，2.1 mm×50 mm) 均購自美國Waters公司。Human ANP (h-ANP) ELISA Kit (檢測范圍：20?480 pg/mL) 購自上海酶研生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

超純水，Milli-Q系統(tǒng)：Millipore公司產(chǎn)品；AKTA Purifier純化儀：GE公司；串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜儀Xevo G2-S QTof：Waters公司；超高效液相色譜層析系統(tǒng)，Acquity UPLC H-Class Bio系統(tǒng)：Waters公司；多功能酶標(biāo)儀，SpectraMax M5，Molecular Devices。

1.3 方法

1.3.1 pET28a(+)/ANP3原核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

以全基因合成的pMD18-T/ANP3克隆質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增獲得含有限制性內(nèi)切酶Ⅰ和dⅢ酶切位點的目的基因片段。2%瓊脂糖凝膠電泳后，切膠純化回收目的DNA片段，并將回收片段與載體pGEM-T-Vector 連接，轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞，利用質(zhì)粒DNA抽提試劑盒提取質(zhì)粒后酶切鑒定，并測序鑒定；再用Ⅰ和dⅢ從測序正確的T載體上切下目的片段，2%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收目的片段，與經(jīng)過同樣酶切的表達(dá)載體pET28a(+) 連接，轉(zhuǎn)化TG1，然后挑克隆，提取質(zhì)粒，再進(jìn)行酶切鑒定，選一個鑒定正確的質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21 (DE3)，最后鑒定并保存正確的種子菌株。

1.3.2 ANP3重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化

將菌液pET28a(+)/ANP3BL21 (DE3) 接種于5 mL LB培養(yǎng)基中37 ℃振蕩過夜，按1∶50體積比擴(kuò)大培養(yǎng)，在600值達(dá)到0.6?1.0后，分別加入不同終濃度的IPTG，在25 ℃、37 ℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)4 h，取樣處理，進(jìn)行15% SDS-PAGE電泳分析，確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。

1.3.3 ANP3重組蛋白包涵體變性、復(fù)性、純化及鑒定

根據(jù)最佳優(yōu)化條件培養(yǎng)菌體，離心收集菌體，并用1×PBS緩沖液充分懸浮，于冰上超聲破碎菌體 (超聲2 s，間隙6 s，360 W功率， 30 min)，離心 (9 000 r/min，30 min) 棄上清，獲得包涵體。包涵體變性處理 (變性液：8 mol/L尿素+20 mmol/L Tris，pH 8.0)：包涵體稱重，溶解，離心，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。初步純化：首先用Ni+親和色譜柱純化 (平衡液：20 mmol/L PB +500 mmol/L 氯化鈉+20 mmol/L 咪唑+ 8 mol/L尿素，pH 7.4；洗脫液：20 mmol/L PB+ 500 mmol/L氯化鈉+500 mmol/L咪唑+8 mol/L 尿素，pH 7.4)，UV280波長檢測，收集洗脫峰；然后使用Sephadex G25脫鹽柱將所得主峰置換至Tris尿素緩沖液中 (20 mmol/L Tris+8 mol/L 尿素，pH 7.5)，UV280波長檢測。復(fù)性處理 (復(fù)性液：100 mmol/L醋酸+0.2%聚山梨酯80，pH 3.0，4 ℃提前預(yù)冷)：按照一定的體積比例 (1∶25)進(jìn)行稀釋復(fù)性，4 ℃放置過夜。調(diào)節(jié)復(fù)性液pH，利用蛋白酶Lys-C進(jìn)行酶切，然后采用陽離子交換Nuvia S進(jìn)行純化，UV215波長檢測，獲得ANP單體蛋白以及末端含K的ANP蛋白；再將末端含賴氨酸K的ANP洗脫峰調(diào)節(jié)pH至中性，利用羧肽酶CPB進(jìn)行酶切，再次采用陽離子交換柱NuviaS純化，UV215波長檢測，獲得單體蛋白ANP。最后，利用12% Tricine-SDS-PAGE、UPLC-C18反相檢測柱以及LC-MS分析和鑒定各純化階段的蛋白。

1.3.4 UPLC-C18反相檢測

以標(biāo)準(zhǔn)品作為參照，用ACQUITY UPLC BEH C18 Column (1.7 μm，2.1 mm×100 mm) 色譜柱以超純水-0.1%甲酸為流動相A，乙腈-0.1%甲酸為流動相B，15%?90% B液進(jìn)行15 min梯度洗脫，流速0.4 mL/min，上樣量10 μL，檢測波長設(shè)置為214 nm及280 nm。

1.3.5 質(zhì)譜分析目的蛋白ANP以及含K的ANP片段

將末端含賴氨酸K的ANP洗脫峰 (Nu-E4)，即酶切前以及CPB酶切后的樣品置換緩沖液至碳酸氫銨 (50 mmol/L，pH 7.8) 中，通過UPLC-ESI-Q-TOF技術(shù)對其進(jìn)行質(zhì)量分析。用ACQUITY UPLC BEH300 C4 (1.7 μm， 2.1 mm×50 mm) 反相柱，以10%乙腈-1% 甲酸為流動相A，乙腈為流動相C，10%?30% 流動相C 進(jìn)行10 min梯度洗脫，流速0.3 mL/min，上樣量為2 μL。

1.3.6 ELISA分析檢測

首先將ANP參比品 (960 pg/mL)以2倍比進(jìn)行稀釋，即：960、480、240、120、60、30 pg/mL。再將純化獲得的樣品ANP利用樣品稀釋液稀釋至960 pg/mL，然后再以2倍比進(jìn)行稀釋樣品。分別以50 μL/孔體積加樣，同時設(shè)置空白孔； 37 ℃溫育30 min；用洗滌液重復(fù)洗板5次，拍干；加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外；37 ℃再溫育30 min；洗板；顯色10 min；終止反應(yīng)；450 nm波長測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pET28a(+)/ANP3構(gòu)建

以pMD18-T/ANP3克隆質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增含ANP3的目的片段，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約250 bp處可見擴(kuò)增產(chǎn)物，大小與預(yù)期相符。然后與pET28a(+)載體連接，用Ⅰ和d Ⅲ雙酶切鑒定，結(jié)果表明重組原核表達(dá)載體pET28a(+)/ANP3構(gòu)建成功 (圖2)。

圖2 重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)/ANP3的構(gòu)建

2.2 重組ANP3的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

pET28a(+)/ANP3/BL21菌液在擴(kuò)大培養(yǎng)后600為0.6?1.0，經(jīng)0.025 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，15% SDS-PAGE結(jié)果顯示在分子量約14 kDa誘導(dǎo)出目的蛋白 (圖3，箭頭指示位置)，與理論值相符，并確定最佳誘導(dǎo)條件為：0.025 mmol/L的IPTG，溫度37 ℃，時間4 h。通過搖瓶培養(yǎng)，將重組蛋白依次經(jīng)過變復(fù)性酶切及進(jìn)一步層析純化，可獲得約3 kDa的目的蛋白，其純度可達(dá)到90%以上 (圖4)，最終每升搖瓶菌液可獲得約16 mg目的蛋白。后期我們可嘗試使用10 μm C18制備填料進(jìn)行純化，緩沖液及梯度條件同分析條件，可以將蛋白純度進(jìn)一步提高。

圖3 誘導(dǎo)溫度及時間對重組蛋白ANP3表達(dá)量的影響

圖4 重組蛋白ANP3純化圖及12%Tricine-SDS-PAGE分析

2.3 UPLC-C18反相檢測目的蛋白

包涵體復(fù)性液調(diào)節(jié)pH至6.5，以質(zhì)量比1∶50加入蛋白酶Lys-C，4 ℃酶切2 h后，0.45 μm濾膜過濾，即為組分[1]上樣液sample，然后進(jìn)行第一次陽離子交換柱Nuvia S純化，分別收集洗脫峰，第一個峰為[2]雜質(zhì)峰 (Nu-E1)，第二個峰為[3]雜質(zhì)峰 (Nu-E2)，第三個為目的峰[4] ANP單體 (Nu-E3)，第四個峰為目的峰[5]末端含K的ANP片段 (Nu-E4)，以濃度為0.1 mg/mL的ANP標(biāo)準(zhǔn)品[6]作為參照，利用反相UPLC-C18進(jìn)行檢測 (圖4C；圖5A、B)。

圖5 UPLC-C18檢測蛋白酶LysC酶切重組蛋白ANP3色譜圖

2.4 質(zhì)譜分析目的蛋白ANP以及含K的ANP片段

2.4.1 ANP二硫鍵內(nèi)肽環(huán)的鑒定

對于末端含賴氨酸K的ANP片段(Nu-E4)，調(diào)節(jié)pH至中性 (pH 7.65)，按酶與蛋白1∶800的質(zhì)量比，室溫酶切反應(yīng)2 h，樣品處理后，利用LC-ESI-TOF質(zhì)譜檢測，結(jié)果如下：圖6A顯示酶切反應(yīng)后可獲得質(zhì)荷比為3 079.469 2的ANP單體，與標(biāo)準(zhǔn)品ANP大小一致；圖6B表明還原后的目的蛋白分子量比未還原的目的蛋白大2 Da，與理論分子量一致，說明目的蛋白ANP單體中存在完整的二硫鍵，即初步判斷純化獲得的ANP單體具有較為完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

圖6 含K的ANP(Nu-E4)及CPB酶切后的質(zhì)譜鑒定圖(TIC)

2.4.2 CPB非特異性酶切鑒定

經(jīng)常規(guī)CPB酶切條件酶切后，通過質(zhì)譜計算，發(fā)現(xiàn)CPB也存在非特異性酶切，酶切位置分別位于ANP序列C端的CNSF|RY與CNS|FRY處，對應(yīng)質(zhì)荷比分別為2 760.306 2和2 613.229 2 (圖6B)。故為了提高目的蛋白的得率，需要對CPB酶切條件進(jìn)行優(yōu)化，從而減少非特異性酶切。

2.4.3 CPB酶切條件優(yōu)化后的UPLC-C18檢測

通過減少酶切時間或酶用量，CPB與目的蛋白以1∶2 000質(zhì)量比，室溫，酶切2 h反應(yīng)后，非特異性酶切顯著降低 (圖7A)，0.45 μm濾膜進(jìn)行過濾，即為組分[3]上樣液sample，其中[2] 為CPB酶切前的樣品，然后再利用第二次陽離子交換柱Nuvia S純化，首先組份[4]為過柱流出液FT (Flow through)，再分別收集洗脫峰，第一個峰為[5]雜質(zhì)峰 (Nu-1E)，第二個峰為[6]雜質(zhì)峰 (Nu-2E)，第三個為目的峰[7] ANP單體 (Nu-3E)，以[1]標(biāo)準(zhǔn)品ANP (0.1 mg/mL) 作為參照，利用反相UPLC-C18進(jìn)行檢測 (圖4D；圖7A、B)。結(jié)果顯示：以CPB與Nu-E4按1∶2 000質(zhì)量比進(jìn)行酶切反應(yīng)的條件適中，收集到的目的峰為Nu-3E。

圖7 UPLC-C18檢測蛋白酶CPB酶切含K的ANP色譜圖

3 ELISA檢測

通過450 nm波長依序測量各孔的吸光度 (值)，4參數(shù)回歸擬合作圖 (圖8)。結(jié)果顯示本研究表達(dá)純化的ANP單體蛋白與ANP參比品具有相似的活性。從另一方面證明了所表達(dá)的ANP與參比品具有一致的抗原識別表位。

圖8 ELISA檢測目的蛋白ANP

4 討論

心房利鈉肽 (ANP) 是目前用于心力衰竭治療的一種多肽類藥物，其對于防止高血壓、心腎等相關(guān)疾病的治療方面[16-21]以及抗腫瘤的作 用[14,22]方面具備良好的應(yīng)用前景。由于直接重組表達(dá)小肽藥物的表達(dá)量低、穩(wěn)定性差及容易降解等性質(zhì)，ANP及其他多肽的制備目前仍以體外多肽合成為主。本研究采用多拷貝基因串聯(lián)表達(dá)的方式進(jìn)行ANP制備。在目的基因與融合標(biāo)簽 (His6-tag) 間以及各拷貝基因之間均有賴氨酸 (K)作為linker，即可以被限制性Lys-C酶切。而CPB的使用，則可以進(jìn)一步水解去除ANP羧基端殘留的K。新構(gòu)建的表達(dá)載體His6-ANP3在大腸桿菌中可實現(xiàn)高效表達(dá)，并產(chǎn)生大量包涵體。同時，可以使用His標(biāo)簽進(jìn)行初步的純化，在包涵體的變性及復(fù)性條件優(yōu)化后，ANP的得率明顯提升，但對于表達(dá)量占菌體約60%的包涵體進(jìn)行復(fù)性純化，后續(xù)仍有較大的提升空間。我們在前期的探索性研究階段也嘗試過串聯(lián)1個、2個及3個ANP在pET22b(+) 中進(jìn)行表達(dá)，但是經(jīng)過誘導(dǎo)后，包涵體含量為3個串聯(lián)的最多，1個及2個串聯(lián)表達(dá)量比較低；隨后換成pET28a(+) 后，3個串聯(lián)的表達(dá)量得到了進(jìn)一步提高，考慮到這種情況，我們在最終表達(dá)質(zhì)粒的選擇上使用了3個串聯(lián)表達(dá)。因此，在表達(dá)量方面也許存在更進(jìn)一步的優(yōu)化空間。

在本研究中，還發(fā)現(xiàn)CPB在酶切末端含賴氨酸K的ANP片段時存在非特異酶切，且這一現(xiàn)象可在優(yōu)化酶切條件后得以改善，同時非特異性酶切的片段可以經(jīng)過優(yōu)化后續(xù)純化予以去除。同時，在使用CPB時需要嚴(yán)格控制酶切比例及時間，減少由于非特異酶切帶來的蛋白損失。

此外，UPLC及質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用，可實現(xiàn)對小分子藥物序列及結(jié)構(gòu)進(jìn)行快速準(zhǔn)確的初步鑒定。ANP中由兩個半胱氨酸所形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)以及羧基端的氨基酸殘基對于維持其生物活性起到至關(guān)重要的作用[23]，因此十分有必要采用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行精確的分子量鑒定，以此來確定ANP結(jié)構(gòu)及序列的正確性，同時也可以對蛋白的降解、氧化及脫氨基予以鑒定。在后續(xù)的研究中，我們將對得到的ANP單體進(jìn)行大鼠體內(nèi)降壓、利尿、體外舒張血管等相關(guān)的實驗[13,24-26]，并在純化工藝及鑒定方法上進(jìn)一步優(yōu)化，以用于大規(guī)模生產(chǎn)。

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(本文責(zé)編郝麗芳)

Prokaryotic expression, purification and identification of recombinant human atrial natriuretic peptide

Chenhui Chen1,4*, Ziye Zhao2,6*, Jin Xu4,6, Xuesong Cao2,6, Shangjing Guo3,6, Jun Li3,6, Hao Wang5,6, and Sheng Hou5,6

1,,200092,2,,252000,,3,,252000,,4,201203,5,,200433,State Key Laboratory of Antibody Medicine and Targeted TherapyShanghaiChina

In order to improve the expression of recombinant human atrial natriuretic peptide (ANP), a new plasmid (pET28a(+)/ANP3) containing 3 tandem ANP genes with lysine codon as the interval linker, was constructed. Target gene was transformed intoBL21 (DE3) and induced by IPTG, about 60% of the total-cell-protein was the target protein, His6-ANP3. After denaturation and refolding, it was digested by Endoproteinase Lys-C and Carboxypeptidase B (CPB) and then purified by a series of purification processes, about 16 mg purified ANP monomer could be obtained from one liter bacteria broth of shaking culture. Ultimately, the purity of protein was above 90% determined by UPLC and Tricine SDS-PAGE, its molecular weight was 3 080 Da according to LC-MS identification and it was proved to be equivalent to the reference product by ELISA. The use of tandem gene expression can provide a new possible model for the expression of other peptide drugs.

atrial natriuretic peptide, tandem expression, peptides purification

January 10, 2016; Accepted:March 24, 2016

Sheng Hou. Tel: +86-21-60129276; Fax: +86-21-60129270; E-mail: sheng.hou@sinomabtech.com *These authors contributed equally to this study.

Supported by:National High Technology Research and Development Program (863 Program) (No. 2014AA021004), State Key Project of drug for New Drug Development (Nos. 2013ZX09101021, 2013ZX09401303), Shanghai Commission of Science and Technology (Key laboratory and Projects) (Nos. 13DZ1930100, 14DZ2272300), Shanghai Excellent Technical Leader (No. 13XD1424000), Shanghai Key Technologies R&D Program of Biological Medicine (No. 15431906100), Shanghai Key Decipline Fund (No. B905).

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃) (No. 2014AA021004)，國家新藥創(chuàng)制重大專項 (Nos. 2013ZX09101021, 2013ZX09401303)，上海市重點實驗室(Nos. 13DZ1930100, 14DZ2272300)，上海市優(yōu)秀學(xué)術(shù)帶頭人(No. 13XD1424000)，上海市生物醫(yī)藥領(lǐng)域科技支撐項目(No. 15431906100)，上海市重點學(xué)科基金(No. B905) 資助。

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