葉雙雙，周麗，周哲敏

?

定點(diǎn)突變提高苯丙氨酸羥化酶的熱穩(wěn)定性

葉雙雙，周麗，周哲敏

江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122

嗜熱菌中，蛋白質(zhì)存在Ala替換Gly以及Arg替換Lys的趨勢(shì)。為了提高紫色色桿菌來(lái)源的苯丙氨酸羥化酶的熱穩(wěn)定性，將該酶中所有Gly突變成Ala，Lys突變成Arg，篩選獲得熱穩(wěn)定性提高的突變體，并進(jìn)行組合突變，對(duì)突變酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，突變酶K94R和G221A在50 ℃的半衰期分別為 26.2 min、16.8 min，比原始酶 (9.0 min) 分別提高了1.9倍、0.9倍，同時(shí)組合突變酶K94R/G221A在50 ℃處理1 h后仍保留65.6%的酶活，比原始酶 (8.6%) 高出6.6倍。圓二色譜結(jié)果顯示原始酶和突變酶K94R、G221A及K94R/G221A的m值分別為51.5 ℃、53.8 ℃、53.1 ℃和54.8 ℃。蛋白三維結(jié)構(gòu)模擬推測(cè)突變體熱穩(wěn)定性提高機(jī)理為：突變體K94R中Arg94與Ile95之間形成額外氫鍵，穩(wěn)定其所在的柔性區(qū)域；突變體G221A中Ala221與Leu281產(chǎn)生疏水作用，穩(wěn)定酶分子C-端柔性區(qū)。該研究結(jié)果為蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性改造提供了參考，也為苯丙氨酸羥化酶在功能性食品領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

苯丙氨酸羥化酶，熱穩(wěn)定性，定點(diǎn)突變，丙氨酸突變，精氨酸突變

苯丙氨酸在人體中主要代謝途徑是通過(guò)苯丙氨酸羥化酶 (Phenylalanine hydroxylase，PAH，EC 1.14.16.1) 的催化生成酪氨酸。若人體苯丙氨酸羥化酶存在缺陷，將導(dǎo)致血液中苯丙氨酸含量升高，最終形成苯丙酮尿癥[1]( Phenylketonuria，PKU)。目前，國(guó)際上苯丙酮尿癥的臨床治療方法都是攝入低苯丙氨酸食品或人工合成營(yíng)養(yǎng)食品[2]。這種治療方式雖然能在一定程度上控制苯丙酮尿癥，但是也會(huì)導(dǎo)致患者其他營(yíng)養(yǎng)素缺乏[3-6]。如果能將苯丙氨酸羥化酶添加到食物中，直接催化苯丙氨酸生成酪氨酸，可有效控制血液中苯丙氨酸含量，同時(shí)不影響其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝入。

苯丙氨酸羥化酶是一種非血紅素鐵單加氧酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，是苯丙氨酸代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶和限速酶?？蒲泄ぷ髡邔?duì)多種來(lái)源的苯丙氨酸羥化酶進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與其他來(lái)源的苯丙氨酸羥化酶相比，紫色色桿菌來(lái)源的苯丙氨酸羥化酶 (CvPAH) 具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單[7]、與人類來(lái)源苯丙氨酸羥化酶催化區(qū)域幾乎完全一致[8]、能夠在人體溫度和pH條件下催化苯丙氨酸羥化反應(yīng)[7,9]、催化活性及穩(wěn)定性高[7]等特點(diǎn)。至2013年，Yew等[10]已通過(guò)紅細(xì)胞封裝的手段將CvPAH導(dǎo)入正常小鼠中，并降低小鼠血液中苯丙氨酸的水平，為其在功能食品領(lǐng)域的運(yùn)用提供了參考。

本研究室在前期研究中，從紫色色桿菌中提取基因，實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中高效表達(dá)，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)地研究[9]。結(jié)果表明該酶在37 ℃、pH 7.5時(shí)活性高于其他來(lái)源的苯丙氨酸羥化酶。然而該酶在高溫條件下迅速失活，增加了其醫(yī)藥應(yīng)用的成本。因此，提高CvPAH的熱穩(wěn)定性對(duì)其應(yīng)用至關(guān)重要。

定向進(jìn)化能夠通過(guò)引入隨機(jī)突變提高酶的熱穩(wěn)定性，但是該方法需要構(gòu)建足夠大的突變體庫(kù)，因此往往消耗大量的人力、物力及財(cái) 力[11–12]；計(jì)算機(jī)模擬設(shè)計(jì)也能提高蛋白熱穩(wěn)定性，然而影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的因素復(fù)雜，大大降低計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性[13]；基于B-factor的進(jìn)化策略能夠降低酶局部的柔性達(dá)到降低酶的熱穩(wěn)定性的目的，但是該方法需要建立在獲得晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上[12]，限制了該方法的應(yīng)用。影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的因素眾多[14-20]，蛋白質(zhì)的氨基酸組成與其熱穩(wěn)定性關(guān)系密切。如果能夠以蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，建立提高酶熱穩(wěn)定性的方法，不僅避免了高級(jí)結(jié)構(gòu)的限制，還能快速準(zhǔn)確地獲得突變體。

1979年，Argos等[21]對(duì)嗜熱蛋白和嗜中溫蛋白氨基酸組成進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于嗜中溫蛋白，嗜熱蛋白中氨基酸序列中有如下替換趨勢(shì)：即甘氨酸 (Glycine，Gly) 替換為丙氨酸 (Alanine，Ala)，賴氨酸 (Lysine，Lys) 替換為精氨酸 (Arginine，Arg)。Zhang 等[22]在T4溶菌酶中介入了單個(gè)或多個(gè)Ala突變，有效提高該酶的熱穩(wěn)定性。此外，Mrabet等[23]利用將Lys突變成Arg的策略有效提高木聚糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性。然而，尚未見將Ala和Arg突變策略組合的研究，以及應(yīng)用上述策略提高PAH熱穩(wěn)定性的研究。

本實(shí)驗(yàn)選取CvPAH上所有的Gly及Lys，分別突變成Ala和Arg，構(gòu)建突變體，篩選熱穩(wěn)定性提高的突變酶，進(jìn)一步進(jìn)行組合突變，并研究突變體的酶學(xué)性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基

菌種：大腸桿菌JM109、BL21 (DE3) 購(gòu)自Novangen公司，BL21 (DE3)/pET24a-由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存[9]。

LB培養(yǎng)基 (g/L)：胰蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，瓊脂粉20 (配制固體培養(yǎng)基)。

2YT培養(yǎng)基 (g/L)：胰蛋白胨16，酵母膏10，NaCl 10，瓊脂粉20 (配制固體培養(yǎng)基)。

1.1.2 工具酶和生化試劑

工具酶、DNA Marker和Protein Marker購(gòu)自寶生物工程 (大連) 有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；膠回收試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自東洋紡 (上海) 生物科技有限公司；引物由上海生物工程公司合成；酵母提取物、蛋白胨購(gòu)自 Oxford 公司；IPTG、卡那霉素購(gòu)自上海生物工程公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 突變位點(diǎn)選擇及引物設(shè)計(jì)

根據(jù)嗜熱蛋白對(duì)Ala的偏好性明顯高于Gly、對(duì)Arg的偏好性高于Lys的特點(diǎn)，選取CvPAH上所有Gly和Lys分別突變成Ala和Arg。根據(jù)GenBank提供的CvPAH基因序列 (Gene ID：AF146711)，以重組質(zhì)粒pET24a-為模板，用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物 (表1)。

表1 本文所用引物及序列

續(xù)表1

G290A upTGCCGGCGACCGCCAAGCCTGGGCGGATACC31 G290A downCTTCGGTATCCGCCCAGGCTTGGCGGTCGC C31 K16R upCCGACATCACCACCCGCCGCAATGTCGGACTG32 K16R downGGCTCAGTCCGACATTGCGGCGGGTGGTGATG32 K53R upGTACCAGCGCCAATGCCGCCTGCTGCCCGGC31 K53R downCGCGGCCGGGCAGCAGGCGGCATTGGCGCTG31 K82R upGGTGCCGGACTTCAATCGCCTCAACGAGAAG31 K82R downTCAGCTTCTCGTTGAGGCGATTGAAGTCCGG31 K86R upCAATAAGCTCAACGAGCGCCTGATGGCCGCC31 K86R downCGGTGGCGGCCATCAGGCGCTCGTTGAGCTT31 K94R upGGCCGCCACCGGCTGGAGGATCGTCGCGGTG31 K94R downCCGGCACCGCGACGATCCTCCAGCCGGTGGC31 K161R upCCTGGAGGCCTACGGCCGCGGCGGGGTGAAG31 K161R downTCGCCTTCACCCCGCCGCGGCCGTAGGCCTC31 K165R upCGGCAAGGGCGGGGTGCGCGCGAAGGCGCTG31 K165R downCGCCCAGCGCCTTCGCGCGCACCCCGCCCTTG32 K167R upGGGCGGGGTGAAGGCGCGCGCGCTGGGCGCG31 K205R upCGGCATCTTGTCCAGCCGCTCGGAATCCATC31 K205R downAGTAGATGGATTCCGAGCGGCTGGACAAGATG32 K239R upGATCGACACCTTCCAGCGCACCTACTTCGTC31 K239R downCGATGACGAAGTAGGTGCGCTGGAAGGTGTC31 K248R upCGTCATCGACAGCTTCCGGCAGCTGTTCGAC31 K248R downTGGCGTCGAACAGCTGCCGGAAGCTGTCGATG32

The mutation sites are underlined.

1.2.2 突變體的構(gòu)建

PCR反應(yīng)體系：10 μL 5×PrimeSATAR Buffer (5 mmol/L Mg2+plus)，4 μL濃度的dNTPs (2.5 mmol/L each)，1 μL上游引物 (10 mmol/L)，1 μL下游引物 (10 mmol/L)，1 μL模板pET24a-，0.5 μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase，超純水補(bǔ)至50 μL。

PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性1 min，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸6.5 min，25個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。

用Ⅰ消化PCR模板 (在37 ℃下反應(yīng)1 h)，再進(jìn)行純化，獲得帶有突變基因的質(zhì)粒。將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM109，涂布含有卡那霉素 (50 mg/L) 的抗性平板，篩選獲得陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3)。

1.2.3 突變酶的表達(dá)與純化

從平板上挑取突變菌種的單菌落，分別接種至5 mL含有卡那霉素 (50 mg/L) 的LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。取1 mL培養(yǎng)液接種至100 mL含有卡那霉素 (50 mg/L) 的2YT培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至菌濃度達(dá)到600= 0.6，加入終濃度0.6 mmol/L的IPTG，誘導(dǎo)表達(dá)24 h。

離心收集菌體，用適當(dāng)體積20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5) 重懸后用超聲破碎儀破碎 (工作3 s，停7 s)，離心(12 000 ×，4 ℃，30 min)取上清液， 0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，使用HiTrapTM1 mL DEAE FF于AKATA pure層析系統(tǒng)中純化蛋白，純化方法參見文獻(xiàn)[9]。采用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度[10]。

1.2.4 CvPAH酶活測(cè)定

CvPAH酶液稀釋至0.5 mg/mL，取50 μL加到250 μL 100 mmol/L HEPES (pH 7.5) 緩沖液中，然后在該體系中加入50 μL濃度為 10 mmol/L的L-苯丙氨酸 (L-phe)、50 μL濃度為50 mmol/L的DTT、50 μL濃度為50 μmol/L FeSO4、50 μL濃度為2 mmol/L的DMPH4，37 ℃反應(yīng)10 min，加入500 μL甲醇終止反應(yīng)。15 000 ×離心30 min，取上清，用0.22 μm微孔有機(jī)濾膜過(guò)濾，利用HPLC檢測(cè)產(chǎn)物生成量，計(jì)算酶活[9]。CvPAH活性測(cè)定反應(yīng)體系見表2。

表2 CvPAH酶活測(cè)定反應(yīng)體系

1.2.5 突變酶最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性測(cè)定

最適反應(yīng)溫度：根據(jù)表2的反應(yīng)體系，將突變酶分別置于20 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、60 ℃條件反應(yīng)10 min，測(cè)定殘余酶活。

溫度穩(wěn)定性：突變酶在50 ℃水浴中熱處理15 min、30 min、45 min、60 min，立刻冰浴30 min。

根據(jù)表2配制反應(yīng)體系，迅速振蕩混勻，置于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)10 min，測(cè)定殘余酶活。

1.2.6 突變酶m值測(cè)定

用圓二色譜儀測(cè)定原始酶及突變酶m。溫度范圍為35–70 ℃，0.1 mg/L蛋白樣溶于 20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)，在222 nm的波長(zhǎng)條件下測(cè)定。用軟件Origin 8.0進(jìn)行平滑處理。

1.2.7 突變酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

以不同濃度 (0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L) L-phe為底物，在37 ℃、pH 7.5的條件下反應(yīng)3 min，測(cè)定突變酶的初始反應(yīng)速率。利用軟件GraphPad Prism 5進(jìn)行非線性擬合，計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù) (max、m、cat和catm)。

1.2.8 突變酶的結(jié)構(gòu)分析

取0.2 mg/mL蛋白溶解于20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5) 中，使用圓二色譜分析儀，掃描波長(zhǎng)從190–250 nm，檢測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

以CvPAH (PDB ID：1LTZ) 為模板，利用SWISS-MODEL對(duì)突變酶進(jìn)行同源建模。利用Pymol軟件對(duì)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變位點(diǎn)保守性分析

為了比較CvPAH中Gly和Lys的保守性，從動(dòng)物和植物中分別選取人苯丙氨酸羥化酶 (hPAH)和綠藻苯丙氨酸羥化酶 (CrPAH)，與CvPAH進(jìn)行序列比對(duì) (圖1)。結(jié)果表明，CvPAH氨基酸序列中有19個(gè)Gly，其中有7個(gè)保守位點(diǎn)，分別是92、100、142、160、186、198和200位；有11個(gè)Lys，并且都不保守。

圖1 紫色色桿菌PAH與人和綠藻PAH氨基酸序列比對(duì)

2.2 突變體篩選

用粗酶液初步測(cè)定突變酶相對(duì)酶活和熱穩(wěn)定性。相對(duì)酶活 (圖2中A、B) 表明，Lys突變?yōu)锳rg對(duì)酶活影響較小，除了K86R酶活降至原始酶的45.5%，其余酶的相對(duì)酶活均保持在50%以上。Gly突變成Ala對(duì)CvPAH活性影響較大，其中G100A、G198A和G200A的酶活分別降至原始酶的10.4%、24.4%和28.1%。根據(jù)晶體結(jié)構(gòu) (數(shù)據(jù)未顯示) 分析可知G198和G200均處于活性中心周圍，對(duì)酶的活性部位的微環(huán)境有較大的影響，而G100直接參與輔酶 (6,7-dimethyltetrahydropterin，DMPH4)的結(jié)合，突變后直接影響輔酶結(jié)合，降低酶活。

圖2 突變酶相對(duì)酶活

選取Gly突變成Ala后相對(duì)酶活保持在50%以上的突變酶和所有由Lys突變成Arg的突變酶初步測(cè)定熱穩(wěn)定性 (在50 ℃保溫，測(cè)定15 min、30 min時(shí)的酶活保留率)。圖3表明，大部分突變酶的熱穩(wěn)定性下降或影響較小，只有G221A、K94R熱穩(wěn)定性明顯提高。因此，后續(xù)對(duì)G221A、K94R和組合突變酶K94R/G221A展開研究。

圖3 突變酶熱穩(wěn)定性

對(duì)各突變位點(diǎn)在晶體結(jié)構(gòu)中所處的位置進(jìn)行比較分析，Gly分布為：19、57、92、100、170、186、193、198、221、272、274、286、290均位于該酶的柔性區(qū)，66、142、160、162、163、200均位于α-螺旋中，且19、92、170、193、221、272、274、286、290均位于酶分子表面。Lys分布為：所有點(diǎn)均分布在酶分子表面，且94、167、239位于柔性區(qū)，其余位點(diǎn)位于α-螺旋中?？梢?，蛋白表面氨基酸性質(zhì)對(duì)酶的熱穩(wěn)定性影響較大，對(duì)分子表面的柔性區(qū)進(jìn)行改造能有效提高突變位點(diǎn)選擇的效率，大大降低工作量。

2.3 突變酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 突變酶純化

突變酶經(jīng)過(guò)DEAE陰離子柱純化，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè) (圖4)，突變酶的分子量大小與原始酶一致，均在35 kDa左右。

圖4 突變酶純化結(jié)果

2.3.2 突變酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性

突變酶的活性研究結(jié)果表明，K94R、G221A和K94R/G221A的比酶活分別為473.8、413.6和294.3 U/mg，與原始酶 (562.7 U/mg) 相比，分別下降了15.8%、26.5%和47.7%。最適反應(yīng)溫度結(jié)果 (圖5) 表明，突變酶和原始酶均在40 ℃左右達(dá)到最高酶活，隨著溫度升高或降低，酶活均會(huì)降低，其中K94R/G221A在溫度降低過(guò)程中酶活降低速度最慢。

圖5 突變酶最適反應(yīng)溫度

熱穩(wěn)定性對(duì)比分析(圖6) 顯示，在50 ℃處理時(shí)，原始酶的酶活下降速度明顯比突變酶快，尤其在前15 min，原始酶活性迅速喪失，最終只剩25.1%，而突變酶K94R、G221A和K94R/G221A酶活保留率分別達(dá)到65.5%、53.4%和80.2%。K94R和G221A在50 ℃的半衰期分別為26.2 min、16.8 min，比原始酶 (9.0 min)分別提高了1.9倍、0.9倍，同時(shí)K94R/G221A在50 ℃處理1 h后仍保留65.6%的酶活，比原始酶 (8.6%) 高出6.6倍。

圖6 突變酶熱穩(wěn)定性比較

2.3.3 突變酶的m值

通過(guò)圓二色譜儀對(duì)突變酶K94R、G221A、K94R/G221A及原始酶進(jìn)行m測(cè)定，結(jié)果如圖7所示，原始酶的m值約51.5 ℃，而突變酶K94R、G221A及K94R/G221A分別達(dá)到53.8 ℃、53.1 ℃、54.8 ℃。因此，相比較原始酶，突變酶具有更高的耐熱性。

圖7 圓二色譜測(cè)定突變酶Tm值

2.3.4 突變酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

以不同濃度的L-phe為底物，測(cè)定突變酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。如表3所示，與原始酶相比，突變后最大反應(yīng)速率max有所降低，其中K94R/G221A的max最低，降到5.8 μmol/(L·s)。突變酶對(duì)底物的米氏常數(shù)m均有不同程度下降，其中K94R對(duì)L-phe的m最低，為119.3 μmol/L，可見突變酶對(duì)底物的結(jié)合能力均有所提高，同時(shí)cat也有不同程度的下降。最終，催化效率 (catm) 僅略低于原始酶，即該突變對(duì)酶活的影響較小。結(jié)合穩(wěn)定性研究結(jié)果可知，相比原酶，突變酶更具有應(yīng)用價(jià)值。

表3 突變酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.4 突變酶的結(jié)構(gòu)分析

二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果如圖8。突變酶與原始酶α-螺旋特征波長(zhǎng)208 nm和222 nm以及β-折疊特征波長(zhǎng)195 nm和216 nm處的橢圓率沒有顯著差別?？梢奒94R、G221A兩個(gè)位點(diǎn)突變對(duì)酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)幾乎沒有影響。

圖8 突變酶二級(jí)結(jié)構(gòu)

同源建模發(fā)現(xiàn)，突變酶與原始酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)沒有顯著差別，因此對(duì)氨基酸之間成鍵情況進(jìn)行分析。如圖9所示，94位氨基酸位于α-螺旋與β-折疊之間的柔性環(huán)上，由Lys突變成帶有更大側(cè)鏈基團(tuán)的Arg，與Ile95形成額外的氫鍵，有助于穩(wěn)定該環(huán)的結(jié)構(gòu)，從而提高酶的穩(wěn)定性；此外，該位點(diǎn)位于蛋白質(zhì)表面區(qū)域，突變成Arg后胍基能夠與水分子之間形成偶極-電荷作用，使蛋白表面形成水化膜，從而提高蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性[24]。

圖9 位點(diǎn)94突變前(A) 后(B) 三維結(jié)構(gòu)模擬

如圖10所示，Gly221處于柔性區(qū)并且與酶分子的C-端柔性區(qū)接近，Gly沒有側(cè)鏈基團(tuán)，構(gòu)象熵大。突變成Ala后，增加了一個(gè)疏水性基團(tuán) (甲基)，拉近了與酶C-端Leu281的距離，與Leu281疏水側(cè)鏈出現(xiàn)重疊區(qū)域 (圖10)，推測(cè)形成疏水作用[25–26]，不僅增加了柔性環(huán)的穩(wěn)定性，同時(shí)起到錨定C-端柔性區(qū)的作用，提高了突變酶的熱穩(wěn)定性。

圖10 位點(diǎn)22突變前(A) 后(B)三維結(jié)構(gòu)模擬

3 結(jié)論

通過(guò)Gly替換成Ala以及Lys替換成Arg的策略得到2個(gè)突變酶K94R和G221A，其熱穩(wěn)定性較原始酶分別提高了0.9倍和1.9倍。進(jìn)一步對(duì)兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行組合突變，獲得K94R/ G221A，其熱穩(wěn)定性較原始酶提高了6.6倍。圓二色譜數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明突變酶的具有更高的耐熱性。動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果表明，突變酶對(duì)底物的親和力提高了，同時(shí)催化效率僅略低于原始酶。最后，通過(guò)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬發(fā)現(xiàn)，K94R和G221A分別通過(guò)形成氫鍵和增強(qiáng)局部疏水作用提高了酶的熱穩(wěn)定性。

REFERENCES

[1] Flydal MI, Martinez A. Phenylalanine hydroxylase: function, structure, and regulation. IUBMB Life, 2013, 65(4): 341–349.

[2] Williams RA, Mamotte CDS, Burnett JR. Phenylketonuria: an inborn error of phenylalanine metabolism. Clin Biochem Rev, 2008, 29(1): 31–41.

[3] Przyrembel H, Bremer HJ. Nutrition, physical growth, and bone density in treated phenylketonuria. Eur J Pediatr, 2000, 159(2 Supl): S129–S135.

[4] Chanoine JP. Selenium and thyroid function in infants, children and adolescents. Biofactors, 2003, 19(3/4): 137–143.

[5] Beblo S, Reinhardt H, Demmelmair H, et al. Effect of fish oil supplementation on fatty acid status, coordination, and fine motor skills in children with phenylketonuria. J Pediatr, 2007, 150(5): 479–484.

[6] Colomé C, Artuch R, Vilaseca MA, et al. Ubiquinone-10 content in lymphocytes of phenylketonuric patients. Clin Biochem, 2002, 35(1): 81–84.

[7] Nakata H, Yamauchi T, Fujisawa H. Phenylalanine hydroxylase frompurification and characterization. J Biol Chem, 1979, 254(6): 1829–1833.

[8] Onishi A, Liotta LJ, Benkovic SJ. Cloning and expression ofphenylalanine hydroxylase inand comparison of amino acid sequence with mammalian aromatic amino acid hydroxylases. J Biol Chem, 1991, 266(28): 18454–18459.

[9] Cao SH, Zhou L, Cui WJ, et al. Heterologous expression and characterization of phenylalanine hydroxylase from. Biotechnol Bull, 2014, (8): 152–158 (in Chinese). 曹淑慧, 周麗, 崔文璟, 等. 紫色色桿菌苯丙氨酸羥化酶的異源表達(dá)及重組酶學(xué)性質(zhì)研究. 生物技術(shù)通報(bào), 2014, (8): 152–158.

[10] Yew NS, Dufour E, Przybylska M, et al. Erythrocytes encapsulated with phenylalanine hydroxylase exhibit improved pharmacokinetics and lowered plasma phenylalanine levels in normal mice. Mol Genet Metab, 2013, 109(4): 339–344.

[11] Turner NJ. Directed evolution drives the next generation of biocatalysts. Nat Chem Biol, 2009, 5(8): 56–573.

[12] Reetz MT, Carballeira JD, Vogel A. Iterative saturation mutagenesis on the basis of B factors as a strategy for increasing protein thermostability. Angew Chem Int EdEngl, 2006, 45(46): 7745–7751.

[13] Polizzi KM, Bommarius AS, Broering JM, et al. Stability of biocatalysts. Curr Opin Chem Biol, 2007, 11(2): 220–225.

[14] Martin A, Kather I, Schmid FX. Origins of the high stability of an-selected cold-shock protein. J Mol Biol, 2002, 318(5): 1341–1349.

[15] Bagautdinov B, Yutani K. Structure of indole-3-glycerol phosphate synthase fromHB8: implication for thermal stability. Acta Crystallogr D, 2011, 67(12): 1054–1064.

[16] Chakravarty S, Varadarajan R. Elucidation of factors responsible for enhanced thermal stability of proteins: a structural genomics based study. Biochemistry, 2002, 41(25): 8152–8161.

[17] Delboni LF, Mande SC, Rentier-Delrue F, et al. Crystal structure of recombinant triosephosphate isomerase from: an analysis of potential thermostability factors in 6 isomerases with known 3-dimensional structures points to the importance of hydrophobic interactions. Protein Sci, 1995, 4(12): 2594–2604.

[18] Vogt G, Woell S, Argos P. Protein thermal stability, hydrogen bonds, and ion pairs. J Mol Biol, 1997, 269(4): 631–643.

[19] Ma YF, Eglinton JK, Evans DE, et al. Removal of the four C-terminal glycine-rich repeats enhances the thermostability and substrate binding affinity of barley β-amylase. Biochemistry, 2000, 39(44): 13350–13355.

[20] Mahanta P, Bhardwaj A, Kumar K, et al. Structural insights into N-terminal to C-terminal interactions and implications for thermostability of a (β/α)8-triosephosphate isomerase barrel enzyme. FEBS J, 2015, 282(18): 3543–3555.

[21] Argos P, Rossman MG, Grau UM, et al. Thermal stability and protein structure. Biochemistry, 1979, 18(25): 5698–5703.

[22] Zhang XJ, Baase WA, Matthews BW. Multiple alanine replacements within α-helix 126–134 of T4 lysozyme have independent, additive effects on both structure and stability. Protein Sci, 1992, 1(6): 761–776.

[23] Mrabet NT, Van den Broeck A, Van den Brande I, et al. Arginine residues as stabilizing elements in proteins. Biochemistry, 1992, 31(8): 2239–2253.

[24] Rahman RNZA, Fujiwara S, Nakamura H, et al. Ion pairs involved in maintaining a thermostable structure of glutamate dehydrogenase from a hyperthermophilic archaeon. Biochem Bioph Res Co, 1998, 248(3): 920–926.

[25] Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976, 72(1/2): 248–254.

[26] Martin A, Sieber V, Schmid FX.-selection of highly stabilized protein variants with optimized surface. J Mol Biol, 2001, 309(3): 717–726.

(本文責(zé)編 郝麗芳)

Thermal stability improvement for phenylalanine hydroxylase by site-directed mutagenesis

Shuangshuang Ye, Li Zhou, and Zhemin Zhou

School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

In proteins of thermophilic bacteria, Gly is tend to be replaced by Ala and Lys is tend to be replaced by Arg to adapt the high temperature. In order to improve the thermal stability of phenylalanine hydroxylase (PAH) from, all the Gly on PAH were mutated to Ala and Lys to Arg. Positive mutant enzymes with improved thermal stability were selected, followed by combined mutation and characterization. The results revealed that half-lives of K94R and G221A mutants at 50 °C were 26.2 min and 16.8 min, which were increased by 1.9-times and 0.9-times than the parent enzyme (9.0 min). The residual activity of K94R/G221A mutant was improved to 65.6% after keeping at 50 °C for 1 h, which was 6.6 time higher than the parent enzyme (8.6%). Circular dichroism (CD) spectroscopy revealed thatmvalues of the parent enzyme, K94R, G221A and K94R/G221A were 51.5 ℃, 53.8 ℃, 53.1 ℃ and 54.8 ℃, respectively. According to the protein structure simulation, the two mutations were located on flexible loop. In the K94R mutant, the mutated Arg94 on the surface of the enzyme formed an extra hydrogen bond with Ile95, which stabilized the located loop. In the G221A mutant, the mutated Ala221 formed hydrophobic interaction with Leu281, which could stabilize both the loop and flexible area of the C-terminus of G221A. The results not only provided a reference for protein modification on thermal stability, but also laid the foundation for application of phenylalanine hydroxylase in the field of functional foods.

phenylalanine hydroxylase, thermal stability, site-directed mutagenesis, alanine mutation, arginine mutation

January 12, 2016; Accepted:May 30, 2016

Zhemin Zhou. Tel: +86-510-85325210; E-mail: zhmzhou@jiangnan.edu.cn

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2014AA021304),the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher-Education Institutions, the 111 Project, the Jiangsu Province “Collaborative Innovation Center for Advanced Industrial Fermentation” Industry Development Program (No. 111-2-06),The Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. JUSRP51411B).

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃) (No. 2014AA021304)，江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程自主項(xiàng)目，111引智計(jì)劃 (No. 111-2-06)，江蘇省現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，2014年基本科研-重點(diǎn)項(xiàng)目子項(xiàng)目 (No. JUSRP51411B) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-06-13 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160613.0956.002.html

葉雙雙, 周麗, 周哲敏. 定點(diǎn)突變提高苯丙氨酸羥化酶的熱穩(wěn)定性. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(9): 1243–1254.

Ye SS, Zhou L, Zhou ZM. Thermal stability improvement for phenylalanine hydroxylase by site-directed mutagenesis. Chin J Biotech, 2016, 32(9): 1243–1254.