劉曉慧，方芳，夏小樂，堵國成，陳堅,3,4

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定點突變改造提高紡錘形賴氨酸芽孢桿菌氨基甲酸乙酯水解酶穩(wěn)定性

劉曉慧1,2，方芳1,2，夏小樂1，堵國成2,3,4，陳堅1,3,4

1 江南大學生物工程學院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122 2 食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇無錫 214122 3 江南大學糖化學與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122 4 江南大學糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇無錫 214122

氨基甲酸乙酯 (ethyl carbamate，EC) 是一種存在于發(fā)酵食品和釀造酒精飲料中的潛在致癌物質(zhì)。利用生物酶法去除食品飲料中的EC是一種較為安全有效的方法。本研究以來源于賴氨酸芽孢桿菌SC02的氨基甲酸乙酯水解酶為研究對象，采用計算機輔助設(shè)計突變位點，構(gòu)建了其不穩(wěn)定區(qū)域Q328位點的飽和突變體。通過酶學性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，突變體Q328C和Q328V在40 ℃下的半衰期分別提高了7.46和1.99倍，Q328R在高溫下也有比原酶更好的耐受性。此外，突變體Q328C對乙醇的耐受性和酸耐受性也有所提高。對氨基甲酸乙酯水解酶分子改造的結(jié)果表明，通過改造其不穩(wěn)定區(qū)域Q328位點，可以提高酶的熱穩(wěn)定性及對酸和乙醇的耐受性。

定點突變，氨基甲酸乙酯水解酶，氨基甲酸乙酯，酶穩(wěn)定性

氨基甲酸乙酯 (Ethyl carbamate，EC) 是發(fā)酵食品 (醬油、腐乳、泡菜) 和酒精飲料 (葡萄酒、黃酒、白酒) 在生產(chǎn)、儲藏過程中生成的對人體具有潛在致癌性和遺傳毒性的一種微量有害物質(zhì)[1-3]。2007年，國際癌癥研究機構(gòu) (International Agency for Research on Cancer，IARC) 正式將其致癌級別由2B類提高為2A類[4]。因此，控制食品飲料中EC的含量，對保障食品安全至關(guān) 重要。

目前對食品及飲料中氨基甲酸乙酯的控制策略主要包括：改造發(fā)酵菌株來減少EC前體物質(zhì)的生成[5]、向發(fā)酵食品中添加脲酶[6]、改善傳統(tǒng)發(fā)酵工藝條件[7-8]等。由于EC的生成機制復(fù)雜，性質(zhì)穩(wěn)定一旦生成很難用物理或化學方法去除，目前還沒有可以消除不同發(fā)酵產(chǎn)品中EC的一種有效方法。應(yīng)用生物酶法去除成品中的EC是一種較為安全有效的方法[9-11]。氨基甲酸乙脂水解酶 (Urethanase，UH) 能夠降解EC，生成無害的乙醇、二氧化碳和氨，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價值。

目前對氨基甲酸乙酯水解酶的研究主要集中在新菌株的篩選以及對酶的酶學性質(zhì)研究和應(yīng)用上。Mohapatra等從海綿體中分離得到1株產(chǎn)UH酶的微球菌，其最佳pH值和溫度分別為4.5及37 ℃[9]。Zhao等篩選到1株產(chǎn)UH酶的地衣芽孢桿菌，此酶對黃酒中的EC具有一定降解效果，其最適反應(yīng)pH為4.5，在37 ℃、20%乙醇條件下保存2 h，酶活剩余64%[12]。Zhou等篩選到1株產(chǎn)中性EC酶的變幻青霉菌，能降低黃酒中的EC含量而不影響黃酒的風味[13]。目前對UH的基因序列報道較少，僅有Kambe等從馬紅球菌中得到一段編碼UH的基因，并在大腸桿菌中實現(xiàn)了異源表達[14]。李京京等篩選到1株產(chǎn)UH的賴氨酸芽孢桿菌SC02，并將得到的編碼UH的基因 (ID：KU353448) 在大腸桿菌中實現(xiàn)了異源表達[15]。但此酶為中性酶，在大腸桿菌中表達后酶的穩(wěn)定性較差。定點突變是改善酶分子特性的一個主要方法[16-17]。本研究針對UH酶熱不穩(wěn)定等問題，通過計算機輔助設(shè)計突變位點，以期獲得性質(zhì)改良的突變酶，為促進UH酶在降解發(fā)酵類食品中的EC提供技術(shù)手段，為深入研究UH蛋白的結(jié)構(gòu)與功能提供有利的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

大腸桿菌BL21 (DE3)、含有編碼UH基因的質(zhì)粒pET20b-UH均為本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10；固體培養(yǎng)基加入2.0% (/) 的瓊脂。

TB液體培養(yǎng)基 (g/L)：甘油5，蛋白胨12，酵母粉24，磷酸二氫鉀2.32，三水合磷酸氫二鉀16.43。

1.1.3 主要試劑

DNA分子量標準和磷酸化酶購自寶生物工程(大連) 有限公司；氨芐青霉素、細菌基因提取試劑盒和PCR引物購自生工生物工程(上海) 股份有限公司；DNA膠回收試劑盒購自O(shè)mega 公司；NuPAGE預(yù)制凝膠購自Life Technologies公司；酵母粉、蛋白胨購自O(shè)xoid公司。

1.2 基于計算機輔助方法設(shè)計突變位點

1.2.1 UH蛋白三維結(jié)構(gòu)的同源建模

以PDB數(shù)據(jù)庫中同源性較高的模板分別建模，選取覆蓋率最高、gap較少、綜合評分最高且同源性排第3 (37.58%) 的Glutamyl-tRNA (Gln) amidotransferase subunit A (PDB ID: 2G5H) 為模板，用在線三維結(jié)構(gòu)模擬程序SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/ interactive) 對UH蛋白進行三維結(jié)構(gòu)建模。

1.2.2 B-factors值預(yù)測

本研究采用FlexServ軟件(http://mmb.p cb.ub.es/FlexServ/input.php) 對UH不穩(wěn)定區(qū)域B-factor值進行分析。

1.2.3 分子動力學模擬預(yù)測

本研究使用分子動力學軟件Gromacs (http://www.gromacs.org/) 預(yù)測UH蛋白的RMSD及原子的RMSF值[18]。

1.2.4 預(yù)測蛋白質(zhì)折疊自由能變化

本研究中通過軟件PoPMuSiC-2.1 (http://dezyme.com/) 分析提高蛋白酶熱穩(wěn)定性的潛在突變位點[19]。其中該軟件是基于突變體折疊自由能 (DDG) 的變化值來進行分析的。

1.3 定點突變

本研究中對基因的定點突變采用重組質(zhì)粒pET20b-UH全序列擴增的方法。PCR條件： 95 ℃3 min；95 ℃30 s，55 ℃30 s，68 ℃ 2.5 min，30個循環(huán)；68 ℃5 min。PCR引物序列參見表1。獲得的重組質(zhì)粒送上海生物工程有限公司測序驗證。

表1 突變引物

1.4 重組工程菌培養(yǎng)及UH酶誘導表達

將大腸桿菌重組工程菌接種到LB培養(yǎng)基中，于37 ℃、220 r/min條件下過夜培養(yǎng)。將種子液按3%的接種量轉(zhuǎn)接到TB培養(yǎng)基中，于37 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)至600為0.6，加入ITPG至終濃度為0.1 mmol/L，在25 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)18 h。

1.5 蛋白質(zhì)純化

將重組菌菌液在4 ℃、9 000 r/min下離心15 min收集菌體。用20 mmol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液洗滌菌體2次并重懸菌體，冰浴超聲破碎。將破碎后的菌液于4 ℃、9 000 r/min條件下離心20 min并收集上清液。純化時先用緩沖液A(含250 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑的20 mmol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液) 平衡鎳柱，洗脫用緩沖液B (含250 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑的20 mmol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液) 進行梯度洗脫，收集有酶活的洗脫組分進行脫鹽處理。

1.6 酶活測定

氨基甲酸乙酯水解酶活性的測定方法采用測定產(chǎn)物氨的生成來計算。取1 mL酶液 (對照為超純水) 加入1 mL 3%的EC溶液，于37 ℃恒溫水浴箱中反應(yīng)15 min后，加入1 mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)。反應(yīng)終止后加入1 mL顯色劑I (15 g苯酚和0.625 g亞硝基鐵氰化鈉定容至 250 mL) 和1 mL顯色劑II (13.125 g NaOH和 7.5 mL次氯酸鈉定容至250 mL)，混勻后在37 ℃水浴箱中保溫20 min，反應(yīng)結(jié)束后用超純水定容至10 mL，測定625 nm下的吸光度[20]。酶活定義：常壓、37 ℃、pH 7.0條件下，1 min分解EC產(chǎn)生1 μmol氨所需酶量為1個酶活力單位(U)。

1.7 酶學性質(zhì)測定

1.7.1 最適反應(yīng)溫度的測定

將純化后的野生UH酶及其突變體在不同溫度下 (20?65 ℃，間隔5 ℃) 進行酶促反應(yīng)，測定其最適反應(yīng)溫度。

1.7.2 半衰期1/2的測定

將純化后的野生UH酶及其突變體置于40 ℃下保溫，每隔一定時間取樣測定酶活。由公式lnC=lnC+k，1/2=ln2/k計算出酶的半衰期。其中，C是初始酶活，C是時間為時所對應(yīng)的酶活。

1.7.3 pH對酶活性的影響

將純化后的野生UH酶及其突變體在不同的pH 4.5?7.0條件下進行酶促反應(yīng)，測定不同pH值下的酶活。

1.7.4 乙醇對酶活的影響

將純化后的野生UH酶及其突變體分別在濃度為0%、2%、5%、10%和15%的乙醇條件下反應(yīng)，測定不同乙醇濃度下的酶活。

1.7.5 酶反應(yīng)動力學參數(shù)測定

以5?300 mmol/L氨基甲酸乙酯為底物，分別測定在相應(yīng)濃度條件下酶的反應(yīng)速率。根據(jù)底物濃度與反應(yīng)速度之間的關(guān)系，使用GraphPad Prism軟件計算動力學常數(shù)m與max的值。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于計算機輔助設(shè)計突變位點

為了提高氨基甲酸乙酯水解酶在應(yīng)用條件下的耐受性，以賴氨酸芽孢桿菌SC02來源的UH酶為研究對象，通過蛋白質(zhì)分子同源建模和穩(wěn)定性分析，尋找與酶分子不穩(wěn)定性相關(guān)的結(jié)構(gòu)或區(qū)域。通過FlexServ軟件對UH蛋白每個氨基酸的B-factor值 (或B值) 進行分析可知，序列中Gln328位B-factor響應(yīng)值最高，Gln357的B-factor也較高，說明該部分結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，紊亂度較大 (圖1)。

圖1 組成氨基甲酸乙酯水解酶各氨基酸的B值

采用分子動力學軟件Gromacs對組成UH蛋白中各氨基酸RMSF值進行預(yù)測，結(jié)果表明最不穩(wěn)定的區(qū)域在328位氨基酸附近(圖2)。

圖2 組成氨基甲酸乙酯水解酶各氨基酸的RMSF值

借助Discovery Studio程序?qū)H建模并呈現(xiàn)其3D結(jié)構(gòu) (圖3)。圖中紅色為RMSF值最高的6個氨基酸：Ser325、Asp326、Leu327、Gln328、Lys329、Arg330。其中RMSF最高的點為Gln328，說明這一區(qū)域結(jié)果最不穩(wěn)定，這與B-factor分析結(jié)果一致。

圖3 UH蛋白三維結(jié)構(gòu)圖

通過PoPMuSiC軟件分析可知，328Gln及402Asp的DDG分別為–2.30和–6.56，均為負值。說明這2個區(qū)域為蛋白質(zhì)潛在的不穩(wěn)定區(qū)域。

基于以上結(jié)果，可以得出Q328位點區(qū)域不穩(wěn)定，因此對328位點進行飽和突變。

2.2 UH突變體的異源表達及酶的分離純化

以重組質(zhì)粒pET20b-UH為模板，通過全質(zhì)粒PCR擴增獲得了UH在328位的19個全部突變體。通過測定UH突變體活性，發(fā)現(xiàn)只有Q328C、Q328V、Q328R和Q328H 4個突變株有活性。對這4個有活性的突變體分別進行誘導表達和純化，獲得了較純的UH突變體的純酶 (圖4)。

圖4 UH和其突變體蛋白質(zhì)純化

2.3 突變體與野生酶酶學性質(zhì)的比較

2.3.1 溫度對野生酶和突變體酶活性的影響

由圖4可知，野生酶和突變體的最適反應(yīng)溫度均為30 ℃，但突變體Q328C、Q328R、Q328V在30 ℃以上比野生酶的穩(wěn)定性好。在37 ℃保溫1 h后，Q328C、Q328R、Q328V和UH的殘留酶活分別為76.9%、60.8%、75.8%和51.9%，分別比原酶提高了24.0%、8.9%和23.9%。在40 ℃，上述突變體的殘留酶活分別提高了31.7 %、19.7%和28.9%。突變體Q328V和其他酶相比，具有更寬的溫度穩(wěn)定范圍。

2.3.2 野生酶和突變體半衰期的比較

本研究考察了40 ℃條件下UH及其突變體的半衰期。結(jié)果表明，突變體Q328C、Q328V和Q328R的半衰期都比UH長 (表2)。其中Q328C的半衰期最長，達到27.40 min，是UH的7.46倍。

表2 UH酶及其突變體在40 ℃的半衰期

2.3.3 pH對野生酶和突變體酶活性的影響

由圖5可知，UH突變體Q328C和Q328R在pH 6.0及以下較野生酶的穩(wěn)定性有所提高。其中，Q328R較野生酶在低pH下的相對酶活提高幅度較?。欢鳴328C在酸性條件下酶活的提高幅度較為明顯：在pH 6.0條件下相對酶活提高了11%，在pH 4.5條件下，相對酶活也提高了11%。由此可見，突變體Q328C在酸性條件下較野生酶的穩(wěn)定性有所提高。

圖5 溫度對野生酶和突變酶活性的影響

圖6 pH對野生酶及其突變體酶活性的影響

2.3.4 乙醇對野生酶和突變體酶活性的影響

乙醇對野生酶和突變體酶活性的影響如圖7所示，突變酶Q328C在不同乙醇濃度下耐受性均較UH有所提高，尤其在低乙醇濃度下效果更為明顯。在2%的乙醇條件下，突變酶Q328C的殘留酶活為70.2%，比野生酶提高了25%。在5%乙醇條件下，Q328C的殘留酶活為40.2%，比野生酶提高了13%。其他突變體和野生酶相比，對乙醇的耐受性變化不大。

圖7 乙醇對野生酶及其突變體酶活性的影響

2.3.5 酶反應(yīng)動力學參數(shù)測定

用GraphPad Prism軟件測定野生酶和突變體的動力學常數(shù)m及max值，結(jié)果如表3所示。

表3 野生酶和突變酶的動力學常數(shù)

通過定點突變，突變體Q328V的m值有所降低，說明與底物結(jié)合能力增強。同時，Q328C、Q328R、Q328V最大反應(yīng)速率增大。

3 討論

RMSF值在分子動力學中是評價一個系統(tǒng)靈活性大小的關(guān)鍵參數(shù)，其計算原子在分子動力學軌跡中的遷移率，反映了氨基酸的構(gòu)象穩(wěn)定性情況。B值反映了蛋白質(zhì)分子在晶體中的構(gòu)象狀態(tài)，一般B值越高說明紊亂度越大，相應(yīng)位置的構(gòu)象就越不穩(wěn)定或柔性越強。本研究采用基于計算機輔助設(shè)計定點突變的方法，預(yù)測了組成UH酶的各個氨基酸的B值和RMSF值。動力學模擬表明Q328位點的B值和RMSF值最高，說明該點最不穩(wěn)定。

通過軟件模擬各突變體的RMSF值如圖8所示，各突變體的B值如圖9所示。Q328C、Q328V、Q328R和Q328H的RMSF值分別由原來的0.618變?yōu)?.417、0.582、0.605和0.668；B值分別由原來的1 530變?yōu)? 090、1 480、1 510和1 600。對比各突變體328位點的RMSF值和B值，可見突變體Q328C的RMSF值和B值變低，Q328H的RMSF值和B值升高，Q328V的RMSF值和B值降低幅度較小，Q328R的RMSF值和B值基本不變。說明突變體Q328C的構(gòu)象穩(wěn)定性增強，Q328H的穩(wěn)定性降低，Q328V穩(wěn)定性有較小幅度增強，而Q328R的穩(wěn)定性基本不變，與實驗結(jié)果一致。同時該位點位于loop環(huán)上，該區(qū)域仍有較高的RMSF值和B值。通過動力學分析蛋白分子中各原子的RMSF值和B值對預(yù)測突變位點有較好的指導作用。

圖8 突變體各氨基酸的RMSF值

圖9 突變體各氨基酸的B值

蛋白質(zhì)分子內(nèi)作用力的種類和數(shù)量對酶分子熱穩(wěn)定性和催化活性產(chǎn)生重要影響[21]。本研究通過DS軟件模擬發(fā)現(xiàn)，UH野生酶328Gln與324His和325Ser之間各有一個氫鍵 (Hydrogen bond interaction，圖10A)。將這一位點突變?yōu)镃ys后，增加了2個疏水相互作用力：328Cys-403Leu的苯基作用 (Alkey interaction，圖10B) 和328Cys-324His的磷-苯基相互作用 (Pi-alkey interaction，圖10B)。有報道指出，增強蛋白內(nèi)部的疏水作用有助于蛋白整體穩(wěn)定性的提高[22]，本研究中UH突變體Q328C熱穩(wěn)定的提高與這一結(jié)論一致。

圖10 Q328C的局部立體圖

本文建模時參考的模板為Glutamyl-tRNA (Gln) amidotransferase subunit A (PDB ID：2G5H)，與目的蛋白僅有37.58%的同源性，較低的同源性可能會帶來對所建模型的評價誤差，僅可作為參考。但該模板在所有模板中覆蓋率最高，gap較少，綜合評分最高，因此作為選擇依據(jù)。

本研究首次對編碼氨基甲酸乙酯水解酶的基因序列進行了分子改造，通過定點突變提高了酶的穩(wěn)定性，為深入研究UH酶的蛋白結(jié)構(gòu)與功能提供有利的參考數(shù)據(jù)，為促進UH酶在降解發(fā)酵類食品中的應(yīng)用提供技術(shù)手段。

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(本文責編 陳宏宇)

Stability enhancement of urethanase fromby site-directed mutagenesis

Xiaohui Liu1,2, Fang Fang1,2, Xiaole Xia1, Guocheng Du2,3,4, and Jian Chen1,3,4

1 Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 2 Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 3 Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 4 National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

Ethyl carbamate as a potential carcinogen commonly exists in traditional fermented foods and beverages. Enzymatic removal of ethyl carbamate from fermented foods and beverages is an efficient and safe method. In this study, we mutated urethanase fromSC02 on the Q328 site through computer aided design approaches. The half-life of resulting mutants Q328C and Q328V was detected to be 7.46 and 1.96 folds higher than that of the original enzyme, and Q328R presented better thermal-tolerance than the original urethanase when incubated at high temperature. The tolerance of Q328C to ethanol and acid also increased when compared with that of the original enzyme. The stability and tolerance to acid and ethanol of urethanase could be improved by modification on its Q328 site.

site-directed mutagenesis, urethanase, ethyl carbamate, enzyme stability

December 11, 2015; Accepted: March 2, 2016

Fang Fang. Tel: +86-510-85918307; Fax: +86-510-85918039; E-mail: ffang@jiangnan.edu.cn

Supported by:Major State Basic Research Development Program of China (973 Program) (No. 2012CB720802), National Natural Science Foundation of China (No. 31371821).

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃) (No. 2012CB720802)，國家自然科學基金 (No. 31371821) 資助。

劉曉慧, 方芳, 夏小樂, 等. 定點突變改造提高紡錘形賴氨酸芽孢桿菌氨基甲酸乙酯水解酶穩(wěn)定性. 生物工程學報, 2016, 32(9): 1233–1242.

Liu XH, Fang F, Xia XL, et al. Stability enhancement of urethanase fromby site-directed mutagenesis. Chin J Biotech, 2016, 32(9): 1233–1242.